精胺和亞精胺對煙草葉片氣體甲醛吸收及生理特性的影響

司志浩 王茹 馮永 郭紅霞 陳悅 陳麗梅

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500）

精胺和亞精胺對煙草葉片氣體甲醛吸收及生理特性的影響

司志浩 王茹 馮永 郭紅霞 陳悅 陳麗梅

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500）

為了研究多胺參與植物應(yīng)答氣體甲醛脅迫的生理特性，以模式植物煙草為實驗材料分析了在氣體甲醛脅迫下分別采用 100 μmol/L精胺和200 μmol/L亞精胺預(yù)處理對煙草葉片甲醛吸收效率、葉綠素含量、過氧化生理指標(biāo)、抗氧化酶系統(tǒng)活性及甲醛代謝的影響。結(jié)果表明：（1）精胺和亞精胺預(yù)處理可以顯著提高煙草對1、3和5 mg/m3氣體甲醛的吸收效率，且精胺的效果好于亞精胺。（2）在氣體甲醛脅迫下，精胺和亞精胺預(yù)處理延緩了煙草葉片中葉綠素b降解，且對過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的積累有抑制作用。此外，精胺和亞精胺預(yù)處理不同程度提高了氣體甲醛脅迫下過氧化物酶（Peroxidase，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性。（3）精胺與亞精胺預(yù)處理對煙草代謝氣體甲醛沒有促進作用。

多胺；煙草；甲醛吸收；甲醛脅迫；抗氧化酶

甲醛（Formaldehyde，HCHO）是一種化學(xué)性質(zhì)極為活潑一碳化合物，植物中內(nèi)源性甲醛來自N-、O-和S-甲基化合物的氧化脫甲基作用［1］。低濃度內(nèi)源性甲醛可以維持植物細(xì)胞中的甲醛循環(huán)［2］，而暴露于甲醛環(huán)境中則會對植物構(gòu)成非生物脅迫，長時間的甲醛脅迫會導(dǎo)致植物葉片萎蔫和黃化，并伴隨葉綠素的降解和細(xì)胞中還原糖含量的變化［3，4］，暴露于較高濃度的氣體甲醛中會減緩植物的生長并降低植物的發(fā)芽率［5］。包括甲醛脅迫在內(nèi)所有非生物脅迫都會誘導(dǎo)植物的氧化脅迫，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量活性氧（Reactive oxygen species，ROS），ROS的過量積累會損傷細(xì)胞內(nèi)DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，引起細(xì)胞內(nèi)丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）含量迅速升高，甚至導(dǎo)致有絲分裂異常、基因突變和細(xì)胞死亡［6］。植物吸收氣體甲醛主要依靠氣孔與環(huán)境之間的氣體交換，甲醛脅迫下植物細(xì)胞中ROS的積累會對植物細(xì)胞造成氧化脅迫，使H2O2在葉片保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中的積累，引起葉片氣孔導(dǎo)度和氣孔開度顯著下降，植物對甲醛的吸收效率也因此下降［7］。

多胺是一類存在于所有植物活細(xì)胞中的脂肪族含氮化合物，廣泛參與植物的鹽脅迫、干旱脅迫、冷脅迫和金屬離子脅迫等非生物脅迫的應(yīng)答［8］。其在生理pH條件下帶正電荷，因此可與帶負(fù)電荷的生物大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和磷脂等相互作用，并參與調(diào)控脂膜的物理化學(xué)性質(zhì)、核酸的結(jié)構(gòu)以及多種酶的活性［9］。精胺（Spermine）和亞精胺（Spermidine）是活細(xì)胞中兩種主要多胺，它們是活性氧的清除劑和關(guān)鍵抗氧化酶的激活劑［10］，有明確的證據(jù)表明，外源施加精胺和亞精胺可以通過調(diào)控抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等的活性緩解非生物脅迫產(chǎn)生的ROS對植物造成的氧化損傷［11，12］。此外，通過基因工程手段將精胺和亞精胺合成途徑的關(guān)鍵酶在多種植物中過量表達(dá)同樣增強了植物對非生物脅迫的抗性［13，14］。

