血管加壓素聯(lián)合腎上腺素對心搏驟停大鼠心肌細(xì)胞PERK-Nrf2信號通路的影響

劉月英 胡光瑞 于亞男

(香港大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518000)

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血管加壓素聯(lián)合腎上腺素對心搏驟停大鼠心肌細(xì)胞PERK-Nrf2信號通路的影響

劉月英 胡光瑞 于亞男1

(香港大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518000)

目的 探討血管加壓素和腎上腺素對心搏驟停大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-Nrf2通路的作用。方法 構(gòu)建大鼠心搏驟停模型后，隨機(jī)分為心搏驟停組(CA組)、腎上腺素治療組(Epi組)、血管加壓素治療組(Vp組)和血管加壓素聯(lián)合腎上腺素治療組(Epi+Vp組)。3個心搏驟停復(fù)蘇成功1 h后留取尾靜脈血，進(jìn)行血清學(xué)檢測。留取大鼠心肌組織行Western印跡法檢測心肌組織中GRP78、PERK和Nrf2的表達(dá)水平。結(jié)果 血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，與CA組相比，Epi組、Vp組和Epi+Vp組的還原型谷胱甘肽水平明顯增加。Western印跡結(jié)果顯示，與CA組相比，Epi組、Vp組和Epi+Vp組心肌組織中GRP78蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.01)。同時發(fā)現(xiàn)與CA組相比，Epi組和Vp組PERK和Nrf2蛋白增加(P<0.05)，Epi+Vp組PERK和Nrf2蛋白明顯增加(P<0.01)。結(jié)論 血管加壓素聯(lián)合腎上腺素通過活化PERK-Nrf2通路增加心搏驟停大鼠心肌細(xì)胞的抗氧化能力，增加心肌保護(hù)性作用。

心搏驟停；血管加壓素；腎上腺素；PERK-Nrf2通路

心搏驟停發(fā)病率高，復(fù)蘇困難，愈后差，特別是在低血容量性休克和器質(zhì)性心臟病等人群中。心搏驟停在復(fù)蘇過程中，心肌損傷的主要原因為心肌缺血和再灌注損傷，現(xiàn)階段認(rèn)為在缺血-再灌注過程中，與心肌細(xì)胞線粒體損傷、細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加和熱休克蛋白表達(dá)增加等有關(guān)，其最終導(dǎo)致的結(jié)果為心肌細(xì)胞凋亡〔1〕。還有研究顯示，當(dāng)心肌細(xì)胞受到外部刺激時，心肌細(xì)胞激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的UPR首先被活化的是PERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PERK有兩個底物eIF2a和Nrf2〔2〕。PERK可以磷酸化Nrf2后，其與胞質(zhì)內(nèi)的抑制劑Keap1分離，引起Nrf2移位至細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激應(yīng)答的基因表達(dá)等〔3〕。在心肺復(fù)蘇中腎上腺素被廣泛使用，但是在2010年國際心肺復(fù)蘇和心血管急救指南及治療建議中引入血管加壓素，替代首劑量或第二劑量的腎上腺素?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為血管加壓素能提高患者生存率〔4〕，但是其作用機(jī)制還不確定。本研究擬觀察血管加壓素對心搏驟停大鼠心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-Nrf2通路的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑 腎上腺素(天津遂成藥業(yè))，血管加壓素和谷胱甘肽檢測試劑盒(美國 Sigma公司)，GRP78、PERK和Nrf2抗體(北京博奧森生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物造模及分組 健康Wistar大鼠50只，體重(250±10)g，雌雄各半，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK-(吉)2008-0005。本研究采用窒息導(dǎo)致心搏驟停模型。造模前給予禁食不禁水12 h，給予10%水合氯醛進(jìn)腹腔麻醉后。給予手術(shù)區(qū)域剃毛，隨后用醫(yī)用碘伏消毒。用眼剪沿頸部正中用剪開頸部皮膚，分離各肌層暴露氣管，氣管切開，建立有效氣道。隨后暴露右側(cè)腹股溝區(qū)，股靜脈置管，用于給藥。待生命體征平穩(wěn)后，夾住氣管導(dǎo)管，待大鼠發(fā)生呼吸心搏驟停且平均動脈壓≤25 mmHg時，為成功造模。隨機(jī)分為心搏驟停組(CA組)、腎上腺素治療組(EPI組)、血管加壓素治療組(Vp組)和血管加壓素聯(lián)合腎上腺素治療組(Epi+Vp組)各10例。CA組給予心肺復(fù)蘇和1 ml生理鹽水靜脈注射，待大鼠呼吸心跳停止留取血標(biāo)本和心臟組織。Epi組給予心肺復(fù)蘇和0.2 mg/kg的腎上腺素靜脈注射。Vp組給予心肺復(fù)蘇和0.8 U/kg的血管加壓素靜脈注射。血管加壓素聯(lián)合腎上腺素治療組給予心肺復(fù)蘇同時0.2 mg/kg腎上腺素+0.8 U/kg血管加壓素靜注入。腎上腺素、血管加壓素和聯(lián)合用藥組心搏驟停復(fù)蘇成功1 h后留取尾靜脈血和留取大鼠心肌組織。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測肺組織GRP78、PERK和Nrf2蛋白的表達(dá)。

