應激大鼠腸道樹突細胞的免疫功能

李 蒙 張 璐 胡 玥 呂 賓

(浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院消化科，浙江 杭州 310000)

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應激大鼠腸道樹突細胞的免疫功能

李 蒙 張 璐 胡 玥 呂 賓

(浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院消化科，浙江 杭州 310000)

目的 研究應激大鼠腸道樹突細胞(DC)表型及功能狀態(tài)的改變。方法 選用20只雄性SD大鼠隨機分為對照組、實驗組，各10只。給予實驗組大鼠結直腸擴張聯(lián)合束縛刺激，對照組大鼠不處理，采用大鼠腹部收縮反射(AWR)對兩組大鼠進行直腸氣囊擴張，測量腸道容量感覺閾值。成功建立模型后，磁珠分選技術分離腸系膜淋巴結DC，檢測其表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ、Toll樣受體(TLR)4的表達，將MLNDC與脾臟單個核細胞體外混合培養(yǎng)，流式標記CD4+/CD8+T淋巴細胞，檢測MLNDC促CD4+/CD8+T淋巴細胞增殖的能力。結果 實驗組大鼠的疼痛閾值明顯低于對照組(P<0.05)；實驗組大鼠MLNDC表達MHCⅡ水平高于對照組(P<0.05)，而表達CD80、CD86、MHCI與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；實驗組大鼠MLNDC表達TLR4高于對照組(P<0.05)；與對照組相比，實驗組大鼠MLNDC促CD4+/CD8+T淋巴細胞增殖能力增強(P>0.05)。結論 大鼠應激刺激后腸道DC上調表達TLR4，刺激其本身分化成熟，進一步表達MHCⅡ，后者通過介導T淋巴細胞活化，引起腸道低度炎癥，從而引起腸道內(nèi)臟高敏感的產(chǎn)生。

應激；樹突細胞；Toll樣受體4

樹突細胞(DC)具有抗原遞呈作用，DC的樹突經(jīng)緊密連接能對抗原進行直接識別，或其胞體能間接接受M細胞遞呈抗原，DC產(chǎn)生的信息能誘導免疫激活、免疫耐受，與癌癥發(fā)生、發(fā)展存在一定關聯(lián)〔1,2〕。成熟DC能介導細胞免疫應答、體液免疫應答，未成熟DC細胞能誘導免疫抑制、免疫耐受，通過檢測DC相關細胞因子表達能對DC在炎癥發(fā)生機制中可能起到的作用進行探討〔3,4〕。腸易激綜合征(IBS)是一種常見的消化道疾病，治療難度大，多與腸道感染、免疫、腸道菌群失調等有關，但發(fā)病機制、病因尚未完全明確，是國內(nèi)外醫(yī)學研究的重難點〔5,6〕。本研究擬進一步探討應激對腸黏膜免疫功能的影響，對大鼠腸道DC進行分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選用20只雄性SD大鼠，體重(182.0±18.0)g，6～8周齡，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心提供。實驗前2 w將所有大鼠放進25℃恒溫飼養(yǎng)室，安排專人飼養(yǎng)，維持12 h∶12 h的晝夜交替，根據(jù)所需原則為大鼠提供水、食物。

1.2 方法

1.2.1 建立模型與分組 所有大鼠飼養(yǎng)2 w后隨機分為實驗組、對照組，各10只。實驗組大鼠采用結直腸擴張聯(lián)合束縛應激建立應激大鼠模型，實驗組大鼠采用結直腸擴張刺激2 w：8F氣囊導尿管以石蠟潤滑后經(jīng)肛門插入直腸，氣囊遠端距肛門1 cm，導尿管肛門外部分以棉線固定鼠尾根部，以60 mmHg氣囊壓力予以刺激，2次/d，間隔30 min，每次持續(xù)1 min。結直腸擴張刺激結束后予以束縛應激5 d：大鼠置入特殊制動籠器內(nèi)，束縛前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓頭面部，可少許前后活動，束縛時間為2 h。正常對照組大鼠不予任何刺激，結直腸擴張聯(lián)合束縛應激共19 d。造模結束后，實驗研究者采用國際通用的大鼠腹部收縮反射(AWR)評分標準評估腸道敏感性，具體方法如下：將大鼠于清醒狀態(tài)，不限制其活動情況下將8F帶氣囊導尿管外涂石蠟后經(jīng)肛門插入，氣囊末端距肛緣1 cm。導尿管肛門外部分以棉線固定鼠尾根部。30 min后大鼠適應環(huán)境呈安靜狀態(tài)，擴張球囊使球囊內(nèi)壓力逐漸升高，觀察腹部抬離桌面(AWR=3)時的氣囊壓力，由非實驗者記錄AWR=3時的球囊壓力，共進行3次，每次持續(xù)30 s，間隔3 min，取平均壓力值。

1.2.2 采集標本 模型建立成功后，將大鼠處死，浸入75%酒精10 min后置于超凈臺內(nèi)，快速剖腹取脾臟，玻璃棒輕敲，剪刀剪小破口，使被膜下組織碎塊流出，可以附加碾碎，200目濾網(wǎng)過濾，獲得單細胞懸液；在無菌條件下，將小腸翻出體外，見在腸系膜近根部存在一排粟粒狀淋巴結，取下淋巴結，置入無血清RPMI1640備用。

