補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)肝纖維化小鼠肝功能、肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、腫瘤壞死因子-α水平的作用及機(jī)制

張英博 李春旭 柏青楊 張曉杰 費(fèi)洪新 周忠光

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

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·基礎(chǔ)研究·

補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)肝纖維化小鼠肝功能、肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、腫瘤壞死因子-α水平的作用及機(jī)制

張英博 李春旭 柏青楊 張曉杰 費(fèi)洪新 周忠光1

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯(BHD)對(duì)肝纖維化(LF)小鼠肝功能、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平的影響和機(jī)制。方法 雄性小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組，模型組，秋水仙堿組(0.001 g/kg)，BHD高、中、低劑量組(37.06、18.53、9.26 g/kg)。采用30% CCl4(1 ml/kg)腹腔注射誘導(dǎo)LF小鼠。放射免疫法檢測(cè)小鼠血清透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)水平。生化分析法檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。Masson染色和透射電鏡觀察小鼠肝形態(tài)結(jié)構(gòu)并計(jì)算肝指數(shù)。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)肝TGF-β1和TNF-α水平。結(jié)果 與模型組比較，BHD高、中劑量組小鼠血清HA、LN、ALT和AST明顯降低(P<0.05)，LF明顯減輕，肝指數(shù)明顯降低(P<0.05)，肝TGF-β1和TNF-α明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 BHD可改善小鼠LF，這與降低小鼠肝TGF-β1和TNF-α表達(dá)有關(guān)。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯；肝纖維化

肝纖維化(LF)是一種肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生而形成的病理生理過(guò)程之一〔1〕。LF出現(xiàn)肝細(xì)胞損傷，肝血竇內(nèi)肝巨噬細(xì)胞活化而產(chǎn)生大量因子，例如產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、腫瘤壞死因子(TNF)-α等〔2〕，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞(HSC)活化而產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，ECM降解后血清透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)水平增加〔3〕，同時(shí)LF伴有血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量增加〔4〕。目前可采用四氮化碳(CCl4)誘導(dǎo)建立LF小鼠、大鼠模型〔5，6〕。復(fù)方補(bǔ)陽(yáng)還五湯(BHD)的應(yīng)用十分廣泛，例如BHD下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB-p65蛋白表達(dá)〔7〕、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡〔8〕、調(diào)控細(xì)胞周期〔9〕、治療動(dòng)脈粥樣硬化〔10〕、抑制肝癌血管生成〔11〕、治療缺血性腦卒中〔12〕、治療脊髓損傷等〔13〕。但是BHD抗小鼠LF的實(shí)驗(yàn)研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)探討B(tài)HD對(duì)LF小鼠模型的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：清潔級(jí)雄性昆明小鼠，體重(20±3)g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心李寶龍副主任提供，許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-004。藥品和試劑：BHD由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院周忠光教授購(gòu)買(mǎi)，田明教授制備成水煎劑，再制備成干粉后保存，BHD原藥材(黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龍3 g、桃仁3 g和紅花3 g)組方提純成干粉的提純率為36.12%；秋水仙堿，西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)140808；血清HA、LN、ALT、AST試劑盒，TNF-α和TGF-β1酶聯(lián)免疫試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；CCl4和其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院張英博副主任醫(yī)師提供。儀器：臺(tái)式離心機(jī)，TGL-16G (上海安亭科學(xué)儀器廠)；RT雷杜酶標(biāo)儀，6100型 (美國(guó)RT公司)；透射電鏡，EM-1200EX型 (日本Jeol公司)，冰凍切片機(jī)，CM1900型 (Leica公司)等。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)制LF模型 采用30% CCl4(1 ml/kg，使用橄欖油配制)腹腔注射昆明小鼠，誘導(dǎo)小鼠LF模型，每周對(duì)小鼠注射2次，共8 w，通過(guò)小鼠尾靜脈采血，檢驗(yàn)小鼠血清學(xué)指標(biāo)，確認(rèn)LF小鼠模型制備成功，此過(guò)程參考文獻(xiàn)〔5〕。同時(shí)對(duì)照組采用同樣方法腹腔注射等量100%橄欖油。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥方法 昆明小鼠42只，隨機(jī)分成對(duì)照組，模型組，秋水仙堿組，BHD高、中、低劑量組，每組7只。對(duì)照組、模型組灌胃等量生理鹽水，秋水仙堿組灌胃秋水仙堿0.001 g/kg，BHD高、中、低劑量組分別灌胃BHD(37.06、18.53、9.26 g/kg)，灌胃40 d。

