刺梨凍干粉對(duì)腎纖維化模型大鼠的影響及干預(yù)機(jī)制研究

劉銘潔 詹繼紅 郭銀雪 王琮瑞 胡茂蓉

·實(shí)驗(yàn)研究·

刺梨凍干粉對(duì)腎纖維化模型大鼠的影響及干預(yù)機(jī)制研究

劉銘潔 詹繼紅 郭銀雪 王琮瑞 胡茂蓉

目的通過(guò)觀察刺梨凍干粉對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型大鼠腎纖維化及免疫炎癥因子的影響，探討刺梨凍干粉延緩腎纖維化的干預(yù)機(jī)制。方法將SD雄性大鼠分為4組：假手術(shù)組、UUO模型組、氯沙坦鉀組和刺梨凍干粉組，前兩組均予以蒸餾水，氯沙坦鉀、刺梨凍干粉組分別給予氯沙坦鉀片（1 mg／100 g）及刺梨凍干粉（300 mg／100 g）灌胃治療，首次給藥后14 d處死大鼠，采集標(biāo)本，觀察各組大鼠腎組織病理改變，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)α平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha smooth muscle actinα－SMA）、Ⅲ型膠原（collagenⅢ，Col－Ⅲ）及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)腎臟組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）、核轉(zhuǎn)錄因子－κB p65（NF－κB p65）、Toll樣受體2（Toll－like receptor，TLR2）蛋白的表達(dá)。結(jié)果光鏡下，假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)基本正常，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)無(wú)或少許膠原纖維；模型組腎組織結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)可見(jiàn)明顯的膠原纖維沉積，氯沙坦鉀、刺梨凍干粉組與模型組比較病理改變明顯減輕。假手術(shù)組大鼠腎組織中僅少量α－SMA、Col－Ⅲ、TGF－β1、NF－κB p65及TLR2蛋白表達(dá)，模型組中上述蛋白表達(dá)顯著升高；與模型組比較，刺梨凍干粉組、氯沙坦鉀組大鼠腎組織中α－SMA、Col－Ⅲ、TGF－β1、NF－κB p65、TLR2蛋白顯著降低（P＜0．01）；刺梨凍干粉組腎組織中TLR2、NF－κB p65蛋白較氯沙坦鉀組表達(dá)顯著降低（P＜0．05），α－SMA、Col－Ⅲ、TGF－β1蛋白表達(dá)二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。刺梨凍干粉能夠明顯減輕UUO大鼠腎功能的損害及輸尿管梗阻導(dǎo)致的腎纖維化。結(jié)論刺梨凍干粉對(duì)UUO模型大鼠腎組織局部的免疫微環(huán)境有調(diào)節(jié)作用，能改善腎纖維化。

刺梨凍干粉；腎纖維化；單側(cè)輸尿管梗阻模型；免疫微環(huán)境

腎纖維化是慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）的病理基礎(chǔ)，主要包括腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）。研究表明，RIF在促進(jìn)腎功能惡化中起著主要作用［1］。隨著人們對(duì)RIF認(rèn)識(shí)的不斷加深，很多學(xué)者認(rèn)為各種腎臟病導(dǎo)致RIF的形成過(guò)程中存在“共同通路”，涉及一系列相互關(guān)聯(lián)的過(guò)程，腎臟天然免疫研究為這一學(xué)說(shuō)提供了新的證據(jù)。

刺梨是藥食兩用的水果，具有多種生物活性物質(zhì)，藥理學(xué)研究相對(duì)比較成熟，被運(yùn)用于多種疾病研究領(lǐng)域且療效肯定。因此，以單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型大鼠為研究對(duì)象，以α平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha smooth muscle actin，α－SMA）、Ⅲ型膠原（collagenⅢ，Col－Ⅲ）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）、核轉(zhuǎn)錄因子－κB p65（NF－κB p65）、Toll樣受體2（Toll－like receptor，TLR2）為觀察指標(biāo)，探討刺梨凍干粉改善腎纖維化的作用機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑及儀器

