通竅活血中藥復(fù)方對體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞在缺氧狀態(tài)下細胞活力的影響

秦 偉，楊宇琦，陳一兵，翟 楠，王雪菁，王 煒，劉春蘭，張 月，李 懿，曾東興，劉 丹

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東 中山528400)

通竅活血中藥復(fù)方對體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞在缺氧狀態(tài)下細胞活力的影響

秦 偉，楊宇琦，陳一兵，翟 楠，王雪菁，王 煒，劉春蘭，張 月，李 懿，曾東興，劉 丹

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東 中山528400)

目的 觀察通竅活血中藥復(fù)方對體外缺氧條件下視網(wǎng)膜Müller細胞活力的影響。方法采用SD大鼠制備通竅活血中藥含藥血清和空白血清，以終濃度為0.5 mmol/L的連二亞硫酸鈉作為低缺氧組條件，以終濃度1 mmol/L的連二亞硫酸鈉作為高缺氧組條件，將體外純化培養(yǎng)的大鼠P2代視網(wǎng)膜Müller細胞分為6組，分別置于加入空白血清(正常對照組)、中藥含藥血清(正常中藥干預(yù)組)、空白血清+低連二亞硫酸鈉(低缺氧組)、空白血清+高連二亞硫酸鈉(高缺氧組)、中藥含藥血清+低連二亞硫酸鈉(低缺氧中藥干預(yù)組)、中藥含藥血清+高連二亞硫酸鈉(高缺氧中藥干預(yù)組)的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后比較各組乳酸脫氫酶(LDH)漏出量。結(jié)果低、高缺氧組較正常對照組LDH值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。正常中藥干預(yù)組LDH數(shù)值與正常對照組接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。低、高缺氧中藥干預(yù)組LDH漏出量均較對應(yīng)的缺氧組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論缺氧條件可導(dǎo)致體外純化培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞膜穩(wěn)定性下降，通透性增加，細胞活力降低，通竅活血中藥含藥血清可提高缺氧條件下視網(wǎng)膜Müller細胞活力，這可能是通竅活血中藥復(fù)方對青光眼患者視神經(jīng)保護的藥物作用途徑之一。

通竅活血;Müller細胞;缺氧;乳酸脫氫酶

青光眼是世界第二位致盲性眼病，是一組威脅和損害視神經(jīng)視覺功能的臨床癥候群或眼病，主要與病理性眼壓升高有關(guān)［1，2］。在我國，隨著醫(yī)療知識的普及，青光眼診療水平的不斷提高，青光眼患病率日益升高，給社會、家庭帶來的生活經(jīng)濟負擔難以估計。因此積極探索與研究如何防治青光眼患者視功能損害已成為眼科界研究的一個主要熱點。機械學(xué)說和血流學(xué)說是青光眼視神經(jīng)損害的兩個傳統(tǒng)學(xué)說。其中血流學(xué)說認為:除去高眼壓之外視神經(jīng)的持續(xù)缺血缺氧是導(dǎo)致青光眼患者視神經(jīng)損害的另一重要因素。目前對高眼壓條件下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損害的研究較為廣泛、深入，而對在缺氧條件下視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細胞損害以及其與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損害之間的關(guān)系的研究較少。視網(wǎng)膜Müller細胞是視網(wǎng)膜中一種最主要及最重要的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，自外界膜縱向向內(nèi)伸展，貫穿視網(wǎng)膜全層，包裹并串聯(lián)起視網(wǎng)膜的各類神經(jīng)細胞，對視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞有營養(yǎng)支持作用，同時對維持視網(wǎng)膜穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境將起到至關(guān)重要的作用［3］。故而本實驗旨在研究缺氧條件下通竅活血中藥復(fù)方對視網(wǎng)膜Müller細胞活力的影響，已期開拓青光眼視神經(jīng)保護的新方法新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

1.1.1 實驗動物 大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞體外培養(yǎng)用清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠10只，新生7天，雌雄不限。制備通竅活血中藥復(fù)方含藥血清用:清潔級SD大鼠50只，體質(zhì)量150～180 g，8～12周齡，雌雄各半。兩組動物由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(川實動管質(zhì)第99-11號)。