1.2.3 分離腸系膜淋巴結DC(MLNDC) 將置入無血清RPMI1640的淋巴結用無菌載玻片將組織塊碾磨并過濾銅網(wǎng)，制成懸浮液體，離心10 min，PBS重懸并離心2次；以含10%胎牛血清的RPMI1640(含雙抗)懸浮細胞，細胞計數(shù)，離心棄上清，每107個細胞加入80 μl緩沖液和20 μl Anti-RatDC(OX62)MicroBeads(德國Miltenyi公司)，混勻，在冰箱(4℃～8℃)孵育15 min，嚴格按照說明書分選OX62+DC，所獲細胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI1640全培養(yǎng)基中。將分離得到的腸道單個核細胞均與PE標記的OX62抗體孵育，4℃，避光30 min。同時孵育同型對照抗體。流式細胞儀檢測，CellQuest軟件進行分析。細胞活力檢測：將0.4%臺盼蘭和分離前后的細胞懸液以1∶1混合后鏡下觀察并計數(shù)染色細胞比例。

1.2.4 檢測腸道MLNDC表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ、Toll樣受體(TLR)4的表達 各組MLNDC調整至1×107/ml，PBS漂洗離心后重懸約0.5 ml，分別與APC標記的MHCⅠ抗體、FITC標記的MHCⅡ抗體、APC標記的CD86抗體、FITC標記的CD80抗體、PE標記的TLR4抗體孵育(美國eBioseience公司)，4℃，避光30 min，1 ml PBS漂洗，離心后以0.5 ml重懸，同時孵育各自同型對照抗體。流式細胞儀檢測相應熒光強度，Cell Quest軟件對結果進行分析。

1.2.5 檢測MLNDC促T淋巴細胞增殖能力 將獲得的脾臟單細胞懸液離心10 min，PBS重懸離心10 min共2次，離心后以含10%胎牛血清的RPMI1640(含雙抗)懸浮細胞，采用大鼠淋巴細胞分離液按照說明書要求密度梯度離心(20℃，20 min)，將分離得到的單個核細胞用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋到1×107/ml細胞懸液備用。

CFSE標記脾臟單個核細胞：使用DMSO配制5 mmol/L CFSE母液，在避光環(huán)境中，110 μl PBS溶液中加入1.1 μl的CFSE母液，迅速混勻，轉入已備好的1 ml單個核細胞懸液中，充分混勻，室溫反應5 min，加入10 ml含有5%滅活FBS的PBS液終止標記，離心5 min，收集沉淀，以含5%滅活FBS的PBS液離心5 min漂洗2遍，收集離心后沉淀，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，制備CFSE標記的單個核細胞懸液。

將分離得到的MLNDCs調整濃度至5×106/ml，用含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(含雙抗)懸浮，分別以0.1 ml DC(5×105細胞/孔)加入96孔細胞培養(yǎng)板，每組設3復孔，每孔預孵育OVA(10 ng/ml)2 h，再加入同種大鼠脾臟CFSE標記的單個核細胞懸液0.1 ml(MLNDC與其細胞濃度比值為1∶1)，另設MLNDC、脾臟單個核細胞單獨培養(yǎng)組，在含5%的CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，分別用抗CD4-PE及抗CD8-PE抗體標記表面分子，流式細胞儀檢測，以CFSE為第一熒光，PE標記抗體為第二熒光，用Cell Quest軟件獲取數(shù)據(jù)，Modfit軟件分析不同細胞亞群的CFSE。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗。

2 結 果

2.1 模型驗證結果 造模后大鼠逐漸表現(xiàn)為大便質稀、焦躁及體重減輕等，對照組大鼠一般情況良好。造模結束后第3天，以AWR=3分時所需的氣囊壓力作為評價指標進行模型驗證，結果實驗組較對照組大鼠內(nèi)臟敏感性顯著增高，感覺閾值實驗組(69.4±3.72)mmHg，對照組(84.2±3.61)mmHg(P<0.05)，提示應激模型成功建立。

2.2 流式細胞術檢測OX62+MLNDC分選結果 平均每1只成年雄性SD大鼠的腸系膜淋巴結經(jīng)磁珠分選后可獲得約1×107個MLNDC，收集磁珠分選后的MLNDCs，流式細胞術檢測顯示OX62陽性率為87.91%±8.12%，臺盼藍染色后鏡下觀察并計數(shù)顯示細胞活性>90%。

2.3 MLNDC表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ、TLR4的表達水平 流式檢測結果表明，與對照組相比，實驗室小鼠MLNDC表面高表達MHCⅡ類分子(P<0.05)，而CD86、CD80及MHCⅠ類分子的表達無明顯變化(P>0.05)；與對照組相比，實驗室小鼠MLNDC表面高表達TLR4(P<0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠MLNDC表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ、TLR4、TLR9的表達