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠32只，體質(zhì)量140～160 g，由上海西普爾一必凱實(shí)驗(yàn)有限公司提供，合格證號(hào)為 DA942C48－72F76A1E－466ABC83－FC6974；并飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于溫度25℃、12 h光照、45%～55%濕度的環(huán)境中，自由飲水，普通飼料進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后行模型制備。

2．藥物制備 刺梨凍干粉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)金刺梨（貴州）科技開(kāi)發(fā)有限公司，氯沙坦鉀片購(gòu)自默沙東制藥有限公司（批號(hào)：L037309）。

3．主要試劑及儀器 α－SMA試劑盒（ab124964，Abcam公司）、Col－Ⅲ試劑盒（ab6310，Abcam公司）、TGF－β1試劑盒（ab92486，Abcam公司）、NF－κB p65試劑盒（cst8242，CST公司）、TLR2試劑盒（sc－10739，Santa Cruz公司）、GAPDH試劑（sc－47778，Santa Cruz公司）、PVDF Transfer Membrane（Millipore）、電泳儀（PowerPacTMHC＃1645052，美國(guó)Bio－RAD公司）、熒光顯微鏡＋數(shù)碼成像系統(tǒng)（801，日本尼康公司）。病理標(biāo)本制備及染色均由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎病研究所協(xié)助完成。

二、方法

1．動(dòng)物模型的制備及分組 按文獻(xiàn)［3］方法建立UUO模型，假手術(shù)組僅暴露腎臟后縫合。32只大鼠從中隨機(jī)選取8只作為假手術(shù)組，其余24只制作UUO模型。術(shù)后第2天，隨機(jī)分組將UUO模型大鼠分為模型組、氯沙坦鉀組、刺梨凍干粉組，每組8只。

2．干預(yù)治療及標(biāo)本 干預(yù)劑量均參照Bios氏原法設(shè)定，氯沙坦鉀組給予氯沙坦鉀片灌胃，劑量為1 mg／100 g；刺梨凍干粉組給予劑量為300 mg／100 g，假手術(shù)組、模型組均給予生理鹽水，以上4組均以1 ml／100 g灌胃。在給藥過(guò)程中，刺梨凍粉組因灌胃手法問(wèn)題，死亡1只。首次給藥后14 d，收集24 h總尿液量，并取5 ml進(jìn)行檢測(cè)。戊巴比妥鈉麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，摘取左側(cè)腎臟，置于冰盒上，用0．9%的生理鹽水洗凈，留取腎門處腎臟橫斷面組織于多聚甲醛中固定，為觀察病理學(xué)改變制備石蠟包埋，剩余腎組織迅速置于液氮中備用。

3．腎功能評(píng)估 血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白定量使用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)。

4．腎組織病理 腎組織標(biāo)本行蘇木精－伊紅（Hematoxylin Eosin，HE）和馬松（Masson）染色以觀察腎組織病理改變。Masson染色半定量分析，隨機(jī)選取8個(gè)互不重疊高倍視野（×400），應(yīng)用圖像分析軟件Image Pro Plus 6．0計(jì)算腎間質(zhì)藍(lán)色著色占全片范圍，以反映腎組織的纖維化程度。

三、免疫組織化學(xué)方法測(cè)定α－SMA、Coll－Ⅲ蛋白的表達(dá)

采用Envision System二步法。將玻片烘箱中烘烤，脫蠟至水化，置于磷酸鹽緩沖液（PBS）中浸泡，放于水浴中進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫，經(jīng)PBS浸泡后，將玻片放在濕盒內(nèi)，置甲醇溶液中，反復(fù)于PBS中浸泡。吸玻片上過(guò)多的水分，加上血清孵育30 min，擦去過(guò)多的血清，加入一抗室溫孵育過(guò)夜，PBS洗3次后，擦去水分，加二抗孵育，PBS洗3次，3，3－二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色（鏡檢出現(xiàn)黃色即可終止實(shí)驗(yàn)），將水沖洗，蘇木素染核，水沖洗復(fù)染后，用鹽酸酒精分化，脫水、封片。隨機(jī)選取8個(gè)互不重疊高倍視野（×400），應(yīng)用圖像分析軟件Image Pro Plus 6．0計(jì)算棕黃色膠原纖維著色占全片范圍，以反映α－SMA、Coll－Ⅲ蛋白的表達(dá)。

