胰島素通過SCF/KIT信號通路延緩或防止糖尿病小鼠便秘

張國權(quán),王 宇,金 迅,李 輝,江 濤*

(1武警后勤學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室,天津 300309;2蘭州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血管外科;*通訊作者,E-mail:jiangtao-wjhq@sina.com)

胰島素通過SCF/KIT信號通路延緩或防止糖尿病小鼠便秘

張國權(quán)1,王 宇2,金 迅1,李 輝1,江 濤1*

(1武警后勤學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室,天津 300309;2蘭州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血管外科;*通訊作者,E-mail:jiangtao-wjhq@sina.com)

目的 觀察胰島素對糖尿病便秘的作用,探討其可能機(jī)制。 方法 選用生后7-8周的雄性BALB/c小鼠,腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型,將小鼠分為:胰島素組、模型組以及對照組,每組15只。胰島素組小鼠在糖尿病造模成功后即每日給予胰島素進(jìn)行治療,而對照組則每日給予同體積的檸檬酸緩沖液。各組小鼠均在糖尿病造模成功8周后取結(jié)腸,測量結(jié)腸內(nèi)存留糞便的質(zhì)量以及結(jié)腸縱行肌條收縮張力;制備全層鋪片進(jìn)行Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal,ICC)免疫熒光染色;Western blot檢測ICC細(xì)胞KIT受體及其配體SCF的蛋白表達(dá)。 結(jié)果 糖尿病8周時(shí),模型組小鼠結(jié)腸內(nèi)存留的糞便增加,肌層收縮強(qiáng)度明顯減弱,ICC數(shù)量減少,細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞,肌層KIT及SCF的蛋白表達(dá)減少,各項(xiàng)指標(biāo)與對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。胰島素組小鼠結(jié)腸內(nèi)存留的糞便減少,肌層收縮強(qiáng)度顯著增強(qiáng),ICC數(shù)量和KIT及SCF的蛋白表達(dá)均顯著升高,各項(xiàng)指標(biāo)與模型組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。 結(jié)論 糖尿病早期給予胰島素治療可以阻止結(jié)腸ICC細(xì)胞和SCF蛋白表達(dá)的缺失,通過調(diào)控SCF/KIT信號,改善結(jié)腸收縮力,從而延緩或防止糖尿病便秘的發(fā)生。

胰島素; 糖尿病; 便秘; 結(jié)腸動(dòng)力； SCF/KIT信號道路

糖尿病是發(fā)病率較高的一種代謝性疾病,其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢。有調(diào)查顯示,6%-83%的糖尿病人出現(xiàn)胃腸動(dòng)力學(xué)性狀的改變,表現(xiàn)為吞咽困難,進(jìn)食返流,早飽,惡心,嘔吐,腹痛或者便秘等臨床癥狀[1],其中便秘是最常見的糖尿病胃腸道并發(fā)癥[2]。雖然糖尿病便秘本身并不危及患者生命,但嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,影響病人的血糖控制。有關(guān)糖尿病便秘的發(fā)病原因,目前還不完全清楚。近年來越來越多的證據(jù)顯示,Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal,ICC)與胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ICC作為胃腸自主節(jié)律性運(yùn)動(dòng)的起搏細(xì)胞,普遍分布于哺乳動(dòng)物的消化管壁內(nèi)[3]。當(dāng)ICC數(shù)量減少,細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞時(shí),患者可出現(xiàn)胃腸動(dòng)力學(xué)改變的各種臨床表現(xiàn)[4]。在ICC的細(xì)胞膜上有KIT受體,該受體的天然配體是干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF),任何原因?qū)е碌腟CF/KIT信號通路障礙,均可影響ICC的存活和功能,進(jìn)而引起胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙性疾病[5]。

目前有研究認(rèn)為,對于糖尿病患者早期應(yīng)用胰島素治療,可能預(yù)防或延緩各種并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[6]。因此,本研究重點(diǎn)關(guān)注早期應(yīng)用胰島素對糖尿病小鼠便秘的作用以及其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 糖尿病小鼠模型的制備和分組