1.1.2 藥物及試劑 通竅活血中藥復(fù)方(石菖蒲15 g、川芎 10 g、當歸 10 g、丹參 10 g、郁金 10 g、桔梗5 g)由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供;連二亞硫酸鈉(天津濱?？频嫌邢薰?;谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)鑒定 I抗兔多克隆抗體(santa cruz，美國)，II抗生物素化羊克兔抗體(santa cruz，美國);乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑(Bio-Rad，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 中藥含藥血清制備［3～5］50只 SD大鼠按體質(zhì)量分層隨機分組分為通竅活血中藥復(fù)方血清組(中藥含藥血清組)、空白對照組(空白血清組)兩組，每組25只。中藥含藥血清組連續(xù)7天給予通竅活血中藥復(fù)方浸膏，每日灌胃1次，每次10.87 g/kg;空白血清組給予等容量的生理鹽水。末次給藥后1小時，0.1%戊巴比妥1 ml腹膜下注射麻醉，腹主動脈采血于15 ml離心管，4℃冰箱靜置，24小時，離心血清(3000 r/min)，56℃水浴箱，滅活后過濾除菌，分裝于5 ml分裝瓶，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 視網(wǎng)膜Müller細胞原代及傳代培養(yǎng)及鑒定酶消化法體外純化傳代培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞，GS免疫組化染色鑒定，實驗細胞取用P2代細胞。具體方法同前期研究［4～6］

1.2.3 缺氧模型制備 以終濃度為0.5 mmol/L的連二亞硫酸鈉作為低缺氧組條件，以終濃度1 mmol/L的連二亞硫酸鈉作為高缺氧組條件，具體方法同前期研究［5，6］。

1.2.4 實驗分組 將體外純化培養(yǎng)的大鼠P2代視網(wǎng)膜Müller細胞分為6組。正常對照組:DMEM培養(yǎng)基，含20%空白血清;正常中藥干預(yù)組:DMEM培養(yǎng)基，含20%中藥含藥血清;低缺氧組:DMEM培養(yǎng)基，含20%空白血清、終濃度為0.5 mmol/L的連二亞硫酸鈉;低缺氧中藥干預(yù)組:DMEM培養(yǎng)基，含20%中藥血清、終濃度為0.5 mmol/L的連二亞硫酸鈉;高缺氧組:DMEM培養(yǎng)基，含20%空白血清、終濃度為1 mmol/L的連二亞硫酸鈉;高缺氧中藥干預(yù)組:DMEM培養(yǎng)基，含20%中藥血清、終濃度為1 mmol/L的連二亞硫酸鈉。

1.2.5 視網(wǎng)膜Müller細胞LDH漏出量的測定 將密度為2×106/ml的P2代Müller細胞接種于48孔培養(yǎng)板，每孔400 μl;培養(yǎng)24 h，棄用含有血清的培養(yǎng)液，加入無血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，棄用無血清培養(yǎng)液，加入上述分組不同條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)干預(yù)48 h;每孔收集培養(yǎng)基上清液50 μl，并快速加入LDH檢測試劑(參照LDH試劑盒說明書操作)，使用490型酶標儀檢測光密度D(440nm)的變化，計算LDH值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進行。定量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜Müller細胞鑒定結(jié)果純化培養(yǎng)原代視網(wǎng)膜Müller細胞，革蘭氏(GS)染色陽性率大于80%，表現(xiàn)為細胞漿內(nèi)、細胞核見大量棕色陽性反應(yīng)，稍淺的免疫陽性反應(yīng)位于細胞周圍，細胞輪廓表現(xiàn)為蹼形爪以及帶有終足的扁平輪廓，純化的P1代與P2代細胞GS染色陽性率達85%以上。見圖1，圖2。

圖1 SD大鼠原代視網(wǎng)膜Müller細胞培養(yǎng)5 d后倒置顯微鏡像(×100)

圖2 SD大鼠P2代視網(wǎng)膜Müller細胞培養(yǎng)5d后谷氨酰胺合成酶(GS)染色像(×200)

2.2 各組視網(wǎng)膜Müller細胞LDH漏出量比較低、高缺氧組較正常對照組LDH值明顯升高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。正常中藥干預(yù)組LDH數(shù)值與正常對照組接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。低、高缺氧中藥干預(yù)組LDH漏出量均較對應(yīng)的缺氧組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組視網(wǎng)膜Müller細胞LDH漏出量比較 (U/L)