四、蛋白免疫印跡法（Western blot）測(cè)定TGF－β1、NF－κB p65、TLR2蛋白的表達(dá)

腎臟組織加細(xì)胞裂解液勻漿破碎，將裂解物移至新的離心管中，取樣加入SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）混勻經(jīng)相關(guān)處理后離心去除不溶性沉淀，再次取樣使用SDS－PAGE分離，樣品行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗，4℃封閉過(guò)夜，加入二抗，室溫下?lián)u床上孵育1 h；顯影。用圖像分析軟件Gel－Pro Analyzer測(cè)定各組蛋白的相對(duì)吸光度值（A值）和以目的條帶及內(nèi)參GAPDH條帶的灰度比值，分別表示各蛋白的表達(dá)水平。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS18．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、光鏡觀察

1．HE染色 假手術(shù)組腎組織中腎小球形態(tài)飽滿，系膜細(xì)胞無(wú)明顯增生或硬化，毛細(xì)血管管腔規(guī)則，充盈，血管壁完整無(wú)破損，基質(zhì)膜無(wú)增生、腎小管管腔完整，間質(zhì)中未見(jiàn)異常細(xì)胞。UUO模型大鼠腎小球明顯腫大、增生、肥大、排列不規(guī)則，系膜細(xì)胞變大變厚，局部粘連和硬化，基質(zhì)膜增寬明顯，腎小管管腔不完整，相鄰之間有空泡或脫顆粒，有較多的蛋白管型、紅細(xì)胞管型，大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)腎間質(zhì)；其中模型組表現(xiàn)最為突出，刺梨凍干粉組和氯沙坦組上述表現(xiàn)相對(duì)較輕。（圖1）

圖1 各組大鼠腎組織HE染色顯示情況（×200）

2．Masson染色 假手術(shù)組腎組織中腎小球形態(tài)飽滿，系膜細(xì)胞無(wú)明顯增生或硬化，毛細(xì)血管管腔規(guī)則，充盈，血管壁完整無(wú)破損，基質(zhì)膜無(wú)增生、腎小管管腔完整，間質(zhì)中未見(jiàn)異常細(xì)胞。UUO模型大鼠腎小球腎球囊周圍纖維化，基質(zhì)膜增寬明顯，部分腎小球發(fā)生玻璃樣變和纖維化。（圖2）

圖2 各組大鼠腎組織Masson染色顯示情況（×400）

二、各組大鼠腎功能指標(biāo)的比較

與假手術(shù)組比較，UUO模型大鼠中SCr、BUN及24 h尿蛋白定量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；與模型組比較，刺梨凍干粉組、氯沙坦鉀組上述各指標(biāo)明顯降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），刺梨凍干粉組與氯沙坦鉀組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。（表1）

表1 各組大鼠SCr、BUN、24 h尿蛋白定量的比較（±s）

表1 各組大鼠SCr、BUN、24 h尿蛋白定量的比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0．01；與模型組比較，bP＜0．01；與氯沙坦鉀組比較，cP＞0．05

組別 例數(shù) SCr（μmol／L）BUN（mmol／L）24 h尿蛋白定量（mg）假手術(shù)組 8 45．30±4．76 6．46±0．52 3．91±0．37模型組 8 165．50±21．77a15．09±1．25a10．50±1．92a氯沙坦鉀組 8 133．92±12．79ab13．01±1．12ab8．24±0．53ab刺梨凍干粉組 7 132．67±12．60abc12．80±1．29abc8．20±0．50abc