選用生后7-8周健康雄性BALB/c小鼠,體質(zhì)量22-26 g(購于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,SPF級),經(jīng)過1周的適應(yīng)以后,開始糖尿病造模。造模前15 h小鼠禁食,自由飲水。造模時(shí)一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(購自Sigma公司,No.S0130),劑量為200 mg/kg體質(zhì)量,造模后72 h用血糖儀(ACCU-CHEK?Active,Roche)測定小鼠的空腹血糖,血糖水平高于11.1 mmol/L被認(rèn)為糖尿病造模成功,血糖不高者棄用。將糖尿病小鼠隨機(jī)分為模型組和胰島素組,每組15只。胰島素組小鼠,從測定血糖升高時(shí)每日腹腔注射胰島素治療(諾和靈N,精蛋白生物合成人胰島素注射液,丹麥諾和諾德公司,批號CVG0129),劑量為2.4 IU/只。選用同批次同體質(zhì)量的15只小鼠,腹腔注射同體積的檸檬酸緩沖液作為對照組。對照組、模型組和胰島素組小鼠均在糖尿病造模成功8周后取結(jié)腸,測量結(jié)腸內(nèi)存留糞便的質(zhì)量和結(jié)腸長度,并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 結(jié)腸縱行肌條收縮張力的測定

將小鼠斷頸處死,迅速取出結(jié)腸置于預(yù)冷并充氧的Kreb’s液,沿系膜側(cè)剪開,去除結(jié)腸內(nèi)容物并徹底清洗內(nèi)表面。取結(jié)腸中段縱行肌條(2 mm×10 mm),置于盛有8 ml Kreb’s液的器官浴槽內(nèi),水浴溫度維持在37 ℃,持續(xù)通入95%O2/5%CO2的混合氣體。將肌條固定于張力換能器,給予初始張力為1 000 mg,肌條在器官浴槽內(nèi)平衡60 min,待自發(fā)節(jié)律性運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定后,張力反應(yīng)被與計(jì)算機(jī)相連的應(yīng)變儀連續(xù)記錄(Powerlab biology signal recording system;AD Instruments, Bella Vista,NSW,Australia)。以單位時(shí)間內(nèi)運(yùn)動(dòng)張力曲線面積(運(yùn)動(dòng)指數(shù))為檢測單位(mg×1 min)。

1.3 全層鋪片的制備

將小鼠處死后,快速取出完整結(jié)腸,用預(yù)冷的0.01 mol/L PBS沖洗去除腔內(nèi)容物。結(jié)扎結(jié)腸的一端,用注射器將預(yù)冷的丙酮注入結(jié)腸腔內(nèi),使其維持最大充盈狀態(tài),再結(jié)扎另一端,置入相同固定液中固定24 h。實(shí)驗(yàn)前去除結(jié)扎部分,沿系膜緣剪開腸管,取0.5 cm×0.5 cm大小的樣本,置于平皿中,黏膜面向上。在解剖顯微鏡下,用眼科鑷依次將黏膜層、黏膜下層剝離,再將環(huán)行平滑肌層與縱行平滑肌撕開,并剪成適當(dāng)大小的標(biāo)本塊,置于預(yù)冷的0.01 mol/L PBS中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫熒光染色檢測ICC的數(shù)量及分布

將制備好的全層鋪片標(biāo)本置于裝有0.01 mol/L PBS的6孔板中漂洗3次,然后用0.3% Triton-X 100漂洗10 min,再以1% BSA室溫孵育1 h以降低非特異性,棄去多余的孵育液,滴加0.1% BSA稀釋的一抗(大鼠抗小鼠ACK2,稀釋度1 ∶200,購自eBioscience公司),室溫下濕盒內(nèi)孵育1 h,4 ℃過夜。漂洗3次,再滴加0.1% BSA稀釋的二抗(Cy3標(biāo)記的羊抗大鼠IgG,稀釋度1 ∶200,購自Invitrogen公司),濕盒內(nèi)室溫避光孵育1 h;漂洗3次,水溶性熒光封片劑封片,熒光顯微鏡觀察。

