細(xì)粒棘球絳蟲感染宿主免疫應(yīng)答特征

曹建平+王瑩+潘偉+張璟+沈玉娟

1重要寄生蟲病防控現(xiàn)狀及防控效果

2007年，我國宣布消除絲蟲病，并得到世界衛(wèi)生組織的確認(rèn)。近年來，我國本地瘧疾疫情顯著下降，如今90%以上的病例都是輸入性的，即主要是通過援非或出國務(wù)工感染后回國發(fā)病病例，我國2010年實(shí)施瘧疾消除計(jì)劃，將于2020年消除瘧疾。血吸蟲病例近年來也是大幅度減少，血吸蟲病消除的難度比瘧疾大，但我國計(jì)劃2030年消除血吸蟲病。血吸蟲感染免疫研究得到很大發(fā)展，血吸蟲感染后宿主產(chǎn)生Th1細(xì)胞為主的免疫應(yīng)答，但隨著蟲卵的產(chǎn)出，誘導(dǎo)了以Th2細(xì)胞為主的免疫應(yīng)答；在蠕蟲感染宿主以后，對(duì)宿主免疫功能的影響非常大。即使給小鼠進(jìn)行了疫苗免疫，血吸蟲感染后也會(huì)使免疫系統(tǒng)“無能”。近年來在Th1細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了Th17細(xì)胞，在Th2細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了Tfh細(xì)胞。對(duì)宿主免疫應(yīng)答及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，必將有力推動(dòng)血吸蟲病防治研究的進(jìn)展。

對(duì)于包蟲病，雖然我國一直重視，但真正作為重大疾病給予關(guān)注是在2006年以后，國家實(shí)施全面戰(zhàn)略防控，在2008年已經(jīng)擴(kuò)大到各個(gè)流行?。ㄊ校⒆灾螀^(qū)。如今包蟲病被列入重大疾病目錄，這對(duì)包蟲病的防控來說是非常好的機(jī)遇，當(dāng)然也面臨巨大的挑戰(zhàn)，開展流行區(qū)特別是青藏高原流行區(qū)包蟲病綜合防治策略研究有助于我國包蟲病防控科技支撐和可持續(xù)發(fā)展。同時(shí)“One Health”理念要求人醫(yī)和獸醫(yī)等多部門合作是我國包蟲病得到有效控制的關(guān)鍵。

目前我國是包蟲病危害最嚴(yán)重的國家，人畜經(jīng)濟(jì)損失占全球40%，居全球首位，它不僅影響畜牧業(yè)發(fā)展，也嚴(yán)重危害群眾健康，導(dǎo)致貧病交加，阻礙農(nóng)牧民脫貧致富，影響疫區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定。棘球蚴病在我國主要流行于西部的農(nóng)牧區(qū)，其中西藏、四川西部、青海、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙和新疆等地最為嚴(yán)重，流行區(qū)面積占全國總面積的44%[1]。棘球蚴可在人體長期存活，提示其形成了完善的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制以逃避宿主免疫應(yīng)答。深入研究其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制將為開發(fā)基于免疫手段的防控和治療策略提供新的思路。

我們以細(xì)粒棘球絳蟲為研究對(duì)象，著重從原頭節(jié)感染對(duì)小鼠免疫細(xì)胞功能的影響以及成蟲的排泄分泌物（ES）對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用入手，探討細(xì)粒棘球絳蟲感染宿主的免疫應(yīng)答特征。

2細(xì)粒棘球蚴感染對(duì)小鼠免疫細(xì)胞功能的影響

棘球蚴感染可誘發(fā)免疫抑制，下調(diào)宿主免疫應(yīng)答。目前對(duì)棘球蚴中原頭節(jié)的研究多是從分子或疫苗免疫等方面進(jìn)行，我們采用多色流式細(xì)胞術(shù)全面地監(jiān)測了棘球蚴感染小鼠免疫細(xì)胞功能的變化。在免疫細(xì)胞的表型方面，樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞的激活對(duì)誘發(fā)機(jī)體正向免疫應(yīng)答是非常關(guān)鍵的，如果功能受到影響，免疫力一定會(huì)受影響。CD86主要是抗原遞呈細(xì)胞激活的標(biāo)志，其表達(dá)上調(diào)提示抗原遞呈細(xì)胞成熟；而MHC-II分子主要是將抗原遞呈給T細(xì)胞，誘發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)棘球蚴感染后MHC-II、CD86等分子的表達(dá)逐漸下調(diào)，可能會(huì)影響抗原遞呈細(xì)胞功能的發(fā)揮。