三、各組大鼠腎組織中α－SMA、Coll－Ⅲ蛋白表達(dá)比較

光鏡下觀察，假手術(shù)組腎組織間質(zhì)分別有少許α－SMA、Coll－Ⅲ的棕黃色膠原纖維染色，手術(shù)組間質(zhì)內(nèi)能夠見(jiàn)到明顯的膠原纖維，部分呈現(xiàn)條索狀，模型組纖維化面積增高更為明顯，刺梨凍干粉組、氯沙坦鉀組纖維化面積顯著輕于模型組，經(jīng)半定量分析可見(jiàn)，刺梨凍干粉組與氯沙坦鉀比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。（表2、圖3）。

表2 各組大鼠腎組織α－SMA、Coll－Ⅲ平均吸光度比較（±s）

表2 各組大鼠腎組織α－SMA、Coll－Ⅲ平均吸光度比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0．01；與模型組比較，bP＜0．01；與氯沙坦鉀組比較，cP＞0．05

組別 例數(shù) α－SMA Coll－Ⅲ假手術(shù)組 8 0．04±0．01 0．152±0．014模型組 8 0．24±0．01a 0．319±0．037a氯沙坦鉀組 8 0．22±0．01ab 0．220±0．009ab刺梨凍干粉組 7 0．23±0．01abc 0．221±0．007abc

圖3 各組大鼠腎組織中α－SMA、Coll－Ⅲ平均吸光度

四、各組大鼠腎組織中TGF－β1、NF－κB p65、TLR2蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，UUO模型大鼠TGF－β1、NF－κB p65、TLR2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著明顯升高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；模型組與刺梨凍干粉組、氯沙坦鉀組比較，上述指標(biāo)蛋白表達(dá)幅度明顯增高（P＜0．01）；刺梨凍干粉組與氯沙坦鉀組比較，在降低TGF－β1蛋白表達(dá)水平上，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；刺梨凍干粉組在降低NF－κB p65、TLR2蛋白表達(dá)水平上優(yōu)于氯沙坦鉀，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。（表3、圖4）。

表3 各組大鼠腎組織中TGF－β1、NF－κB p65、TLR2蛋白表達(dá)值（±s）

表3 各組大鼠腎組織中TGF－β1、NF－κB p65、TLR2蛋白表達(dá)值（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0．01；與模型組比較，bP＜0．01；與氯沙坦鉀組比較，cP＞0．05，dP＜0．05

組別 例數(shù) TGF－β1 NF－κB p65 TLR2假手術(shù)組 3 1．00±0．11 1．00±0．15 1．00±0．17模型組 3 1．97±0．15a12．52±0．87a 2．08±0．14a氯沙坦鉀組 3 1．63±0．11ab11．65±0．56ab 1．77±0．12ab刺梨凍干粉組 3 1．62±0．12abc9．50±0．46abd1．60±0．14abd

討 論

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）已成為全球性疾病之一，部分CKD持續(xù)惡化，成為終末期腎臟疾病（end stage renal disease，ESRD）［4］。ESRD的治療主要包括透析和腎移植，其療效肯定，但發(fā)病率高、并發(fā)癥多、且花費(fèi)大，嚴(yán)重影響人們的身心健康，因此防治CKD進(jìn)展顯得尤為重要。RIF是多種CKD發(fā)展至ESRD的最后主要通路和主要病理基礎(chǔ)，也是防治CKD的主要切入點(diǎn)之一。

RIF具體發(fā)病機(jī)制仍不十分明了，但多數(shù)專家認(rèn)為是一種以免疫反應(yīng)為驅(qū)動(dòng)，在多種免疫細(xì)胞及腎固有細(xì)胞的參與下，通過(guò)自身分泌和促進(jìn)炎性細(xì)胞因子化的病理過(guò)程。在疾病的起始階段，病原體入侵活化免疫效應(yīng)細(xì)胞，啟動(dòng)天然免疫，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生并分泌炎性因子和促進(jìn)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，直接或間接引起組織損傷；同時(shí)，在多種內(nèi)外刺激因素下，腎小管及腎間質(zhì)發(fā)生增殖，活化以及表型轉(zhuǎn)化，引起過(guò)多細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，直接參與免疫炎癥反應(yīng)和纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，最終導(dǎo)致腎組織結(jié)構(gòu)、功能的改變。臨床可見(jiàn)血尿、蛋白尿、腎小球?yàn)V過(guò)率降低等表現(xiàn)。

