細(xì)胞色素C氧化酶-2/前列腺素E2信號通路對老年慢性阻塞性肺疾病患者肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用

許和平 姚津劍 吳多益 丁毅鵬

(海南省人民醫(yī)院急診科，海南 海口 570105)

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細(xì)胞色素C氧化酶-2/前列腺素E2信號通路對老年慢性阻塞性肺疾病患者肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用

許和平 姚津劍 吳多益 丁毅鵬

(海南省人民醫(yī)院急診科，海南 ?？?570105)

目的 探討細(xì)胞色素C氧化酶(Cox)-2/前列腺素E2(PG)E2信號通路對老年慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。方法 該行肺葉切除術(shù)的老年患者20例，根據(jù)吸煙情況和COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)分為非吸煙非COPD組(對照組)6例，吸煙非COPD組(非COPD組)7例，吸煙且COPD組(COPD組)7例，取癌旁正常肺組織為研究標(biāo)本。TUNEL法檢測肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況；免疫組化染色觀察細(xì)胞中Cox-2、PGE2蛋白分布情況；RT-PCR檢測Cox-2、PGE-2 mRNA表達(dá)；Western印跡檢測Cox-2、PGE2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)由高到低依次為COPD組、非COPD組、對照組；Cox-2、PGE2蛋白呈棕色或棕黃色表達(dá)于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)并在對照組中表達(dá)豐富。非COPD組、COPD組肺組織中Cox-2、PGE2 mRNA表達(dá)量明顯低于對照組，COPD組明顯低于非COPD組(P<0.05)。非COPD組、COPD組肺組織中Cox-2、PGE2 mRNA蛋白表達(dá)量明顯低于對照組，COPD組明顯低于非COPD組(P<0.05)。結(jié)論 COPD患者Cox-2、PGE2表達(dá)下調(diào)，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加且與吸煙相關(guān)；Cox-2/PGE-2信號通路參與介導(dǎo)COPD患者肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，呈負(fù)向調(diào)節(jié)。

慢性阻塞性肺疾?。粌?nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞色素C氧化酶/PGE2通路

慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)病機(jī)制中肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有重要地位，COPD與吸煙有關(guān)但具體凋亡機(jī)制仍未明確〔1〕。細(xì)胞凋亡過程中線粒體具有傳導(dǎo)和放大凋亡信號的作用，細(xì)胞色素C氧化酶(Cox)是位于線粒體內(nèi)膜上呼吸鏈末端的限速酶，可通過影響呼吸鏈功能進(jìn)而參與線粒體對細(xì)胞凋亡的調(diào)控〔2〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，吸煙可明顯抑制細(xì)胞Cox-2活性〔3〕；COPD患者呼吸肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中Cox-2表達(dá)水平下降〔4〕。前列腺素(PG)E2是Cox-2催化ARA的主要產(chǎn)物，也是Cox-2發(fā)揮作用的主要信使。本研究通過觀察老年COPD患者肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和肺組織Cox-2、PGE2表達(dá)情況，探討Cox-2/PGE2信號通路的作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2016年6月因肺癌在海南省人民醫(yī)院行肺葉切除術(shù)的老年患者20例，病理檢查均為鱗癌。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)患者均簽署知情同意書。取切除的肺組織中距離腫瘤6 cm以上的癌旁正常肺組織為研究標(biāo)本。根據(jù)吸煙情況和COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)分為非吸煙非COPD組(對照組)6例，男3例、女3例，年齡60～75歲，平均(64.31±8.57)歲；吸煙非COPD組(非COPD組)7例，男4例、女3例，年齡60～78歲，平均(65.08±10.62)歲；吸煙且COPD組(COPD組)7例，男4例、女3例，年齡60～81歲，平均(65.52±9.70)歲。3組患者性別構(gòu)成、年齡之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)，Trizol試劑(上海哈靈生物科技有限公司)，鼠抗人Cox-2、PGE2單克隆抗體(上海魯汶生物科技有限公司)，HRP標(biāo)記抗小鼠IgG(北京百奧萊博科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞凋亡情況檢測 TUNEL法檢測肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，細(xì)胞核染色呈深棕色為陽性。每例肺組織標(biāo)本取3 張切片，每張切片取10個不同視野，分別計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)，兩者比值為凋亡指數(shù)。

