Bax、Bcl-2和Caspase-3在食管癌的表達(dá)及臨床意義

馬永臻

(山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，山東 臨沂 276000)

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Bax、Bcl-2和Caspase-3在食管癌的表達(dá)及臨床意義

馬永臻

(山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 臨沂 276000)

目的 研究凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3在食管癌的表達(dá)變化，分析其與食管癌發(fā)生的相關(guān)性。方法 TUNEL染色檢測(cè)食管癌細(xì)胞凋亡情況，免疫組化方法檢測(cè)Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白在食管癌表達(dá)的變化，分析其與食管癌臨床病理特征之間的關(guān)系，分析其與食管癌發(fā)展與預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果 食管癌組織的凋亡指數(shù)明顯低于正常組織和癌旁組織的凋亡指數(shù)(P<0.01)。Bcl-2蛋白在癌組織的表達(dá)明顯高于正常組織和癌旁組織(P<0.01)，而Bax和Caspase-3蛋白在癌組織的表達(dá)明顯低于正常組織和癌旁組織(P<0.01)。Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)與食管癌的分化程度以及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；Caspase-3蛋白的表達(dá)與外膜浸潤(rùn)和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 Bax、Bcl-2和Caspase-3與食管癌的發(fā)生密切相關(guān)，可作為食管癌發(fā)展和預(yù)后判斷的指標(biāo)。

食管癌；細(xì)胞凋亡；Bax；Bcl-2；Caspase-3

從分子水平探討食管癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制成為食管癌研究的熱點(diǎn)之一，食管癌的早期診斷和治療是降低死亡率的關(guān)鍵〔1〕。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系，目前對(duì)于食管癌發(fā)生機(jī)制的研究較多，但對(duì)凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2和Caspase-3的研究尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)食管癌組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)，分析其與食管癌臨床病理特征之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2014年8月在山東醫(yī)科高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院行食管癌手術(shù)的患者標(biāo)本47例，男32例，女15例，年齡42～78(平均64)歲。每例標(biāo)本均從三個(gè)部位取材，取材標(biāo)準(zhǔn)：①正常食管組織：選取距癌灶6 cm以上的食管黏膜；②癌旁組織：選取距癌灶3 cm以內(nèi)的不典型增生黏膜組織；③癌組織：選取癌灶內(nèi)無壞死組織。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診，癌組織均為鱗癌，高分化14例，中分化22例，低分化11例。病例臨床資料完整，術(shù)前均未進(jìn)行化療和放療。所有標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.2 試劑 兔抗人Bax、Bcl-2和Caspase-3單克隆抗體和陽性對(duì)照片由美國(guó)Santa Cruz公司提供，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG、山羊封閉血清、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑和PBS購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司。原位凋亡檢測(cè)試劑盒(TUNEL法)購(gòu)自武漢博士德公司。

1.3 方法

1.3.1 蘇木素-伊紅(HE)染色 組織切片均行常規(guī)HE染色，以進(jìn)行病理分型，證實(shí)癌旁組織和正常組織中無癌細(xì)胞。

1.3.2 TUNEL染色 隨機(jī)選擇10例標(biāo)本的不同部位的組織切片進(jìn)行TUNEL染色。切片脫蠟入水，滴加新鮮配制的3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，蛋白酶K消化，滴加標(biāo)記反應(yīng)液，封閉液，滴加生物素化地高辛抗體，DAB顯色。脫水，透明，封片。觀察各組織細(xì)胞凋亡情況，胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。每片在上、下、左、右、中部位隨機(jī)觀察500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)，取平均值。重復(fù)計(jì)數(shù)3次。凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.3 免疫組化染色 石蠟切片60℃溫箱烤片過夜，梯度酒精脫蠟至水；3%H2O2封閉；0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液煮沸修復(fù)抗原；5%BSA封閉液37℃封閉20 min；分別滴加Bcl-2、Bax和Caspase-3單抗(工作液1∶200稀釋)；PBS代替一抗作陰性對(duì)照，公司提供的陽性對(duì)照片為陽性對(duì)照。4℃冰箱孵育過夜；滴加二抗，DAB顯色，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察，分別比較Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白陽性著色的位置和強(qiáng)度。

1.3.4 陽性染色判斷標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。每一張切片在高倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)，以陽性細(xì)胞>10%為陽性表達(dá)；≤10%為陰性表達(dá)。