模式植物煙草（Nicotiana tabacum cv. Xanthi）對氣體和液體甲醛具有一定吸收能力，通過遺傳改良提高煙草的甲醛吸收效率與代謝能力的研究也早有報道［15，16］。為了研究多胺預(yù)處理對煙草響應(yīng)氣體甲醛脅迫的影響，本研究采用生理生化的手段分別對煙草植株進行精胺和亞精胺預(yù)處理，通過分析氣體甲醛脅迫后煙草葉片中葉綠素含量、過氧化生理指標(biāo)、4種主要抗氧化酶的活性，以及葉片中代謝產(chǎn)物的變化，考察精胺和亞精胺預(yù)處理能否在緩解氣體甲醛脅迫對煙草葉片造成的氧化損傷同時增強煙草葉片對氣體甲醛的抗性和吸收能力。

1 材料與方法

1.1 材料

以野生型煙草（Nicotiana tabacum cv. Xanthi）的無菌培養(yǎng)植株為實驗材料，煙草種子來自日本京都大學(xué)。

1.2 方法

1.2.1 煙草植株的多胺預(yù)處理 煙草無菌植株在超凈工作臺中繼代于MS固體培養(yǎng)基，于25℃/24 h 光照強度為100 μmol/（m2·s）的組培室中培養(yǎng)30 d，取出植株于MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后用于多胺的預(yù)處理。兩種多胺均以去離子水為溶劑并在電磁攪拌器上充分溶解，處理煙草使用的精胺（100 μmol/L）和亞精胺（200 μmol/L）終濃度均為預(yù)實驗中所確定。多胺預(yù)處理設(shè)置3個實驗組，每組4株煙草，每株鮮重相近且葉片數(shù)相同。采用精胺、亞精胺處理液，以及去離子水分別處理煙草根部4 h后，取出整株煙草用于甲醛脅迫處理。

1.2.2 煙草甲醛吸收率的測定 以自制氣體甲醛吸收測量裝置測定煙草的甲醛吸收效率。實驗操作如下：將預(yù)處理后的4株煙草根部浸于裝有去離子水的組培瓶，并以保鮮膜將組培瓶封口避免水的蒸發(fā)對煙草甲醛吸收的干擾。煙草置于玻璃干燥器（0.025 m3）中，內(nèi)有小型風(fēng)扇保持空氣流動，取少量甲醛溶液（37%）滴加于脫脂棉球，將棉球懸于玻璃干燥器中，以NI-T UT338A 型甲醛測定儀置于干燥器中實時監(jiān)測其中氣體甲醛濃度，分別在甲醛濃度達(dá)到1、3和5 mg/m3時將脫脂棉球取出，用封口膜密封干燥器邊緣，于25℃且光照強度為100 μmol/（m2·s）條件下進行氣體甲醛吸收的測定，每10 min 記錄一次甲醛濃度，并以無煙草的實驗組作為氣體甲醛揮發(fā)對照。

1.2.3 氣體H13CHO對煙草脅迫及葉片代謝產(chǎn)物的標(biāo)記處理 參照1.2.2中方法在自制的氣體甲醛吸收測量裝置中采用高濃度氣體H13CHO（約300 mg/m3）處理煙草植株4 h。處理完畢分別從不同預(yù)處理的實驗組中剪取煙草葉片，用液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?3C-NMR核磁樣品制備參照Sun等［4］的方法。應(yīng)用布魯克核磁共振儀（DRX 500-MHz，中科院昆明植物研究所）進行13C-NMR分析，13C-NMR分析所使用參數(shù)參照Zhou等［17］。將13C-NMR光譜中的共振峰通過與已知化合物的13C-NMR譜進行比對，并利用中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所的化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫檢索進行確認(rèn)，計算不同樣品中各代謝物的相對含量時，目標(biāo)共振峰以甲酰胺碳原子的共振峰（166.66 ppm）為內(nèi)參進行積分。