先天免疫系統(tǒng)作為首道防線，是組織微環(huán)境中抵御病原體的關(guān)鍵組成部分［5］，它們通過(guò)自身的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別潛在病原體，對(duì)致病原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。PRRs主要包括Toll樣受體家族（Toll－like receptors，TLRs）、蛋白激酶R（ativated protein kinase R，PKR）等其他家族受體。其中，TLRs是識(shí)別病原微生物中最具有代表性的一類PRRs，隨著TLRs的分子結(jié)構(gòu)、識(shí)別方式、信號(hào)傳導(dǎo)等多方面的研究深入，發(fā)現(xiàn)TLRs及其信號(hào)通路在纖維化增生性疾病的發(fā)生、發(fā)展中有著直接聯(lián)系［6］。

由此可見(jiàn)，天然免疫系統(tǒng)中TLRs與間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。在組織微環(huán)境中，根據(jù)TLRs呈遞細(xì)胞表面Ⅰ型或Ⅱ型MHC分子的抗原不同，T淋巴細(xì)胞識(shí)別的抗原不同，決定了Th1、Th2和Treg細(xì)胞因子極化方向，而極化方向是決定組織纖維化和組織重構(gòu)的關(guān)鍵因素［7］。在進(jìn)行性腎纖維化中，TLR家族通過(guò)識(shí)別病原體的相關(guān)分子結(jié)構(gòu)，如外源性配基脂多糖、脂蛋白、肽聚糖，或壞死小管細(xì)胞產(chǎn)生熱休克蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)分子等作為內(nèi)源性配基提供給TLR2和TLR4，使得對(duì)TLR活化產(chǎn)生應(yīng)答的腎固有細(xì)胞和免疫細(xì)胞進(jìn)一步被細(xì)胞外基質(zhì)激活并促進(jìn)炎性反應(yīng)細(xì)胞因子和趨化因子分泌，通過(guò)參與依賴MyD88和非依賴MyD88信號(hào)通路促進(jìn)并共同刺激分子的表達(dá)，參與免疫應(yīng)答介導(dǎo)腎組織損傷。當(dāng)TLR2和TLR4的信號(hào)持續(xù)存在，或細(xì)胞外基質(zhì)降解失衡及壞死細(xì)胞未被清除，則可造成持久間質(zhì)炎性反應(yīng)及纖維化［8］。

TLR2是TLRs家族中的一員，是內(nèi)源性配基的主要受體之一。TLR2主要是通過(guò)激活MyD88通路，通過(guò)活化p38 MAPK／TRAF6信號(hào)，最終活化NF－κB核因子，參與纖維化炎癥的形成。在TLR2介導(dǎo)的MyD88非依賴通路中，TLR2可降低自噬活性，促進(jìn)纖維化轉(zhuǎn)歸；同時(shí)，可活化MAPK／ERK1／2通路活化Th2型免疫反應(yīng)，促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)促進(jìn)纖維化轉(zhuǎn)歸。TLR2參與了NF－κB和MAPK的活化，刺激產(chǎn)生強(qiáng)烈的促Th2免疫炎癥反應(yīng)，活化氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加促纖維化因子的生成，抑制抗纖維化因子的表達(dá)，最終導(dǎo)致組織纖維化發(fā)生［910］。近年來(lái)，有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明NF－κB是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的核心因子［2］。既然TLR2可激活NF－κB，所以推測(cè)TLR2在RIF中可能發(fā)揮了重要作用。

