人參皂苷Rg1通過調(diào)控骨骼肌TRB3/AKT信號通路改善大鼠胰島素抵抗的分子機制研究

鄭永仁 王 礴 劉傳鳳 楊曉密*

1．云南中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心，云南 昆明 650500；2 云南白藥集團股份有限公司，云南 昆明 650500

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實驗研究

人參皂苷Rg1通過調(diào)控骨骼肌TRB3/AKT信號通路改善大鼠胰島素抵抗的分子機制研究

鄭永仁1王 礴1劉傳鳳2楊曉密1*

1．云南中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心，云南 昆明 650500；2 云南白藥集團股份有限公司，云南 昆明 650500

目的：探討人參皂苷Rg1對大鼠骨骼肌的保護作用，并討論其通過調(diào)控骨骼肌TRB3/AKT信號通路緩解大鼠IR的分子機制。方法：50只雄性SD大鼠隨機分為5組，正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，胰島素抵抗(IR)組以及人參皂苷Rg1低劑量治療組、中劑量治療組以及高劑量治療組給予高脂飼料喂養(yǎng)，4周后，分別對 Rg1低劑量、中劑量和高劑量治療組大鼠予以Rg1 25 mg/kg·d、50 mg/kg·d和100 mg/kg·d灌胃治療，同時IR組大鼠予以相同體積生理鹽水灌胃，4周后處死大鼠，收集血清和骨骼肌組織。分別采用ELISA、RT-qPCR和Western blot等方法進行相關(guān)因子檢測。結(jié)果：與對照組比較，IR組大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HOMA-IR、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β含量升高(P<0.05)，人參皂苷Rg1治療后，上述指標(biāo)下降(P<0.05)且具有劑量依賴性；SOD和GSH的含量降低，人參皂苷Rg1 治療4周后升高(P<0.05)；且骨骼肌組織中TRB3的mRNA和蛋白表達水平，經(jīng)人參皂苷Rg1治療后下降明顯(P<0.05)，AKT(Ser473位點)的磷酸化水平升高(P<0.05)，且都具有劑量依賴性。 結(jié)論：人參皂苷Rg1可以降低機體HOMA-IR、減輕炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)、改善血脂，并通過調(diào)控骨骼肌TRB3/AKT信號通路保護大鼠骨骼肌代謝，緩解IR。

人參皂苷Rg1；胰島素抵抗；骨骼肌；TRB3；AKT

胰島素由生物體胰島β細胞分泌，并且通過與胰島素受體結(jié)合并激活胰島素信號來實現(xiàn)其生物效應(yīng)的一種小分子蛋白質(zhì)，當(dāng)胰島素傳導(dǎo)信號發(fā)生障礙時，就會導(dǎo)致胰島素抵抗(Insulin Resistance, IR)[1-2]。IR的發(fā)生由遺傳和環(huán)境因素共同作用，是胰島素促進葡萄糖攝取作用受損，導(dǎo)致正常劑量的胰島素分泌低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)，主要表現(xiàn)為機體本身對胰島素生理作用的反應(yīng)能力降低，即外周組織對胰島素敏感性下降， 以及對葡萄糖的利用障礙，高胰島素血癥是IR的重要標(biāo)志，其發(fā)生的主要器官是脂肪、肝臟和骨骼肌[3-4]。文獻報道，IR誘發(fā)的脂質(zhì)代謝紊亂與二型糖尿病、非酒精性脂肪肝以及非酒精性脂肪肝炎等代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)， 因此，對IR的治療是目前臨床研究的熱點[5-6]。

有研究報道[7-9]，Akt /PKB 分子信號通路在胰島素信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，它的磷酸化水平改變可直接影響 IR的發(fā)生，而Tribbles 同源蛋白3 (Tribbles Homolog Protein 3，TRB3)是一種具有廣泛調(diào)節(jié)作用的生物小分子， TRB3可作為調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控Akt信號通路， 并且可以和Akt /PKB 結(jié)合， 抑制胰島素信號通路， 在IR的發(fā)生、發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用。人參皂苷Rg1是從三七中分離出的一種皂苷類物質(zhì)， 具有抗炎，抗氧化，抗血栓，抗腫瘤，并且能有效降低IR患者的體重和血糖血脂水平的活性[10-11]。另外，人參在治療IR方面有一定療效， 但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制尚不明確。本實驗旨在研究人參皂苷Rg1對高脂飲食誘導(dǎo)的IR大鼠模型中TRB3/AKT信號通路的調(diào)控作用，并對其作用機制進行初步評價，為今后的臨床和基礎(chǔ)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 50只雄性SD大鼠，體重180～200g，基礎(chǔ)飼料及高脂飼料， 由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供生產(chǎn)許可證：SCXK(滇)K2015-0002。