1.5 Western blot檢測結(jié)腸肌層KIT及SCF蛋白表達(dá)

1.6 ICC細(xì)胞計(jì)數(shù)

全層鋪片免疫熒光染色用熒光顯微鏡(Nikon 80i,日本)觀察并拍照。每組取5只動(dòng)物,每個(gè)動(dòng)物計(jì)數(shù)10個(gè)視野,用Image-Plus Pro 6.0軟件(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)計(jì)數(shù)ICC細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸長度與存留糞便的質(zhì)量

糖尿病造模成功8周時(shí),與對照組相比,模型組小鼠結(jié)腸長度(cm)顯著增長(6.2±0.8vs9.8±0.8,P<0.01),同時(shí)腸內(nèi)存留的糞便質(zhì)量(g)也增加(1.6±0.8vs5.4±1.0,P<0.01)。而與模型組相比,胰島素組小鼠結(jié)腸長度(7.5±0.5)顯著縮短(P<0.01),結(jié)腸內(nèi)存留的糞便質(zhì)量(3.3±0.6)也相應(yīng)的減少(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。

圖1 小鼠結(jié)腸長度與存留糞便的質(zhì)量變化Figure 1 The alteration of colonic length and remaining faeces in the mice

2.2 離體結(jié)腸縱行肌條收縮張力的測定結(jié)果

與對照組相比,模型組小鼠在糖尿病造模成功8周時(shí),離體結(jié)腸縱行肌條收縮強(qiáng)度明顯減弱(226.0±20.7vs92.0±19.2,P<0.01,n=5)。而在糖尿病早期給予胰島素治療后,小鼠結(jié)腸肌層收縮強(qiáng)度(216.0±20.7)顯著升高大于模型組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,n=5,見圖2)。

2.3 結(jié)腸ICC全層鋪片免疫熒光染色結(jié)果

結(jié)腸ICC根據(jù)細(xì)胞所在位置可以分為以下類型:肌內(nèi)ICC(intramuscular ICC,ICC-IM),位于環(huán)行肌與縱行肌之內(nèi);肌間神經(jīng)叢周圍的ICC(myenteric ICC,ICC-MY),位于環(huán)行肌與縱行肌之間的肌間神經(jīng)叢周圍;黏膜下ICC(submucosal ICC,ICC-SM),位于黏膜下層,緊貼環(huán)行肌的內(nèi)表面。全層鋪片免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組ICC的突起反復(fù)分支，彼此連接形成獨(dú)立的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)；而模型組ICC細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞突起間形成較為稀疏的網(wǎng)絡(luò)；給予胰島素治療后，ICC細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常(見圖3)。與對照組相比,糖尿病造模成功8周時(shí),模型組小鼠結(jié)腸壁內(nèi)ICC-IM、ICC-MY、ICC-SM的數(shù)量均明顯減少(P<0.01),細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞。而早期給予胰島素治療后,這三個(gè)部位的ICC數(shù)量均又顯著增加,與糖尿病模型組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見表1)。

2.4 Western blot檢測結(jié)腸肌層KIT及SCF蛋白表達(dá)結(jié)果

電泳結(jié)果顯示,與對照組相比,糖尿病造模成功8周時(shí),模型組小鼠結(jié)腸肌層KIT蛋白表達(dá)減少

圖2 小鼠離體結(jié)腸縱行肌條收縮張力的測定Figure 2 The measurement of contractile tension of isolated colonic longitudinal muscle strips in the mice

圖3 結(jié)腸ICC全層鋪片免疫熒光染色Figure 3 Immunofluorescent staining of ICC labeled with ACK2 on whole mount preparation of the mice colon

組別 ICC?IM ICC?MY ICC?SM對照組 41900±453374680±462759800±3834模型組 24920±4531##50200±6300##12860±2569##胰島素組40000±4528??73260±5054??52660±3497??