1.2.4 葉片生理指標(biāo)及抗氧化酶活性的測定

1.2.4.1 葉綠素含量的測定 取上述氣體H13CHO處理后的煙草葉片，預(yù)冷無菌蒸餾水沖洗葉片4-5次后用吸水紙吸干葉片表面殘留的蒸餾水，取0.5 g樣品參照舒展等［18］的方法進行測定。

1.2.4.2 MDA和H2O2含量的測定 分別取-80℃保存的煙草葉片0.2 g測定MDA和H2O2含量。MDA含量測定采用TBA法［19］，H2O2含量采用Gay等［20］的方法。

1.2.4.3 抗氧化酶活性的測定 各取-80℃保存的煙草葉片用于定APX、POD、CAT和SOD四種抗氧化酶活性的測定，不同處理的煙草葉片各取0.2 g，其中APX活性測定參照Nakano［21］方法，POD活性測定參照程鵬等［22］的愈創(chuàng)木酚法方法，CAT活性參考王群等［23］的紫外分光光度方法并有所改進，SOD活性測定采用Vuleta等［24］的氮藍(lán)四唑法。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 上述實驗生理指標(biāo)均設(shè)3組重復(fù)，所測得生理數(shù)據(jù)以及核磁積分?jǐn)?shù)據(jù)采用Exccel 2003進行統(tǒng)計分析，用DPS 7.05對所測得數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 精胺和亞精胺預(yù)處理對煙草甲醛吸收的影響

將煙草分別置于1、3和5 mg/m3濃度的氣體甲醛中，通過甲醛測定儀實時監(jiān)測玻璃干燥皿中剩余的甲醛濃度分析精胺和亞精胺預(yù)處理對煙草吸收氣體甲醛的影響，在3個不同甲醛濃度處理60 min后，甲醛濃度均明顯下降，這說明煙草對氣體甲醛有一定的吸收能力。由圖1-A可知，在1 mg/m3的氣體甲醛中處理時間達(dá)到60 min時，各實驗組中氣體甲醛均降至0，其中，100 μmol/L的精胺和200 μmol/L的亞精胺預(yù)處理對煙草吸收氣體甲醛均有明顯的促進作用，在處理時間為50 min時氣體甲醛濃度已降至0，且精胺預(yù)處理效果好于亞精胺。由圖1-B可知，氣體甲醛濃度為3 mg/m3時，精胺和亞精胺預(yù)處理均顯著提高了煙草吸收氣體甲醛的效率，在處理的前10 min，精胺和亞精胺的效果相當(dāng)，之后的10-60 min精胺效果均好于亞精胺。圖1-C表明精胺和亞精胺預(yù)處理同樣能提高煙草對5 mg/m3氣體甲醛的吸收效率，精胺效果好于亞精胺。因此，在1、3和5 mg/m3濃度的氣體甲醛中精胺與亞精胺能提高煙草對氣體甲醛的吸收效率，且精胺效果均好于亞精胺。由于低濃度的氣體甲醛在短時間內(nèi)不足以對煙草葉片其他生理指標(biāo)產(chǎn)生顯著的可檢出影響，因此采用高濃度氣體甲醛處理4 h的煙草葉片用于后續(xù)葉綠素含量、過氧化生理指標(biāo)及抗氧化酶活性和還原糖含量的測定。

圖1 精胺和亞精胺預(yù)處理對煙草葉片吸收甲醛效率的影響

2.2 精胺和亞精胺預(yù)處理對甲醛脅迫下煙草葉片葉綠素含量的影響

葉綠體是ROS產(chǎn)生的重要場所，過量的ROS會參與破壞葉綠素的Chl-4吡咯環(huán)，加速葉綠素的降解，由圖2-A和2-B可知，與未處理的對照相比，5 mg/m3的氣體甲醛脅迫對煙草葉片中葉綠素a含量的影響并不顯著，葉綠素b則對氣體甲醛脅迫比較敏感，水預(yù)處理的煙草葉片在氣體甲醛脅迫后葉綠素含量下降了31.7%，而精胺和亞精胺預(yù)處理后，煙草葉片中葉綠素b含量則維持與對照組相同的水平。