1.3.5 圖像分析 用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)測(cè)量Bax、Bcl-2和Caspase-3陽性表達(dá)細(xì)胞的吸光度(A)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞凋亡結(jié)果 TUNEL染色結(jié)果可見，食管癌組織的凋亡指數(shù)〔(4.26±1.03)〕明顯低于正常組織〔(8.95±1.86)，P<0.01〕，而癌旁組織的凋亡指數(shù)〔(8.06.95±1.69)〕與正常組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 免疫組化染色切片觀察 Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，在食管正常組織、癌旁組織和癌組織都有表達(dá)。Bcl-2蛋白在癌組織的表達(dá)明顯高于正常組織和癌旁組織(P<0.01)，而Bax和Caspase-3蛋白在癌組織的表達(dá)明顯低于正常組織和癌旁組織(P<0.01)，三種蛋白在正常組織和癌旁組織的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 凋亡相關(guān)蛋白陽性率與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系 Bcl-2蛋白的表達(dá)與食管癌的分化程度和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)系，中、低分化鱗癌Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯高于高分化鱗癌(P<0.05)，有淋巴轉(zhuǎn)移的鱗癌Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。Bax蛋白在中分化鱗癌的表達(dá)明顯高于高、低分化鱗癌(P<0.05)，有淋巴轉(zhuǎn)移的鱗癌Bax陽性率明顯低于無淋巴轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)均與患者的年齡、性別、外膜浸潤(rùn)及臨床分期無關(guān)(P>0.05)。Caspase-3蛋白的表達(dá)與有無外膜浸潤(rùn)和有無淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，與其他指標(biāo)無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表1 食管不同部位組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的平均灰度值

表2 Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

惡性腫瘤的病因目前尚未完全了解，一般認(rèn)為腫瘤是環(huán)境因素與自身因素相互作用的結(jié)果，引起細(xì)胞癌變的因素很多，比如細(xì)胞過度增生、細(xì)胞周期功能紊亂、逃逸凋亡及血管增生等〔2〕。細(xì)胞凋亡是機(jī)體在內(nèi)、外環(huán)境刺激下啟動(dòng)的由基因調(diào)控的細(xì)胞死亡過程，調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因有多種，Bcl家族就是調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因之一〔3〕。

Bcl-2與Bax分別以同源二聚體形式存在，Bax蛋白自身可形成同二聚體，也可與Bcl-2組成異二聚體，Bax基因的表達(dá)產(chǎn)物可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Bcl-2基因的表達(dá)產(chǎn)物可以通過多種途徑阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，包括拮抗Bax的促凋亡作用〔4〕。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)增加時(shí)，Bcl-2與Bax形成的異二聚體增加,可以抑制Bax同二聚體的形成，從而阻止Bax蛋白的促凋亡作用〔5,6〕。本實(shí)驗(yàn)說明食管癌細(xì)胞的促凋亡作用減弱，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)，這兩個(gè)因素疊加在一起，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過少，造成了癌細(xì)胞的過度增生，從而發(fā)展成腫瘤。當(dāng)然，Bcl-2和Bax蛋白如果單方面發(fā)揮作用，可能也會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，這有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。食管癌組織中Bcl-2蛋白高表達(dá)提示食管癌組織分化程度差，惡性程度高。這一結(jié)果與宋曉環(huán)等〔7〕的研究結(jié)果一致。

Caspase為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，還參與細(xì)胞因子的成熟、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等過程。凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)包括死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑三種途徑，它們均以Caspase激活開始，以蛋白底物裂解、細(xì)胞解體為最終結(jié)局。通常狀態(tài)下，它們是以無活性的酶原形式存在的，當(dāng)受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，上游的Caspase能次序激活下游的Caspase，形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將凋亡信號(hào)逐級(jí)傳至凋亡產(chǎn)物〔8〕，其中Caspase-3是這個(gè)家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，它的激活可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔9〕。目前認(rèn)為，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與凋亡促進(jìn)基因Bax拮抗，抑制細(xì)胞色素C自線粒體釋放到胞質(zhì)，阻止細(xì)胞色素C對(duì)Caspase蛋白酶激活有關(guān)〔10,11〕。本實(shí)驗(yàn)說明Caspase-3的低表達(dá)抑制了細(xì)胞凋亡，使癌細(xì)胞無限制地增生，最終導(dǎo)致了食管癌的發(fā)生。這一結(jié)果與周正斌等〔12〕和郭艷麗等〔13〕的研究結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白的表達(dá)與食管癌的分化程度和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)系，這樣的結(jié)果與Bcl-2和Bax基因?qū)?xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用是一致的。胡玉英等〔14〕的研究結(jié)果提示：補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針療法能明顯抑制Bax蛋自表達(dá)及促進(jìn)Bcl-2蛋自表達(dá)，使神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯減少,與本研究有一致之處。Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)均與患者的年齡、性別、外膜浸潤(rùn)及臨床分期無關(guān)。Caspase-3蛋白的表達(dá)與有無外膜浸潤(rùn)和有無淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與其他指標(biāo)無關(guān)。李軍華等〔15〕的研究也證實(shí)Bcl-2與食管癌的淋巴轉(zhuǎn)移和分化程度密切相關(guān)，與本研究一致。

綜上所述，本研究結(jié)果提示Bcl-2、Bax和Caspase-3或許可以作為食管癌早期診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)，并提供靶向治療的新途徑。

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〔2016-03-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃(No.2011HZ098)

馬永臻(1970-)，女，教授，碩士，主要從事腫瘤病理研究。

R735.1

A

1005-9202(2017)14-3484-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.046