與對照組比較，##P<0.01；與模型組相比,**P<0.01

(0.91±0.09vs0.29±0.07,P<0.01),而作為KIT蛋白的天然配體,干細(xì)胞因子(SCF)的表達(dá)也相應(yīng)減少(1.05±0.11vs0.43±0.08,P<0.01)。而早期給予胰島素治療后,KIT及SCF的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(KIT蛋白0.77±0.10,SCF蛋白0.95±0.10),與糖尿病模型組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖4)。

圖4 Western Blot檢測結(jié)腸KIT及SCF蛋白表達(dá)Figure 4 Western blot analysis of the expression levels of KIT and SCF proteins in the colon muscle layer

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道,小鼠糖尿病胃輕癱等糖尿病胃腸道并發(fā)癥一般是在糖尿病發(fā)病的4-5周時(shí)出現(xiàn),最晚是在第8周時(shí)出現(xiàn)[7]。我們的研究也發(fā)現(xiàn),在糖尿病造模成功8周后,模型組小鼠結(jié)腸收縮張力減弱,結(jié)腸內(nèi)存留的糞便增多,結(jié)腸長度增加,出現(xiàn)糖尿病便秘的癥狀。而在糖尿病早期就給予胰島素治療后,小鼠結(jié)腸未見明顯的便秘癥狀,提示胰島素可以延遲或者預(yù)防糖尿病便秘的發(fā)生。

胃腸道蠕動(dòng)與Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)密切相關(guān),ICC普遍分布于哺乳動(dòng)物的消化管壁內(nèi),但不同器官的ICC分布存在一定差異。在結(jié)腸壁有3種ICC,即ICC-IM,ICC-MY和ICC-SM,其中ICC-MY和ICC-SM被認(rèn)為具有起搏功能[8,9],可產(chǎn)生電慢波并通過縫隙連接傳遞給相鄰的ICC和平滑肌,引發(fā)平滑肌機(jī)械性收縮。而ICC-IM作為一種傳遞介質(zhì),可將神經(jīng)興奮從腸神經(jīng)系統(tǒng)傳遞給平滑肌細(xì)胞[10]。

酪氨酸激酶受體KIT是由原癌基因c-kit編碼的一種跨膜蛋白,通常表達(dá)于多種細(xì)胞,如造血干細(xì)胞、肥大細(xì)胞、精原細(xì)胞、黑色素細(xì)胞及ICC等。而在哺乳動(dòng)物胃腸道的肌層,KIT主要標(biāo)記于ICC,胃腸道的平滑肌能夠產(chǎn)生KIT受體的天然配體干細(xì)胞因子(SCF),SCF與KIT受體胞外段結(jié)合后,誘導(dǎo)其特定部位的酪氨酸殘基自體磷酸化,并導(dǎo)致PI3K/Akt,Ras/MAPK和STAT等信號途徑的激活[11]。研究發(fā)現(xiàn),SCF/KIT信號通路對體外培養(yǎng)的ICC和哺乳動(dòng)物ICC的存活、分裂、增殖、分化、以及數(shù)量的維持有重要的調(diào)控作用[12,13]。任何原因?qū)е碌奈改c道ICC的數(shù)量減少、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞或SCF/KIT信號通路受損,都會引起胃腸動(dòng)力學(xué)異常。到糖尿病第8周時(shí),模型組結(jié)腸壁內(nèi)不僅具有起搏功能的ICC-MY和ICC-SM數(shù)量減少,同時(shí)作為傳遞介質(zhì)的ICC-IM數(shù)量也相應(yīng)的減少,細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞,KIT和SCF的蛋白表達(dá)降低,SCF/KIT信號通路出現(xiàn)異常,這與以往的文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14,15]。ICC的這些變化和信號系統(tǒng)的異?？赡苁菍?dǎo)致糖尿病時(shí)結(jié)腸平滑肌收縮張力減弱,腸腔內(nèi)糞便堆積增加以及結(jié)腸的長度增加的主要原因。