NF－κB p65是組成Rel蛋白家族，存在于大多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)漿中。在靜止細(xì)胞內(nèi)，NF－κB p65以無(wú)活性形式存在于胞質(zhì)中，細(xì)胞受外界刺激時(shí)，細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor KappaB，IκB）激酶被激活，使NF－κB p65從胞質(zhì)中釋放入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活活性，啟動(dòng)眾多細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，在梗阻性腎病動(dòng)物模型中，NF－κB p65的出現(xiàn)早于單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，而在后期巨噬細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞參與腎間質(zhì)纖維化［11］。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NF－κB p65可被纖維連接蛋白呈劑量依賴性的活化，且可影響成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特征并表達(dá)α－SMA，產(chǎn)生大量Ⅰ、Ⅲ型膠原，引起細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積。大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，Coll－Ⅲ是腎間質(zhì)纖維化的重要細(xì)胞外基質(zhì)的成分［1213］。實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)固有成纖維細(xì)胞一旦激活，多數(shù)情況下就能引起成纖維細(xì)胞的增殖，而α－SMA也是成纖維細(xì)胞活化后的重要標(biāo)志物之一，因此α－SMA、Coll－Ⅲ成為觀察腎臟纖維化的主要標(biāo)志物之一［14］。

TGF－β1是公認(rèn)的最重要的致纖維化因子。生理情況下，腎臟中大部分TGF－β1與隱性相關(guān)肽（latency－associated peptide，LAP）非共價(jià)結(jié)合，形成無(wú)活性前體復(fù)合物。病理情況下，TGF－β1活化，可通過(guò)自分泌方式和旁分泌方式作用于間質(zhì)的成纖維細(xì)胞，促使大量細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，從而抑制基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生及增加蛋白酶抑制劑的生成；同時(shí)，有研究表明［15］，TGF－β1是腎小管上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化中主要誘導(dǎo)因子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，加速纖維化的進(jìn)程。

通過(guò)本研究，進(jìn)一步證實(shí)腎纖維化是一個(gè)極為復(fù)雜的病理生理過(guò)程；免疫炎癥反應(yīng)在起始、維持和腎纖維化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［16］。先天免疫系統(tǒng)是人體對(duì)內(nèi)外致病原產(chǎn)生免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的第一道防線。TLRs在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。在組織微環(huán)境中，根據(jù)TLRs呈遞細(xì)胞表面Ⅰ型或Ⅱ型MHC分子的抗原不同，T淋巴細(xì)胞識(shí)別的抗原不同，決定了Th1、Th2和Treg細(xì)胞因子極化方向，而極化方向是決定組織纖維化和組織重構(gòu)的關(guān)鍵因素。刺梨具有多種生物活性物質(zhì)，并被運(yùn)用于心血管、腫瘤等疾病研究領(lǐng)域，取得了調(diào)節(jié)免疫、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗衰老、抗腫瘤等療效。據(jù)我們前期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，其具有延緩腎功能進(jìn)展，降低血清中TNF－α、TGF－β1的作用。本研究選用保存刺梨生物活性成分（維生素、SOD、刺梨多糖、刺梨黃酮等）穩(wěn)定性最佳的刺梨凍干粉作為治療藥物，對(duì)照采用血管緊張素受體拮抗劑氯沙坦鉀片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①氯沙坦鉀、刺梨凍干粉組病理改變較模型組明顯減輕。②假手術(shù)組24 h尿蛋白定量、BUN、SCr無(wú)明顯變化，模型組的上述指標(biāo)明顯升高；與模型組比較，刺梨凍干粉組、氯沙坦鉀組24 h尿蛋白定量、BUN、SCr的值明顯降低；氯沙坦鉀與刺梨凍干粉比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③假手術(shù)組大鼠腎組織中α－SMA、Col－Ⅲ蛋白及TGF－β1蛋白表達(dá)量少，模型組上述指標(biāo)明顯升高；與模型組比較，刺梨凍干粉組、氯沙坦鉀組大鼠腎組織中α－SMA、Col－Ⅲ、TGF－β1蛋白表達(dá)水平明顯降低；氯沙坦鉀與刺梨凍干粉比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④假手術(shù)組大鼠腎組織中少許NF－κB p65、TLR2蛋白的表達(dá)，模型組腎組織中上述蛋白表達(dá)明顯升高，與模型組比較，刺梨凍干粉組、氯沙坦鉀組大鼠腎組織中NF－κB p65、TLR2蛋白表達(dá)水平明顯降低；刺梨凍干粉在降低TLR2、NF－κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平上優(yōu)于氯沙坦鉀，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說(shuō)明，刺梨凍干粉可以通過(guò)降低免疫炎性指標(biāo)的表達(dá)及抑制TLR2－NF－κB信號(hào)通路，調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，調(diào)節(jié)極化方向，從而減輕腎纖維化。