圖2 精胺與亞精胺預(yù)處理對氣體甲醛脅迫處理后煙草葉片葉綠素a和葉綠素b含量的影響

2.3 精胺和亞精胺預(yù)處理對甲醛脅迫下煙草葉片H2O2和MDA含量的影響

H2O2和MDA含量的變化可以表征ROS對植物的氧化損傷程度，由圖3-A可知，在沒有多胺預(yù)處理時，氣體甲醛脅迫使煙草葉片中H2O2含量顯著升高為對照組的1.2倍，精胺和亞精胺預(yù)處理的煙草葉片中H2O2含量較對照組略微升高，但仍維持對照組的含量水平。由圖3-B可知，氣體甲醛脅迫后水預(yù)處理的煙草葉片中MDA含量升高為對照組的1.4倍，精胺和亞精胺預(yù)處理的葉片中MDA雖然都升高為對照組的1.2倍，但葉片中MDA含量仍顯著低于水預(yù)處理的煙草葉片。

圖3 精胺與亞精胺預(yù)處理對氣體甲醛脅迫處理后煙草葉片MDA和H2O2含量的影響

2.4 精胺和亞精胺預(yù)處理對甲醛脅迫下煙草葉片抗氧化酶活性的影響

POD是植物抗氧化酶系統(tǒng)中以H2O2為底物的一個重要的抗氧化酶。由圖4-A可知，氣體甲醛脅迫下POD活性顯著降低了15%，精胺和亞精胺預(yù)處理過的煙草葉片中POD的活性并未顯著降低，且精胺與亞精胺的作用效果相當(dāng)。由此說明，在氣體甲醛脅迫下，用精胺和亞精胺預(yù)處理煙草植株可以維持葉片的POD活性。

CAT是存在于細(xì)胞過氧化物酶體內(nèi)能催化H2O2分解為O2和H2O的酶，是植物保護酶系統(tǒng)中重要成員，其活性的高低可作為判斷植物應(yīng)答逆境脅迫的能力的依據(jù)。由圖4-B可知，在未受到氣體甲醛脅迫的煙草葉片中，CAT活性較低，氣體甲醛處理則使CAT活性顯著升高為對照組的1.2倍，精胺和亞精胺的預(yù)處理雖然對CAT活性有一定促進作用，但效果不顯著。這些結(jié)果說明氣體甲醛脅迫可以誘導(dǎo)煙草葉片CAT的活性的增強，精胺和亞精胺預(yù)處理煙草植株可以進一步增強煙草葉片CAT活性，但效果并不顯著。

SOD在消除細(xì)胞內(nèi)過量的ROS時發(fā)揮著重要作用，它可催化超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2，是植物抵抗逆境的重要抗氧化酶之一。從圖4-C可知，與未處理的對照相比，氣體甲醛脅迫顯著降低了煙草葉片的SOD活性，其活性較對照組下降了18%。精胺預(yù)處理對SOD并無顯著影響，而亞精胺預(yù)處理的煙草葉片中SOD活性是水預(yù)處理的1.2倍。這些結(jié)果說明氣體甲醛脅迫可以使煙草葉片中SOD活性降低，而用亞精胺預(yù)處理過的煙草植株在受到氣體甲醛脅迫時SOD的活性顯著升高，但精胺預(yù)處理的效果不顯著。

APX在植物細(xì)胞質(zhì)、線粒體、過氧化物酶體和葉綠體中存在多種同工酶。從圖4-D可知，氣體甲醛脅迫后煙草葉片APX活性變化不顯著，精胺和亞精胺預(yù)處理過的煙草中葉片APX活性均提高到對照組的1.2倍，顯著高于對照組和水預(yù)處理的煙草。這些結(jié)果說明氣體甲醛脅迫在短時間內(nèi)會顯著影響煙草葉片中APX活性，精胺和亞精胺預(yù)處理可以增強氣體甲醛脅迫下APX活性。