1.2 供試品 人參皂苷Rg1購自上海研生公司，純度99.6%。

1.3 試劑 葡萄糖(Glucose)(生產(chǎn)批號：20090626)、甘油三酯(TG)(生產(chǎn)批號：201207342)、總膽固醇(TC)(生產(chǎn)批號：2400512)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)(生產(chǎn)批號：2401095)等測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；胰島素(Insulin)(生產(chǎn)批號：CSB-E05071m)、丙二醛(MDA)(生產(chǎn)批號：201302671)、超氧化物歧化酶(SOD)(生產(chǎn)批號：201308802)、谷胱甘肽(GSH)(生產(chǎn)批號：20130731)、白介素-6(IL-6)(生產(chǎn)批號：20131491)、白介素-1β(IL-1β)(生產(chǎn)批號：2012527)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)(生產(chǎn)批號：2014727)測定試劑盒均購自武漢欣博盛公司；組織RNA提取試劑盒(生產(chǎn)批號：52304)均購自德國Qiagen公司)；mRNA Random逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(生產(chǎn)批號：2013527)均購自美國Thermo Fisher公司。引物基因合成(上海生工公司)；熒光QPCRmix染料(生產(chǎn)批號：K5053200)(瑞士Roche公司)；兔抗Anti-TRB3(生產(chǎn)批號：CST-4764S)、Anti-p-AKT(473)(生產(chǎn)批號：CST-5877S)和Anti-AKT單克隆抗體(生產(chǎn)批號：CST-1311S)(美國Cell Signaling Technology公司)；羊抗兔辣根酶標(biāo)記過氧化物酶二抗(生產(chǎn)批號：501101)(北京中杉金橋公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(生產(chǎn)批號：2009071)(美國Millipore公司)。

2 方法

2.1 分組 大鼠分籠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為SPF清潔級，給予通風(fēng)、安靜的飼養(yǎng)環(huán)境，溫度 (23±2)℃，相對濕度為(55±2)%，監(jiān)測血糖均正常，所有大鼠均自由飲水及進食，進行適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。隨機分為正常對照組(Control，n=10)、胰島素抵抗組(IR，n=10)以及人參皂苷Rg1低劑量治療組(LD Rg1，n=10)、中劑量治療組(MD Rg1，n=10)以及高劑量治療組(HD Rg1，n=10)。Control組給予普通飼料喂養(yǎng)，IR組和Rg1治療組給予高脂飼料喂養(yǎng)，4周后，分別對LD Rg1、MD Rg1和HD Rg1治療組大鼠予以Rg1 25 mg/kg·d、 50 mg/kg·d和100 mg/kg·d灌胃治療，同時IR組大鼠予以相同體積生理鹽水灌胃，4周后處死大鼠，收集樣本。

2.2 取材 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4mL/100g體重)，心臟快速取血，靜置約1h后，4℃ 3500 r/min離心15 min，收集血清。處死大鼠，收集骨骼肌組織存于-80℃冰箱。

2.3 血清相關(guān)指標(biāo)檢測 Glucose、TG、TC和LDL-c的含量采用比色法檢測； Insulin、MDA、SOD、GSH、IL-6、IL-1β 以及TNF-α的含量采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測，Thermo Multiskan GO 1510全波段酶標(biāo)儀讀數(shù)，具體步驟參照試劑盒詳細說明書。