本研究發(fā)現(xiàn)，刺梨凍干粉可改善UUO模型大鼠的病理組織，改善纖維化指標(biāo)，調(diào)節(jié)免疫炎性指標(biāo)的作用。同時(shí)，刺梨長(zhǎng)期服用安全放心，無(wú)不良反應(yīng)，為臨床治療慢性腎臟病提供一定的理論依據(jù)。

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Effect of Cili freeze－dried powder on renal fibrosis model in rats and intervention mechanism

LIU Ming－jie＊，ZHAN Ji－h(huán)ong，GUO Yin－xue，WANG Zong－rui，HU Mao－rong．＊Guiyang College of Traditional Chinese，Guiyang550002，China

ZHAN Ji－h(huán)ong，E－mail：zhanjihong59＠163．com

ObjectiveTo observe the effects of Cili freeze－dried powder on renal fibrosis and inflammatory factors in unilateral ureteral obstruction（UUO）model rats，and explore the intervention mechanism of Cili freeze－dried powder delaying the process of renal fibrosis．MethodsThe SD male rats were divided into four groups：sham operated group，model group，losartan potassium group，Cili freeze－dried powder group．The former two groups were given normal distilled water，and losartan potassium group and Cili freeze－dried powder group were treated with losartan potassium（1 mg／100 g）and Cili freeze－dried powder（300 mg／100 g）respectively．Model rats were sacrificed at 14th day after first administration．The specimens were collected，and the pathological changes of renal tissue were observed．Immunohistochemical method was used to detect alpha－smooth muscle actin（α－SMA），collagen typeⅢ（Col－Ⅲ），and Western blot was used to detect protein expression level of TGF－β1，NF－κB p65 and TLR2．ResultsUnder light microscope，the renal tissue structure in the sham operated group was basically normal and there was no infiltration of inflammatory cells in the stroma，without Collagennous fiber or a little Collagennous fiber changes．The renal tissue structure in the model groupwas disordered，and a large number of inflammatory cell infiltration and obvious interstitial collagen deposits were seen in the interstitium of the kidney．As compared with model group，pathological changes were significantly alleviated in losartan potassium group and Cili freeze－dried powder group，and only a small amount of expression ofα－SMA，Col－Ⅲ，TGF－β1，NF－κB p65 and TLR2 was detected in renal tissue in sham operated group．In the model group，the expression of these proteins increased significantly．As compared with the model group，α－SMA，Col－Ⅲ，TGF－β1，NF－κB p65 and TLR2 proteins were significantly down－regulated in the losartan potassium group and the Cili freezedried powder group（P＜0．01）．As compared with the Losartan potassium group，the expression of TLR2 and NF－κB p65 proteins was significantly reduced in the Cili freeze－dried powder group（P＜0．05），and there was no statistically significant difference in the expression ofα－SMA，Col－Ⅲand TGF－β1（P＞0．05）．ConclusionsThe Cili freeze－dried powder on immune renal tissue in the rat UUO model can modulate the local microenvironment，and can improve the renal fibrosis．

Cili freeze－dried powder；Renal fibrosis；UUO model；Immune microenvironment

2017－05－20

2017－06－18）

10．3969／j．issn．1671－2390．2017．06．010

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（No．H2708）

550002 貴陽(yáng)，貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院（劉銘潔）；550001 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（詹繼紅，郭銀雪，王琮瑞，胡茂蓉）

詹繼紅，E－mail：zhanjihong59＠163．com