在細(xì)胞活化方面，CD69主要表達(dá)是在激活細(xì)胞表面，其表達(dá)上升表明細(xì)胞被激活；CD62L是初始T細(xì)胞表面的一個(gè)標(biāo)志，其表達(dá)下降，則提示T細(xì)胞成熟；而CD40L表達(dá)在成熟T細(xì)胞表面，可與抗原遞呈細(xì)胞表面的CD40相結(jié)合，為傳遞抗原遞呈細(xì)胞信號(hào)給T細(xì)胞提供第二信號(hào)。

研究發(fā)現(xiàn)，棘球蚴感染后T細(xì)胞的CD62L表達(dá)下降、CD69及CD40L表達(dá)上調(diào)，提示感染導(dǎo)致T細(xì)胞的活化，這對(duì)機(jī)體正向免疫應(yīng)答是有益的。然而，T細(xì)胞的增殖能力下降。我們發(fā)現(xiàn)感染小鼠體內(nèi)其他的免疫抑制性細(xì)胞亞群比例增加，比如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、髓源性抑制細(xì)胞（MDSC），這些細(xì)胞的存在可能抑制活化的T細(xì)胞發(fā)揮功能。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)棘球蚴感染后宿主免疫應(yīng)答非常復(fù)雜：抗原遞呈細(xì)胞活化標(biāo)志表達(dá)下降，可能無法正常遞呈抗原；T細(xì)胞雖被激活，但存在免疫抑制性細(xì)胞影響其發(fā)揮細(xì)胞免疫應(yīng)答[2]。

3細(xì)粒棘球絳蟲原頭節(jié)的分泌蛋白質(zhì)組學(xué)解析

原頭節(jié)是細(xì)粒棘球絳蟲的幼蟲階段，具有“雙向發(fā)育”的能力，能夠感染、適應(yīng)多種哺乳動(dòng)物宿主，而ES在蟲體建立感染過程中至關(guān)重要，因此深入了解其組分將為該寄生蟲的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。然而，由于ES成分復(fù)雜，蛋白表達(dá)豐度不一，以及宿主蛋白的干擾等原因，利用蛋白質(zhì)組學(xué)不能完全解析ES組分。我們利用Roche 454 GS-FLX Titanium技術(shù)獲得了原頭節(jié)的轉(zhuǎn)錄組，結(jié)合生物信息學(xué)方法重點(diǎn)分析了潛在ES的種類及功能。

本研究共獲得26，514條Unigene基因，其中，22，910條（86.4%）成功地比對(duì)到新近發(fā)布的細(xì)粒棘球絳蟲基因組序列，17，705條（66.8%）分布在序列編碼區(qū)域，表明本試驗(yàn)的測序結(jié)果可靠。從原頭節(jié)轉(zhuǎn)錄本中共預(yù)測到2，280條ES，其中，138、124條分別參與碳水化合物、蛋白質(zhì)代謝。對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其中11種ES作為胞內(nèi)酶參與調(diào)節(jié)糖酵解/糖異生作用，提示原頭節(jié)具有獨(dú)立的碳水化合物代謝能力；高表達(dá)的ES轉(zhuǎn)錄本包括44種抗原性蛋白、25種分子伴侶和4種蛋白酶。此外，一些ESPs參與發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路，如TGF-β受體通路和insulin信號(hào)通路等。對(duì)上述高表達(dá)的ES分子進(jìn)行深入探討，將可能發(fā)現(xiàn)新的具有診斷及干預(yù)價(jià)值的靶標(biāo)。

本試驗(yàn)表明，原頭節(jié)分泌的ES不僅參與介導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答，而且參與碳水化合物代謝、抵抗不利的宿主內(nèi)環(huán)境以及參與發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路[3]。研究結(jié)果將深化寄生蟲生理適應(yīng)性的認(rèn)識(shí)，為包蟲病診斷、疫苗、藥物新靶標(biāo)的篩選提供新的思路。

4細(xì)粒棘球絳蟲排泄分泌物的免疫學(xué)功能及蛋白質(zhì)組分析

4.1細(xì)粒棘球絳蟲排泄分泌物的免疫學(xué)功能分析

該研究主要是通過髓源性樹突狀細(xì)胞（BMDC）來探討細(xì)粒棘球絳蟲成蟲ES的免疫學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)ES刺激以后，樹突狀細(xì)胞（DC）表面的共刺激分子表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞因子的分泌也顯著減少，不能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的經(jīng)典活化，DC不能被活化，相應(yīng)的免疫應(yīng)答就不能被啟動(dòng)。此外，用CD4+T細(xì)胞與ES預(yù)刺激過的DC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其分泌的細(xì)胞因子與未刺激的對(duì)照組相比無顯著變化，但產(chǎn)生的CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞比例增高。另外，CpG能誘導(dǎo)DC的活化，如果用ES預(yù)刺激DC后再加入CpG，其共刺激分子的表達(dá)量明顯降低，CpG誘導(dǎo)的DC活化被抑制。表明ES能抑制DC的經(jīng)典活化，下調(diào)DC活化T細(xì)胞的能力，誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+ Treg的產(chǎn)生，同時(shí)可以抑制由CpG引起的DC活化，從而抑制DC啟動(dòng)免疫應(yīng)答的能力。因此ES可能是寄生蟲同宿主相互作用中一個(gè)非常重要的部分。endprint