2.4 RT-qPCR檢測 取18～20mg骨骼肌組織，研磨后提取組織總RNA，定量后每個樣本各取2μg反轉(zhuǎn)錄隨機cDNA，加入熒光PCR mix進行目的片段擴增，引物設(shè)計為TRB3 Forward primer：5′-CTCTTGGGGTGATGCTCCTT-3′， Reverse primer：5′-TCATCCTCCCCCAGTTCAAC-3′，Product length：145bps；AKTFoward primer：5′-CCGCCTGATCAAGTTCTCCT-3′，Reverse primer：5′-TTCAGATGATCCATGCGGGG-3′，Product length：118bps；β-actinFoward primer：5′-TGAGCTGCGTTTTACACCCT-3′，Reverse primer：5′-GCCTTCACCGTTCCAGTTTT-3′，Product length： 198bps。PCR擴增反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10s、退火：60 ℃ 30s、72 ℃延伸35s，循環(huán)次數(shù)40次，72 ℃最后再延伸5 min。采用熒光定量PCR相對定量分析法 2-ΔΔCT法進行統(tǒng)計分析。

2.5 Western blot檢測 取骨骼肌組織約100 mg加入組織裂解液勻漿，BCA法測定總蛋白含量，取40 μg蛋白質(zhì)樣本進行SDS-PAGE電泳，采用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2h后加入一抗，4℃過夜，洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗孵育，洗滌后與ECL發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光洗片，掃描圖像后用Image J軟件計算各條帶的吸光度值，以β-actin作為內(nèi)參進行標(biāo)準(zhǔn)對照。每組實驗重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 胰島素抵抗指數(shù) 血清Glucose和Insulin的含量檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，IR組大鼠血清中Glucose含量、Insulin含量以及HOMA-IR都明顯升高(P<0.05)，經(jīng)人參皂苷Rg1治療后，各項指標(biāo)均下降明顯(P<0.05)，且隨人參皂苷Rg1劑量的增加，改善效果更加明顯。見表1。

表1 人參皂苷Rg1治療后大鼠HOMA-IR比較

注：與Control組比較，#P<0.05；與IR組比較，*P<0.05。

3.2 炎癥指標(biāo) 與Control組相比，IR組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量增加明顯(P<0.05)；經(jīng)人參皂苷Rg1治療后，各項指標(biāo)均下降明顯(P<0.05)，且隨人參皂苷Rg1劑量的增加，改善效果更加明顯。見表2。

表2 人參皂苷Rg1治療后大鼠炎癥因子

注：與Control組比較，#P<0.05；與IR組比較，*P<0.05。

3.3 血脂 與Control組相比，IR組血清中的TC、TG和LDL-C升高(P<0.05)，人參皂苷Rg1治療后，大鼠血清中的TC、TG和LDL-C降低(P<0.05)，且隨Rg1劑量的增加，上述血脂指標(biāo)的含量逐漸降低。見表3。

表3 人參皂苷Rg1治療后大鼠血清血脂指標(biāo)比較

注：與Control組比較，#P<0.05；與IR組比較，*P<0.05。

3.4 氧化和抗氧化指標(biāo) 與Control組比較，IR組大鼠血清中氧化指標(biāo)MDA的含量升高明顯(P<0.05)，經(jīng)人參皂苷Rg1治療后MDA的含量降低(P<0.05)，且隨Rg1劑量的增加，MDA的含量逐漸降低；與Control組比較，IR組大鼠血清中抗氧化指標(biāo)SOD和GSH的含量下降(P<0.05)，經(jīng)人參皂苷Rg1治療后SOD和GSH的含量增多(P<0.05)，且隨Rg1劑量的增加，SOD和GSH的含量升高更加明顯。見表4。

表4 人參皂苷Rg1后大鼠氧化和抗氧化指標(biāo)比較

注：與Control組比較,#P<0.05;與IR組比較,*P<0.05。

3.5 TRB3和AKT的mRNA表達 各組大鼠骨骼肌組織經(jīng)RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)：與Control組比較，IR組大鼠骨骼肌TRB3的mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，經(jīng)人參皂苷Rg1治療后，TRB3的mRNA表達水平下降(P<0.05)，且隨Rg1劑量的增加，下降更加明顯；而AKT的mRNA水平在各組大鼠骨骼肌組織中的表達變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