1.3 血清學(xué)檢測 采用Sigma公司谷胱甘肽檢測試劑盒，具體試驗步驟按照試劑盒說明書。計算出(GSH)/(GSSG)比值，為血清中抗氧化水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 蛋白條帶用Image J圖像處理軟件計算各條豆類灰度值。各組間差異進(jìn)行ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1 心搏驟停大鼠血清中GSH/GSSG值變化 與CA組(0.96±0.11)相比，Epi組(2.56±1.13)、Vp組(2.64±1.16)和Epi+Vp組(3.96±1.23)GSH/GSSG值明顯增加(P<0.01)。

2.2 Western印跡法檢測心搏驟停大鼠心肌組織中GRP78、PERK和Nrf2蛋白的表達(dá) 與CA組相比，Epi組、Vp組和Epi+Vp組中的心肌組織中GRP78蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與CA組相比，Epi組和Vp組中的PERK和Nrf2蛋白增加(P<0.05)，Epi+Vp組PERK和Nrf2蛋白明顯增加(P<0.01)。與Epi組和Vp組相比，Epi+Vp組中的PERK和Nrf2蛋白明顯表達(dá)增加(P<0.05)，見圖1。

圖1 心搏驟停大鼠心肌組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

目前，出現(xiàn)器質(zhì)性和生理性的心搏驟停的病人逐漸增多，但是心臟臨床醫(yī)療中針對搶救心搏驟停的藥物主要以腎上腺素為主，腎上腺素主要是激動周圍血管的α1受體，收縮周圍的血管從而提高主動脈舒張壓，增加腦的灌注壓及冠狀動脈壓，興奮β受體，提高心率，增加心肌收縮力。但是研究證實腎上腺素可引起復(fù)蘇后伴隨著嚴(yán)重心律失常和心功能不全〔5〕，2010年國際心肺復(fù)蘇和心血管急救指南及治療建議中引入血管加壓素，血管加壓素主要通過受體發(fā)揮作用，認(rèn)為其可以增加重要臟器的血流量，來減少缺血再灌注引起的損傷。同時還發(fā)現(xiàn)其不僅能夠提高冠脈灌注壓，還能夠增加左室心肌及腦血管等重要臟器的血流量〔6〕。之前一些研究發(fā)現(xiàn)了腎上腺素聯(lián)合血管加壓素能改變心肌組織中PI3K/Akt信號通路〔7〕。本研究結(jié)果說明在復(fù)蘇后大鼠血清的抗氧化水平增加。而且在心搏驟停后，給予心肺復(fù)蘇和藥物治療后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度增加。研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞受到外部刺激時，心肌細(xì)胞激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的UPR反應(yīng)首先被活化的是PERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，PERK有兩個底物eIF2a和Nrf2〔2〕。PERK可以磷酸化Nrf2后，其與胞質(zhì)內(nèi)的抑制劑Keap1分離，引起Nrf2移位至細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激應(yīng)答的基因表達(dá)等〔3〕。本研究結(jié)果這說明在心搏驟停后，給予心肺復(fù)蘇和Epi+Vp治療后，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加，誘導(dǎo)PERK-Nrf2通路的活化，增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)。也說明在血清中檢測還原型谷胱甘肽的表達(dá)增加可能是由于PERK-Nrf2通路的活化引起的。

1 Bagheri F,Khori V,Alizadeh AM,etal.Reactive oxygen species-mediated cardiac-reperfusion injury:mechanisms and therapies〔J〕.Life Sci,2016;15(1):43-55.

2 Harding HP,Zhang Y,Zeng H,etal.An integrated stress response regulates amino-acid metabolism and resistance to oxida-tive stress〔J〕.Mol Cell,2003;11(3):619-33.

3 Cullinan SB,Diehl JA.Coordination of ER and oxidative stress signaling:the PERK/Nrf2 signaling pathway〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2006;38(3):317-32.

4 Hazinski MF，Nolan JP，Billi JE，etal.Part 1：Executive summary：2010 international consensus on cardiopulmonary resuscitation and emergency cardiovascular care science with treatment recommendations〔J〕.Circulation，2010;122(16 suppl 2)：S250-75.

5 Ghafourian N,Maniae NH,Taherikalani M,etal.Combination of vasopressin-epinephrine as a novel candidate in patients with cardiac arrest〔J〕.Recent Adv Cardiovasc Drug Discov,2015;10(1):65-9.

6 Babar SI，Berg RA，Hilwig RW，etal.Vasopressin versus epinephrine during cardiopulmonary resuscitation：a randomized swine outcome study〔J〕.Resuscitation,1999;41(2):185-92.

7 岳菁菁.血管加壓素聯(lián)合腎上腺素對心搏驟停大鼠復(fù)蘇后心肌損傷PI3k/Akt信號通路的作用及影響〔D〕.長春：吉林大學(xué)，2011.

〔2017-04-11修回〕

(編輯 李相軍)

吉林省衛(wèi)生計生委項目(2015SZC13)

劉月英(1977-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事重癥醫(yī)學(xué)研究。

R331.3

A

1005-9202(2017)14-3397-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.007

1 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院