1.2.3 血清LF指標(biāo) 小鼠灌胃結(jié)束后禁食20 h，眼球采混合血，靜置分層，離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝，保存，采用放射性免疫法檢測(cè)血清HA、LN。

1.2.4 血清肝功能指標(biāo) 小鼠灌胃結(jié)束后禁食20 h，眼科鑷子摘除小鼠眼球，采混合血，靜置，離心機(jī)2 500 r/min離心15 min，取上清分裝，保存。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清生化指標(biāo)ALT、AST。

1.2.5 Masson染色 小鼠灌胃結(jié)束后水合氯醛麻醉，心臟灌注80 ml生理鹽水，4%多聚甲醛灌注，取材肝，制備石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，鉻化處理，蒸餾水洗滌，Weigert蘇木精液染核5～10 min，鹽酸酒精分化，蒸餾水洗滌，Masson麗春紅酸性品紅液染5～10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，苯胺藍(lán)染5 min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，鏡下觀察。

1.2.6 透射電鏡 小鼠灌胃結(jié)束后，禁食20 h，水合氯醛麻醉，心臟灌注80 ml生理鹽水，2.5%戊二醛灌注，取材肝，2.5%戊二醛和四氧化鋨分別固定、脫水、包埋、切片等，透射電鏡觀察肝組織。

1.2.7 肝指數(shù) 小鼠灌胃結(jié)束后，斷頭處死小鼠，取材肝，電子天平稱(chēng)重，計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)(mg/g)=肝質(zhì)量(mg)/體重(g)。

1.2.8 肝組織TGF-β1和TNF-α 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭處死，剪開(kāi)腹腔皮膚、腹膜，取材肝組織，勻漿，4 000 r/min離心15 min，取上清液，分裝，-80℃保存，酶標(biāo)儀上450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)，繪制TGF-β1和TNF-α的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定肝組織TGF-β1和TNF-α含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 血清LF指標(biāo) 與對(duì)照組比較，模型組LF小鼠的血清HA、LN含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組，BHD高、中劑量組LF小鼠的血清HA、LN含量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 血清肝功能指標(biāo) 與對(duì)照組比較，模型組LF小鼠血清的ALT和AST含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組，BHD高、中劑量組LF小鼠血清ALT和AST含量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 Masson染色觀察肝組織 鏡下可見(jiàn)對(duì)照組肝細(xì)胞輻射狀排列，肝板清晰，中央靜脈清晰可見(jiàn)，肝細(xì)胞質(zhì)豐富，膠原纖維較少；模型組肝板較寬，肝細(xì)胞質(zhì)較少，中央靜脈較粗大，肝細(xì)胞之間膠原纖維較多；秋水仙堿組，BHD高、中、低劑量組肝細(xì)胞之間膠原纖維不同程度地減少，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同程度地得到改善，肝板較清晰。見(jiàn)圖1，圖2。

2.4 透射電鏡觀察肝組織 鏡下可見(jiàn)對(duì)照組肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體未出現(xiàn)腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰可見(jiàn)；模型組肝細(xì)胞的細(xì)胞器較少，例如線粒體數(shù)量減少，伴有脂滴較多，空泡較多；秋水仙堿組，BHD高、中、低劑量組肝細(xì)胞內(nèi)空泡不同程度地減少，伴有脂滴和線粒體均較少。見(jiàn)圖3。

2.5 肝指數(shù) 與對(duì)照組比較，模型組LF小鼠肝指數(shù)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組，BHD高、中劑量組LF小鼠肝指數(shù)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.6 肝組織TGF-β1和TNF-α 與對(duì)照組比較，模型組LF小鼠肝組織TGF-β1和TNF-α含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組，BHD高、中劑量組小鼠肝組織TGF-β1、TNF-α含量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表1 BHD對(duì)LF小鼠血清HA、LN的影響