與對照組相比：1)P<0.05

2.4 MLNDC促T淋巴細胞增殖能力 與對照組相比，實驗組大鼠腸道MLNDC可以顯著促進CD4+及CD8+T淋巴細胞增殖，見圖1。

圖1 流式細胞術檢測CD4+、CD8+T細胞表達

3 討 論

DC是目前所知的功能最強的抗原提呈細胞，能對一系列外來病原體信號進行整合，并傳遞至淋巴細胞，使適宜的免疫應答反應啟動〔7〕。成熟DC的吞噬能力降低，但細胞表面的共刺激分子、黏附分子的相關表達增高，促使促炎癥細胞因子分泌，使初始T細胞介導的相關免疫應答反應啟動；而未成熟的DC通過微生物感染、移植后識別及吞噬外源性抗原，能快速成熟〔8,9〕。DC廣泛分布于多種組織，在腸道黏膜免疫系統(tǒng)，DC主要分布于腸道黏膜固有層、Peyer結和腸系膜淋巴結，其中分布于腸道黏膜固有層、Peyer結的DC可以直接攝取抗原或通過伸出樹突進入腸腔內(nèi)攝取抗原以呈遞給T細胞而引起免疫應答反應。DC可通過向T細胞提供活化所必需的抗原肽-MHC第一信號及CD80、CD86(即B7-Ⅰ、B7-Ⅱ)等共刺激分子第二信號，誘導初始型T細胞(Th0)向Th1和Th2分化并啟動T細胞免疫應答，分別產(chǎn)生特征性細胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ(Th1途徑)及IL-4、IL-5、IL-9(Th2途徑)。DC表達的Ⅰ類和Ⅱ類MHC分子是抗原多肽的載體，分別提呈內(nèi)源性和外源性抗原肽，介導CD8+及CD4+T淋巴細胞增殖活化。本研究結果說明，大鼠腸道MLNDC本身處于一個比較成熟的狀態(tài)，應激刺激進一步促使MLNDC上調表達MHCⅡ，刺激T淋巴細胞活化能力增強，引起其成熟水平的進一步提高。

DC表面表達多種模式識別受體，其中TLR就是一類重要的模式識別受體，在識別微生物感染的過程中發(fā)揮重要作用。TLRs識別病原體的一些高度保守的分子結構即病原體相關分子模式而啟動固有免疫應答，介導抗感染免疫。TLRs在DC和巨噬細胞等專職抗原提呈細胞表面，表達尤其豐富。其中，TLR4在DCs分化和功能成熟過程中發(fā)揮著關鍵的作用，TLR4可以識別來源于腸腔的革蘭陰性菌細胞壁成分脂多糖，通過胞內(nèi)的相應信號通路傳遞信息，誘導DCs成熟，并促使其分泌細胞因子，活化T細胞，誘導特異性免疫應答。本研究發(fā)現(xiàn)，應激大鼠腸道中，上調表達的TLR4可以通過識別相應配體引起DC成熟活化，主要表現(xiàn)為表面MHCⅡ的上調表達，后者進一步刺激T淋巴細胞活化，引起大鼠腸道低度炎癥的產(chǎn)生，從而介導應激相關內(nèi)臟高敏感。

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〔2017-01-20修回〕

(編輯 李相軍)

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The immune function of intestinal dendritic cell in stressed rats

LI Meng,ZHANG Lu,HU Yue,etal.

Department of Digestive,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310000,Zhejiang,China

Objective To analyze the phenotype and function of intestinal dendritic cell (DC) in stressed rats.Methods 20 male SD rats were randomly divided into experimental and control groups,10 cases in each. Experimental group was established by combining colorectal distention with restraint stress,which underwent abdominal withdrawal reflex (AWR) to evaluate visceral sensitivity. After successful modeling,mesenteric lymph node DC (MLNDC) of rats was isolated and purified by magnetic label-based technique. The surface marker CD80,CD86,MHC Ⅰ,MHC Ⅱ,TLR 4 of MLNDC were tested by the technique of flow cytometry,and mixed lymphocyte reaction (MLR) was used to evaluate the capacity to stimulate T cell proliferation. Results The OX62 positivity cell population following magnetic sorting was about 87.91%±8.12%. Compared with control group，high level of MHC Ⅱ was expressed on the surface of MLNDCs (P<0.05),whereas the expression of CD80,CD86,and MHC Ⅰ were not significant (P>0.05). Compared with control group，high level of TLR4 was expressed on the surface of MLNDCs (P<0.05).CD4+or CD8+T cells proliferated when the DC/T ratio was increased. Conclusions Stress induces the increased expression of TLR4 in rats MLNDC,which stimulates T cells proliferation by upregulating the surface maker of MHC Ⅱ,resulting in the generation of intestinal low-grade inflammation and visceral hypersensitivity in IBS rats.

Stress;Dendritic cells;Toll-like receptors 4

國家自然科學基金資助項目(81600426)

呂 賓(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要從事消化病研究。

李 蒙(1986-)，女，博士，住院醫(yī)師，主要從事胃腸道疾病研究。

R56

A

1005-9202(2017)14-3386-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.003