圖4 精胺與亞精胺預(yù)處理對氣體甲醛脅迫處理后煙草葉片POD（A）、CAT（B）、SOD（C）、APX（D）活性的影響

2.5 精胺和亞精胺預(yù)處理對甲醛脅迫下煙草葉片代謝產(chǎn)物的影響

在煙草葉片的13C-NMR代謝譜中，并未發(fā)現(xiàn)有機酸組成和含量的顯著變化，但兩種還原糖的含量出現(xiàn)顯著變化。由圖5可知，氣體甲醛脅迫使葉片中游離的總葡萄糖（Glucose, Gluc）信號峰［U-13C］Gluc和總果糖（Fructose, Fruc）信號峰［U-13C］ Fruc都顯著低于對照組，其信號積分分別較各自對照組下降了27%和39%，這說明短時間的高濃度氣體甲醛脅迫可以使葉片中的還原糖大量消耗。與對照組相比，精胺預(yù)處理的實驗組中［U-13C］Gluc和［U-13C］Fruc的信號積分分別較各自對照組下降了16%和22%，其中［U-13C］Gluc的信號積分略高于水預(yù)處理的實驗組，［U-13C］Fruc的信號積分則顯著高于水預(yù)處理的實驗組，亞精胺預(yù)處理未對煙草葉片中還原糖的消耗起到緩解作用，［U-13C］Gluc和［U-13C］Fruc的相對積分均與對照組處于同一水平。

圖5 精胺與亞精胺預(yù)處理對氣體甲醛脅迫處理后煙草葉片還原糖含量的影響

3 討論

葉綠體對逆境脅迫十分敏感，葉綠素含量能反應(yīng)植物在逆境脅迫下的生命活力。在葉綠體的類囊體膜和捕光復(fù)合物中都含有不同比例的精胺和亞精胺［25］，有研究顯示甲醛脅迫下擬南芥葉片葉綠素會大量損失，出現(xiàn)黃化和褪色現(xiàn)象，甲醛吸收效率也因此嚴(yán)重降低［26］。本研究結(jié)果表明，葉綠素a在高濃度氣體甲醛中處理4 h后含量出現(xiàn)顯著變化，而精胺和亞精胺預(yù)處理可以將氣體甲醛脅迫下葉片中葉綠素b的含量維持在對照組水平，這說明精胺和亞精胺的預(yù)處理對氣體甲醛脅迫下煙草葉片的葉綠素有一定保護作用，這種保護作用主要是通過減緩葉綠素b的降解來實現(xiàn)。

植物自身的有氧代謝過程會產(chǎn)生ROS，極低濃度的ROS作為信號傳導(dǎo)分子起作用［27］。當(dāng)受到逆境脅迫時，ROS的過量積累會對植物產(chǎn)生毒害作用，使植物細(xì)胞中H2O2和MDA含量升高，其中 H2O2在植物葉片保衛(wèi)細(xì)胞中積累會引起保衛(wèi)細(xì)胞關(guān)閉，植物葉片對甲醛的吸收效率也因此下降［28］。此時植物的抗氧化酶系統(tǒng)的協(xié)同作用對于ROS的清除發(fā)揮著主要作用。通過多胺的外源施加提高植物抗氧化酶活性來抵抗逆境脅迫的研究早有報道，這種促進作用是通過與抗氧化酶結(jié)合或者促進抗氧化酶合成來實現(xiàn)的［29］。在本研究中，4種主要的抗氧化酶POD、CAT、SOD和APX的活性都受到了氣體甲醛脅迫的影響，POD和SOD的活性在氣體甲醛脅迫后出現(xiàn)下降，CAT和APX的活性則不同程度升高。精胺預(yù)處理對POD、CAT和APX活性的提高促進效果較好，亞精胺預(yù)處理則對4種主要抗氧化酶活性的提高都有促進作用，這與Kamiab等［30］通過外源施加精胺和亞精胺提高無花果幼苗的抗氧化酶活性緩解鹽脅迫的研究結(jié)果一致。本研究的結(jié)果同樣表明，在氣體甲醛脅迫前采用一定濃度的精胺（100 μmol/L）和亞精胺（200 μmol/L）預(yù)處理煙草植株對煙草葉片細(xì)胞中H2O2和MDA的積累有顯著的抑制作用。這與Velikova等［31］外源施加精胺和亞精胺緩解了菜豆葉片中H2O2和MDA含量積累的結(jié)果一致，這些結(jié)果表明精胺和亞精胺可以通過調(diào)控抗氧化酶的活性來緩解煙草葉片的氧化損傷，以減少H2O2和MDA的積累，這可能是精胺和亞精胺的預(yù)處理增強了煙草對氣體甲醛脅迫抗性同時促進其甲醛吸收的一種機制。