3.6 TRB3和AKT的蛋白表達以及磷酸化程度 與Control組比較，IR組大鼠骨骼肌TRB3的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，經(jīng)人參皂苷Rg1治療后，TRB3的表達水平下降(P<0.05)，且隨Rg1劑量的增加，下降更加明顯，與RT-qRCR結(jié)果一致；AKT的總蛋白水平在各組大鼠骨骼肌組織中的表達變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而與Control組相比，IR組大鼠骨骼肌組織中p-AKT(473位點)的表達水平顯著降低(P<0.05)，Rg1治療后，大鼠骨骼肌組織中AKT的磷酸化水平升高(P<0.05)，且具有劑量依賴性(圖2)。

4 討論

隨著人們生活水平的提高，糖尿病，脂肪肝，肥胖癥等代謝性疾病的發(fā)生不斷年輕化，發(fā)病率也日漸增長，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。研究表明，IR在上述疾病發(fā)生發(fā)展的過程中起到重要作用[12-14]，因此研究IR的發(fā)病機制以及尋找有效的治療方法刻不容緩。體內(nèi)胰島素水平長期的相對缺乏不僅會引起高血糖，還經(jīng)常會伴有脂質(zhì)代謝紊亂現(xiàn)象，其典型表現(xiàn)為血清 TG、 TC和LDL-C的升高。根據(jù)我國臨床IR患者高碳水化合物飲食的特點，建立高脂飲食誘導(dǎo)的IR大鼠模型，通過HOMA-IR、血脂含量和炎癥因子等指標(biāo)來評價成模情況。本實驗結(jié)果顯示經(jīng)過4周的高脂飼料喂養(yǎng)，與Control組比較，IR模型組大鼠血清中Glucose含量、Insulin含量以及HOMA-IR都升高明顯(P<0.05)；IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥因子的含量增加明顯(P<0.05)；TC、TG和LDL-C等血脂指標(biāo)均明顯升高(P<0.05)，與前述結(jié)果一致，提示造模成功。另有研究表明，氧化應(yīng)激被廣泛認(rèn)為是許多疾病的一個重要特征，骨骼肌和肝臟中的抗氧化能力的降低、脂肪酸氧化不足，可以引起或加重IR[15]，本文結(jié)果表明，IR組大鼠機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物MDA增多，而SOD和GSH得活性及清除自由基的能力下降，IR大鼠存在氧化應(yīng)激反應(yīng)。三七為傳統(tǒng)中藥，普遍用于治療心腦血管疾病、保護肝臟功能、抗炎癥反應(yīng)、增強抵抗力等。而人參皂苷 Rg1 是三七的主要有效單體成分之一，具有極強的抗氧化能力[16]。研究中，IR模型組大鼠經(jīng)灌胃治療后，HOMA-IR、血脂含量、炎癥因子及氧化因子MDA含量都明顯降低，抗氧化因子SOD和GSH含量都明顯升高，且具有劑量依賴性，也從一定程度上驗證了人參皂苷Rg1降血脂、清除自由基、抗炎、抗氧化的藥理作用。

TRB3是一種在細胞內(nèi)調(diào)節(jié)能量代謝的蛋白質(zhì)分子， 廣泛存在于骨骼肌和肝臟等組織中。文獻報道[17-19]， TRB3 在不同物種體內(nèi)的表達水平也存在差異，在人和鼠的中表達最高。過往研究發(fā)現(xiàn)，Akt /PKB 分子在胰島素信號傳導(dǎo)通路上發(fā)揮著重要作用，其磷酸化水平改變可直接影響IR的發(fā)展程度，而TRB3 能夠通過抑制Akt(Serine473) 位點的磷酸化水平，干擾胰島素信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致 IR的發(fā)生；TRB3還可以通過干擾 Akt 的轉(zhuǎn)膜，干擾其和細胞膜上相應(yīng)信號位點的結(jié)合，從而阻斷胰島素信號通路的傳導(dǎo)。筆者發(fā)現(xiàn)T2DM 患者的骨骼肌中 TRB3 蛋白水平明顯升高，骨骼肌TRB3蛋白的表達水平與大鼠IR程度呈正相關(guān)。骨骼肌細胞中TRB3的高表達阻礙了胰島素刺激的糖轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致胰島素信號通路中Akt的磷酸化受損，骨骼肌細胞中的高糖環(huán)境及胰島素缺乏都會增加TRB3 mRNA及蛋白的表達。經(jīng)RT-qPCR及Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：與Control組比較，IR組大鼠骨骼肌TRB3的mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，經(jīng)人參皂苷Rg1治療后，TRB3的表達水平下降(P<0.05)，且隨Rg1劑量的增加，下降更加明顯；AKT的mRNA和蛋白水平在各組大鼠骨骼肌組織中的表達變化不明顯(P>0.05)。而與Control組相比，IR組大鼠骨骼肌組織中p-AKT(Ser473位點)的表達水平明顯降低(P<0.05)，Rg1治療后，大鼠骨骼肌組織中AKT的磷酸化水平升高(P<0.05)，且具有劑量依賴性，表明人參皂苷Rg1可能通過調(diào)控骨骼肌TRB3/AKT信號通路改善大鼠IR。