1.3.2 肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cox-2、PGE2蛋白分布檢測 采用免疫組化法檢測，肺組織切片常規(guī)脫蠟至水并用抗原修復(fù)，封閉30 min，滴加鼠抗人Cox-2、PGE2單克隆抗體后冷藏過夜，磷酸緩沖液洗滌后加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育90 min，洗滌后加HRP標(biāo)記抗小鼠IgG，37℃孵育90 min后DAB顯色，蒸餾水沖洗，二甲苯透明后封片固定。采集圖片，使用Image pro Plus 5.0軟件分析。

1.3.3 Cox-2、PGE2 mRNA表達(dá)檢測 RT-PCR法檢測，提取肺組織總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，Trizol法提取并鑒定肺組織總RNA后逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR反應(yīng)體系30 μl，反應(yīng)條件：10 min預(yù)變性94℃，4 min變性94℃，40 s退火56℃，1 min延伸72℃，共40個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，Image Scanner Ⅲ掃描儀檢測目標(biāo)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算相對表達(dá)量。

1.3.4 Western印跡法檢測肺組織Cox-2、PGE2蛋白表達(dá) RIPA蛋白裂解試劑盒提取肺組織總蛋白50 g，行PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜，奶粉封閉后滴加鼠抗人Cox-2、PGE2一抗(1∶500稀釋)，冰箱冷藏孵育過夜，加入二抗(1∶1 000稀釋)，ECL顯色并采集圖像，用電化學(xué)發(fā)光法檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗，相關(guān)性進(jìn)行Spearman分析。

2 結(jié) 果

2.1 肺血管病理學(xué)改變 對照組肺腺泡血管和炎性細(xì)胞浸潤均較少，血管結(jié)構(gòu)基本正常；非COPD組肺腺泡內(nèi)血管數(shù)量增加，血管腔狹窄，血管壁和內(nèi)膜增厚，外膜中炎性細(xì)胞浸潤和色素沉積；COPD組肺組織血管病變更明顯，肺腺泡內(nèi)血管數(shù)量和中膜平滑肌厚度明顯增加，血管內(nèi)膜呈肌化型增生。見圖1。

2.2 肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及Cox-2、PGE2蛋白分布情況 TUNEL法檢測顯示，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)由高到低依次為：COPD組(14.55±2.10)%、非COPD組(9.82±0.91)%、對照組(5.80±0.52)%。免疫組化染色顯示，Cox-2、PGE2蛋白呈棕色或棕黃色表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在對照組中表達(dá)豐富，在非COPD組、COPD組中表達(dá)依次下降。見圖2。

2.3 肺組織中Cox-2、PGE2 蛋白表達(dá)情況 非COPD組、COPD組肺組織中Cox-2 蛋白表達(dá)量分別為(19.54±0.21)、(15.60±1.85)，明顯低于對照組的(24.92±0.28)，COPD組明顯低于非COPD組(P<0.05)。PGE2蛋白表達(dá)量分別為(36.28±1.95)、(31.05±1.28)，明顯低于對照組的(50.81±2.63)，同時COPD組明顯低于非COPD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 肺組織中Cox-2、PGE-2 mRNA表達(dá)情況 非COPD組、COPD組肺組織中Cox-2 mRNA表達(dá)量分別為(0.79±0.26)、(0.75±0.28)，明顯低于對照組的(0.87±0.35)，同時COPD組明顯低于非COPD組(P<0.05)。非COPD組、COPD組肺組織中PGE2 mRNA表達(dá)量分別為(2.61±0.83)、(2.18±0.62)，明顯低于對照組的(3.27±1.04)，COPD組明顯低于非COPD組(P<0.05)。