應(yīng)用精胺和亞精胺預(yù)處理煙草植株根部后，氣體甲醛脅迫下的煙草葉片13C-NMR代謝譜中并未出現(xiàn)有機酸組成和含量的顯著變化，說明精胺與亞精胺預(yù)處理對煙草代謝氣體甲醛無顯著促進作用。此外，在氣體甲醛脅迫下，精胺預(yù)處理可以緩解煙草葉片中還原糖的消耗，減輕煙草葉片的損傷，但亞精胺無此效果。

4 結(jié)論

在氣體甲醛脅迫下，精胺和亞精胺預(yù)處理可以提高煙草葉片細(xì)胞中抗氧化酶系統(tǒng)的活力以清除甲醛脅迫產(chǎn)生的ROS，延緩葉片細(xì)胞內(nèi)過氧化生理指標(biāo)MDA和H2O2積累的同時緩解了葉綠素b的降解，因此避免葉片保衛(wèi)細(xì)胞的大量關(guān)閉，使煙草對氣體甲醛保持了一定的吸收效率。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Effects of Spermine and Spermidine on Gaseous Formaldehyde Absorption and Physiological Property in Tobacco Leaves

SI Zhi-hao WANG Ru FENG Yong GUO Hong-xia CHEN Yue CHEN Li-mei
（Faculty of Life Science and Biotechnology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500）

This work is to investigate the role and the mechanism of polyamine during the plants response to gaseous formaldehyde stress. With pretreatment of 100 μmol/L spermine and 200 μmol/L spermidine to model plant tobacco，the formaldehyde absorption of tobacco leaves，chlorophyll content，physiological indexes of peroxidation，formaldehyde metabolism，and the activities of the four main antioxidant enzymes（POD，CAT，APX and SOD）under gaseous formaldehyde stress were determined. The results showed that：1）The absorption efficiency of tobacco under 1，3 and 5 mg/m3gaseous formaldehyde significantly increased by the pretreatment with spermine and spermidine，and the effect by spermine was better than that by spermidine. 2）Under gaseous formaldehyde stress，the pretreatment of spermine and spermidine delayed the degradation of chlorophyll b，and the accumulations of H2O2and MDA in tobacco leaves were also inhibited. Besides，the activities of POD，CAT，APX and SOD were enhanced at varied degree with the pretreatment of spermine and spermidin under gaseous formaldehyde stress. 3）The pretreatment of spermine and spermidine presented no promotion on the metabolism of gaseous formaldehyde in tobacco.

polyamine；tobacco；formaldehyde absorption；formaldehyde stress；antioxidant enzyme

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0262

2017-04-01

國家自然科學(xué)基金項目（31560071）

司志浩，男，碩士研究生，研究方向：植物生理與分子生物學(xué)；E-mail：szhchn@foxmail.com

陳麗梅，女，博士，教授，研究方向：植物代謝基因工程；E-mail：chenlimeikm@126.com