綜上所述，高血糖、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝紊亂及氧化應(yīng)激都參與了大鼠IR的發(fā)生與發(fā)展，骨骼肌TRB3/AKT信號通路在IR的病變過程中起著至關(guān)重要的作用。人參皂苷Rg1可以降低機體HOMA-IR、減輕炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)、改善血脂，并通過調(diào)控骨骼肌TRB3/AKT信號通路保護大鼠骨骼肌代謝，治療IR。

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The Molecular Mechanism of Ginsenoside Rg1 Alleviates Insulin Resistance by Regulating the TRB3/AKT Signal Pathway

ZHENG Yongren1WANG BO1LIU Chuanfeng2YANG Xiaomi1*

1.Scientific Research Experiment Center of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China;2.Yunnan Baiyao Group Corporation Limited,Kunming 650500,China

Objective To investigate the effect of ginsenoside Rg1 protect the skeletal muscle of rats, and discuss the molecular mechanism of Rg1 ameliorates the insulin resistance through the TRB3/AKT signal pathway.Methods 50 male SD rats were divided into five groups randomly.The rats in control group were feed on an ordinary chow, and the rats in IR, LD Rg1, MD Rg1, and HD Rg1 groups were fed with a high-fat diet.After 4 weeks, the rats of treatment groups were treated with ginsenoside Rg1 (25 mg/kg·day, 50 mg/kg·day and 100 mg/kg·day) by gavage respectively, while the rats of IR group

normal saline with the same method, all of the rats were sacrificed after 4 weeks, the serums and skeletal muscle tissues were collected.The related factors were determined by ELISA, RT - qPCR and Western blott respectively.Results Compared with the control group, the concentrations of TG, TC, LDL-C, HOMA-IR, MDA, TNF-α, IL-6 and IL-1β in the serum of the rats of the IR group were upregulated, and downregulated obviously after Rg1 treatment for 4 weeks (P<0.05), the concentrations of GSH and SOD in the serum of the rats of the IR group were downregulated, and increased after Rg1 treatment (P<0.05); Compared with the control group, the expression levels of mRNA and protein of TRB3 in the skeletal muscle tissues of IR group were increased(P<0.05), after Rg1 adminisration for 4 weeks, the expression levels of TRB3 were decreased obviously(P<0.05), the phosphorylation levels of AKT were upregulated(P<0.05), the effect of ginsenoside Rg1 has a dose-dependent manner.Conclusion Ginsenoside Rg1 is capable to alliviate the HOMA-IR, dyslipidemia, inflammatory and oxidative stress and ameliorate the IR by regulating the the TRB3/AKT signal pathway in skeletal muscle.

Ginsenoside Rg1;Insulin Resistance;Skeletal Muscle; TRB3; AKT

云南省教育廳科學(xué)研究基金一般項目(NO:2014Y245)。

鄭永仁(1965-)，男，漢族，本科，高級實驗師，研究方向為實驗動物和動物實驗。E-mail：404713576@qq.com

楊曉密(1979-)，女，漢族，碩士研究生，實驗師，研究方向為動物實驗和實驗動物管理。E-mail：12986263@qq.com

R285.5

A

1007-8517(2017)13-0033-06

2017-04-15 編輯：梁志慶)