與對(duì)照級(jí)比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

表2 BHD對(duì)LF小鼠血清ALT、AST的影響

圖1 Masson染色觀察肝組織(Masson，× 100)

圖2 Masson染色觀察肝組織(Masson，× 400)

圖3 透射電鏡觀察肝組織超微結(jié)構(gòu) (透射電鏡，× 16 500)

組別劑量(g/kg)體重(g)肝指數(shù)(mg/g)對(duì)照組-27.1714±0.822040.7071±1.8838模型組-27.4143±1.109744.4271±3.90051)秋水仙堿組0.00127.1857±1.105241.1171±2.26602)BHD高劑量組37.0627.5143±1.319640.9814±1.83262)BHD中劑量組18.5326.8714±1.511941.2657±2.80782)BHD低劑量組9.2627.1429±0.948444.0814±2.6711

表4 BHD對(duì)LF小鼠肝組織TGF-β1、TNF-α含量的影響

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)表明BHD高、中劑量可改善小鼠肝組織LF程度，減少肝組織ECM，減少肝組織膠原纖維的含量，以此治療LF。BHD高、中劑量可部分恢復(fù)小鼠肝功能。LF模型小鼠肝組織損傷明顯，出現(xiàn)肝代償性增生。經(jīng)過(guò)BHD治療后，BHD高、中劑量可不同程度地減少肝肝代償性增生，避免肝組織損傷，以此增加對(duì)肝臟的保護(hù)作用。LF伴有肝巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1和TNF-α含量增加，肝星狀細(xì)胞大量增殖，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生，促進(jìn)ECM沉積，最終促進(jìn)肝組織演化為L(zhǎng)F。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LF小鼠模型穩(wěn)定。BHD高、中劑量可干擾肝組織內(nèi)肝星狀細(xì)胞大量增殖，減少成纖維細(xì)胞生成，減弱小鼠LF程度。同時(shí)肝組織TGF-β1和TNF-α含量降低的同時(shí)，伴有肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改善，LF指標(biāo)及其肝功能指標(biāo)得到改善，肝指數(shù)得到部分恢復(fù)，提示高、中劑量BHD通過(guò)改善肝組織TGF-β1和TNF-α含量水平來(lái)治療LF。

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〔2016-10-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

Effects of Buyang Huanwu Decoction on liver fibrosis mice and its mechanism

ZHANG Ying-Bo，LI Chun-Xu，BAI Qing-Yang，etal.

Qiqihar Medical University，Qiqihaer 161006，Heilongjiang,China

Objective To investigate the effects of Buyang Huanwu Decoction (BHD) against liver fibrosis(LF) mice and its mechanism.Methods Male mice were randomly divided into control，model， colchicine (0.001 g/kg)，BHD high-dose (37.06 g/kg)，BHD medial-dose (18.53 g/kg)，BHD low-dose (9.26 g/kg) groups. The radioimmunoassay was used to determine hyaluronic acid (HA) and laminin(LN) levels in serum. The biochemical analysis was used to determine alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels in serum. The morphology of liver tissue was observed by optical microscope and electron microscope，calculated the organ coefficients of liver. The enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) was applied for detecting transforming growth factor(TGF)-β1 and tumor necrosis factor(TNF)-α levels in the liver. Results Compared with those of model group，the levels of HA，LN，ALT and AST in BHD high-dose and medial-dose groups were significantly decreased (P<0.05)；the liver pathological variations of fibrotic mice were changed obviously；organ coefficients of liver significantly were decreased (P<0.05)；the TGF-β1 and TNF-α levels in the liver were significantly decreased (P<0.05).Conclusions BHD could attenuate liver injury and the fibrosis level in LF mice. The mechanisms possibly contribute to down-regulating expressions of TGF-β1 and TNF-α in liver of mice.

Buyang Huanwu Decoction；Liver fibrosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81373777，81173599)；黑龍江省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(No.12531788)；齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院院內(nèi)科研博士專(zhuān)項(xiàng)基金(No.QY2016B-21)

費(fèi)洪新(1978-)，男，博士，博士后，講師，主要從事肝纖維化、腫瘤、癡呆研究。

張英博(1973-)，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事肝纖維化、腫瘤、癡呆研究。

R285

A

1005-9202(2017)14-3381-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.001

1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)