3 討論

早在《龍樹菩薩眼論》、《秘傳眼科龍木論》《太平圣惠方》等祖國醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)醫(yī)集中就有對青光眼的相關(guān)記載，青光眼屬祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中五風(fēng)內(nèi)障(綠風(fēng)、青風(fēng)、黃風(fēng)、烏風(fēng)、黑風(fēng))范疇。青光眼病位在瞳神及目系，多因五志過極，肝郁氣結(jié)，肝失條達，氣血淤滯，脈絡(luò)不暢;或年老體弱，氣血不足，氣虛血瘀，玄府閉塞，目竅失養(yǎng)，神光難以發(fā)越，而致神經(jīng)損害從而引起視力下降、視野缺損的相關(guān)病理表現(xiàn)。故青光眼的基本病機為氣滯血瘀、氣虛血瘀、玄府閉塞;治療法則為益氣活血、通竅明目、開啟玄腑實。本研究選用石菖蒲、當歸、川芎、郁金、丹參、桔梗組方:石菖蒲寧神益志、開竅醒神;當歸補血活血，川芎行氣活血為“血中之氣藥”，郁金涼血活血，行氣開郁，丹參活血祛瘀，除煩安神，幾藥同用補血不滯，行血不破，補中有散，散中有收，佐助石菖蒲共濟通竅活血之功，更佐桔梗寬胸行氣，載藥上行，開竅醒神，直達病位。

Müller細胞是視網(wǎng)膜中最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，它起至自外界膜，縱向伸展，貫穿整個視網(wǎng)膜直至內(nèi)界膜，其胞體位于內(nèi)核層，其突起與各種神經(jīng)元細胞密切接觸，并且參與形成視網(wǎng)膜內(nèi)毛細血管的基底膜。Müller細胞及其突起沿著視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞分布，這種特征性排列就決定了Müller細胞將會更易于調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜神經(jīng)遞質(zhì)在細胞外的分布。Müller細胞除了起到視網(wǎng)膜支架及填充等被動作用外，還在視網(wǎng)膜微環(huán)境的調(diào)節(jié)中起到重要作用，與神經(jīng)元有雙向信號傳遞，并且可以表達各種電壓門控型離子通道。這些都決定了在視網(wǎng)膜各種生理和病理過程中Müller細胞發(fā)揮著重要作用［7］。

細胞膜具有通透性，其通過選擇性的控制物質(zhì)進出細胞膜而控制細胞內(nèi)外的物質(zhì)交換，從而使細胞處于一個相對穩(wěn)定的環(huán)境中。細胞代謝障礙，首要表現(xiàn)就是細胞膜的通透性發(fā)生障礙。乳酸脫氫酶(LDH)是一種活細胞內(nèi)的特異性標志酶，正常狀態(tài)下細胞外漏出量極少，病理狀態(tài)下導(dǎo)致細胞膜通透性發(fā)生障礙，細胞外的LDH漏出量則顯著增多，且細胞受損數(shù)量與LDH累計漏出量呈正相關(guān)［8］?？梢姡±頎顟B(tài)下細胞外LDH漏出量越多，則細胞膜越不穩(wěn)定。因此，LDH細胞外釋放量就可作為一個反映視網(wǎng)膜Müller細胞功能受損情況的敏感指標。本實驗結(jié)果顯示:低缺氧、高缺氧組較正常對照組LDH值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示在缺氧條件下，體外純化培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞受損，細胞膜穩(wěn)定性下降，通透性增加，活性減弱。

同時本實驗結(jié)果顯示，通竅活血中藥復(fù)方含藥血清對正常條件下體外純化培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞的LDH漏出量無明顯影響(P＞0.05)，提示通竅活血中藥復(fù)方含藥血清對正常條件下視網(wǎng)膜Müller細胞的細胞活性無明顯影響;加入中藥干預(yù)缺氧組樣本LDH漏出量較對應(yīng)缺氧組未加中藥干預(yù)樣本的數(shù)值明顯降低(P＜0.05)，提示通竅活血中藥復(fù)方含藥血清能明顯降低缺氧條件下視網(wǎng)膜Müller細胞膜通透性、提高胞膜穩(wěn)定性，從而減輕細胞損害，提高細胞活力。因此，筆者推測，通竅活血中藥復(fù)方能提高青光眼患者視網(wǎng)膜Müller細胞細胞膜的穩(wěn)定性，增強視網(wǎng)膜Müller細胞活力，這可能是通竅活血中藥復(fù)方對青光眼患者視神經(jīng)保護的藥物作用途徑之一。

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Effect of Tongqiao Huoxue Decoction on retinal Müller cells cultured in hypoxic condition

QIN Wei，YANG Yu-qi，CHEN Yi-bing，ZHAI Nan，WANG Xue-jing，WANG Wei，LIU Chun-lan，ZHANG Yue，LI Yi，ZENG Dong-xing，LIU Dan

Q3

B

1672-6170(2017)04-0226-03

2017-02-13;

2017-06-10)

廣東省中醫(yī)藥管理局資助項目(編號:20122046);廣東省中山市科技局資助項目(編號:20122A035)