綜上所述，細(xì)粒棘球絳蟲成蟲在不同時(shí)間對(duì)免疫細(xì)胞的影響也不一樣的：①成蟲ES能使MHC-II、CD86、CD80等DC表面標(biāo)記分子的表達(dá)及IL-12等細(xì)胞因子的分泌受到影響，從而抑制DC的活化。而蟲體抗原能誘導(dǎo)DC經(jīng)典活化，表現(xiàn)為增強(qiáng)DC表面共刺激分子MHC-II、CD40、CD86的表達(dá)和IL-6、IL-12P40等細(xì)胞因子的分泌。②抗原預(yù)刺激DC后與小鼠T細(xì)胞共培養(yǎng)，ES預(yù)刺激組T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子與對(duì)照組相比無顯著變化；而蟲體抗原預(yù)刺激組所產(chǎn)生的IFN-γ水平大大增加，IL-4水平明顯降低，表明ES對(duì)DC活化T細(xì)胞的能力有抑制作用，并發(fā)現(xiàn)ES能誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg的產(chǎn)生。③CpG能刺激DC活化，而ES可下調(diào)由CpG誘導(dǎo)的DC活化，顯示出了強(qiáng)大的抑制能力[4]。

4.2細(xì)粒棘球絳蟲ES的蛋白質(zhì)組分析

對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲成蟲ES和蟲體抗原（AWA）進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，首先進(jìn)行雙向電泳，然后采用MALDI-TOF/TOF對(duì)蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，并用犬感染血清進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果從AWA中共鑒定出26個(gè)蛋白分子，從ES中鑒定出8個(gè)蛋白分子；然后經(jīng)免疫印跡分析，進(jìn)一步篩選出12個(gè)具有抗原性的蛋白分子，其中3個(gè)為首次發(fā)現(xiàn)。這些蛋白與寄生蟲生長、發(fā)育、運(yùn)動(dòng)和調(diào)控等都有顯著相關(guān)性[5]。目前對(duì)ES中的四個(gè)分子的克隆表達(dá)及其對(duì)DC功能的影響正在進(jìn)一步研究中。

5結(jié)論

棘球蚴感染以后，可誘發(fā)宿主產(chǎn)生免疫抑制，最終有利于蟲體長期存活。不僅如此，免疫抑制還可能導(dǎo)致一些共感染的發(fā)生，加重患者病情，可能對(duì)診斷造成干擾。此外，蟲體是以包囊存在人體內(nèi)臟中，其厚厚的囊壁本身可能限制一些宿主的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫診斷的敏感性不一定高。在臨床治療中，特異性免疫是否有助于藥物的效果有待研究。在疫苗方面，目前推行在高流行區(qū)進(jìn)行牛羊等的疫苗免疫，有助于包蟲病的控制。此外，對(duì)包蟲病防控成本效益較佳的犬用疫苗亟待研究。對(duì)感染宿主免疫應(yīng)答及其調(diào)控機(jī)制、以及ES的研究，有助于診斷分子、疫苗及藥物靶點(diǎn)的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王瑩，張璟，袁忠英，等.細(xì)粒棘球絳蟲烯醇酶基因克隆、表達(dá)及免疫診斷研究[J].中國血吸蟲病防治雜志， 2012，24（5）： 549-552

[2]Pan W， Zhou H， Shen Y， et al. Surveillance on the status of immune cells after Echinnococcus granulosus protoscoleces infection in Balb/c mice[J]. PLoS ONE， 2013，8（3）： e59746.

[3]Pan W，Shen Y，Han X， et al. Transcriptome profiles of the protoscoleces of Echinococcus granulosus reveal that excretory-secretory products are essential to metabolic adaptation [J]. PLoS Negl Trop Dis，2014，8（12）：e3392.

[4]Wang Y， Zhou H， Shen Y， et al. Impairment of dendritic cell functionandinductionofCD4+CD25+Foxp3+Tcellsby excretory-secretory products： a potential mechanism of immune evasion adopted by Echinococcus granulosus[J]. BMC immunology， 2015， 16（1）： 44.

[5]Wang Y， Xiao D， Shen Y， et al. Proteomic analysis of the excretory/secretory products and antigenic proteins of Echinococcus granulosus adult worms from infected dogs [J]. BMC Veterinary Research， 2015， 11：119 DOI 10.1186/s12917-015-0423-8endprint