圖1 肺血管形態(tài)學(xué)變化(HE，×200)

圖2 肺血管內(nèi)皮細(xì)胞Cox-2、PGE2蛋白的陽性表達(dá)與分布(×200)

圖3 Western印跡檢測肺組織中Cox-2、PGE2蛋白表達(dá)

3 討 論

COPD是可累及肺血管、氣道和肺實質(zhì)的破壞性疾病。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞是氣血屏障的重要成分，極易受到炎癥、吸煙等血流或氣道來源的損傷〔5〕。本研究結(jié)果提示血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡參與了吸煙所致的COPD早期的發(fā)病。在動物實驗中，靶向誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可成功建立慢性阻塞性肺病動物模型〔6〕。進(jìn)一步表明在COPD發(fā)病機(jī)制中肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是重要的啟動機(jī)制之一。 Cox是位于線粒體內(nèi)膜上呼吸鏈末端的限速酶，可通過影響線粒體電子傳導(dǎo)和膜電位合來調(diào)控細(xì)胞凋亡。內(nèi)皮細(xì)胞代謝功能活躍，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體在生命活動維持方面具有重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞中Cox共有13個亞基，Cox-2包含細(xì)胞色素C結(jié)合位點，是Cox的活性中心〔7〕。當(dāng)Cox-2表達(dá)異常時會直接影響Cox的生理功能，與之后的細(xì)胞色素C和細(xì)胞凋亡之間密切相關(guān)，因此可用Cox-2來間接反映Cox整體表達(dá)情況。PGE2是Cox-2催化花生四烯酸分泌的主要產(chǎn)物，可影響Cox-2的表達(dá)活性。相關(guān)研究顯示，Cox-2/PGE2信號通路與Apc/Tcf通路有明顯相關(guān)性，Apc基因突變可提升Tcf轉(zhuǎn)錄水平，增加PGE2、Cox-2的表達(dá)量〔8〕。本研究結(jié)果提示Cox-2/PGE2信號通路參與介導(dǎo)COPD患者肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡且呈負(fù)向調(diào)節(jié)，其與Apc/Tcf信號通路的關(guān)系需進(jìn)一步研究。而且吸煙可抑制Cox-2/PGE2信號通路傳導(dǎo)，間接導(dǎo)致COPD發(fā)生。

1 高恒興，溫中梅，袁海波，等.慢性阻塞性肺病發(fā)病機(jī)制研究的最新進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015；35(19)：5668-70.

2 崔德月.COX-2基因單核苷酸多態(tài)性與COPD相關(guān)性研究〔D〕.蘇州：蘇州大學(xué)，2014.

3 Malhotra S，Deshmukh SS，Dastidar SG，etal.COX inhibitors for airway inflammation〔J〕.Exp Opin Therap Targ，2012；16(2)：195-207.

4 魏海峰，錢 軍，鮑丙波，等.微血管形成在腰椎間盤退變過程中的表現(xiàn)特征及影響因素〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016；17(5)：632-5.

5 肖 建，杜春玲.慢性阻塞性肺疾病病因及發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(11)：3191-4.

6 Bernasconi M，Tamm M，Bingisser R,etal.Midregional proatrial natriuretic peptide predicts survival in exacerbations of COPD〔J〕.Chest J Circ Respir Related Systems，2011；140(1)：91-9.

7 Louis Anthony (Tony) Cox.A causal model of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) risk〔J〕.Risk Analysis，2011；31(1)：38-62.

8 鄭春燕.COX-2介導(dǎo)川芎嗪抑制肺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用研究〔D〕.濟(jì)南：山東大學(xué)，2012.

〔2016-12-27修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

丁毅鵬(1961-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病、哮喘研究。

許和平(1983-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事急危重癥、呼吸道感染研究。

R569

A

1005-9202(2017)14-3432-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.022