關(guān)于糖尿病時(shí)胃腸道病變的機(jī)制,有研究認(rèn)為,高血糖是糖尿病胃腸道病變時(shí)ICC異常改變的重要機(jī)制之一,Lin等[16]發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠結(jié)腸ICC的異常不是由于高血糖所致,而是由于內(nèi)源性SCF的缺失,給予外源性的SCF后可以部分恢復(fù)糖尿病小鼠結(jié)腸壁內(nèi)ICC的病理改變。Horvth等[17]也認(rèn)為在糖尿病相關(guān)的胃腸道病變中,ICC的缺失不可能是由于慢性或復(fù)發(fā)性的高血糖所致,而是由于胰島素(insulin)/胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)相關(guān)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙所致。在BALB/c小鼠胃肌層的體外培養(yǎng)中,若在培養(yǎng)基中加入胰島素或IGF-1,則可以完全阻止ICC的減少和維持胃ICC的電慢波[17],這些結(jié)果提示ICC數(shù)量和電活動(dòng)的正常維持,需要胰島素或IGF-I。然而Horvth等[18]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),小鼠胃ICC不表達(dá)SCF,也不表達(dá)Insulin/IGF-1受體,而胃平滑肌不僅表達(dá)Insulin/IGF-1受體,同時(shí)也可產(chǎn)生SCF。小鼠胃ICC的存活依靠SCF信號,但是ICC也需要Insulin/IGF-1的維持,這就提示SCF能夠介導(dǎo)Insulin/IGF-1的作用。在器官培養(yǎng)時(shí),給予Insulin/IGF-1不僅可以阻止ICC的缺失同時(shí)也伴有平滑肌以及SCF表達(dá)的恢復(fù),而且IGF-1是以濃度依賴和時(shí)間依賴的方式刺激結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)SCF的表達(dá)[19],所以我們在糖尿病早期應(yīng)用胰島素治療,可能使得胰島素與結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上的胰島素受體結(jié)合,通過一系列信號途徑(可能是ERK/MAPK信號傳導(dǎo)通路[20])促進(jìn)平滑肌細(xì)胞對SCF的表達(dá),后者再通過SCF/KIT信號,維持ICC的數(shù)量和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的正常,使結(jié)腸平滑肌保持正常的收縮張力,這些結(jié)果提示糖尿病時(shí)早期給予胰島素治療可能會延遲或預(yù)防便秘的發(fā)生,但胰島素對于長期信號紊亂即已經(jīng)發(fā)生的糖尿病結(jié)腸并發(fā)癥的治療效果還需要進(jìn)一步探討。

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Insulin delays/prevents diabetic constipation by SCF/KIT signaling pathway in BALB/c mice

ZHANG Guoquan1,WANG Yu2,JIN Xun1,LI Hui1,JIANG Tao1*

(1DepartmentofHistologyandEmbryology,LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300309,China;2DepartmentofVascularSurgery,SecondAffiliatedHospital,LanzhouMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:jiangtao-wjhq@sina.com)

ObjectiveTo observe the effect of insulin on diabetic constipation in mice and investigate its possible mechanism.MethodsMale BALB/c mice(7-8 weeks old)were selected. The mice were divided into three groups(n=15 for each): insulin group, model group and control group. The mice were intraperitoneally injected with streptozotocin to induce the diabetic model. The mice were administered with insulin daily after the model was induced successfully in insulin group, whereas the mice in control group were given the same volume of citrate buffer solution. The colon was collected at 8 week after the modeling, and then the residual feces and contraction tension of longitudinal muscle strip were measured. ICC quantities were analyzed by immunofluorescent staining in whole mount preparation. KIT and SCF protein expression in colonic muscle layer was detected by Western blot.ResultsAt 8 week after modeling, the residual feces increased, the smooth muscle contractile tension decreased, the ICC decreased, the cellular network was damaged, and KIT and SCF protein expression reduced in model group, and all these indexes was significantly different between model group and control group(P<0.01). Compared with model group, the residual feces decreased in insulin group, the smooth muscle contractility increased in the colon, ICC and KIT and SCF protein expression increased(P<0.05 orP<0.01).ConclusionThe results suggest that early insulin treatment in diabetic mice could prevent depletion of ICC and reduction of SCF protein expression, and ameliorate the colon contractility by regulating SCF/KIT signaling, consequently prevent or delay the development of diabetic constipation.

insulin; diabetes; constipation; colonic motility; SCF/KIT signaling pathway

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31570985);武警后勤學(xué)院博士啟動(dòng)金資助項(xiàng)目(WHB201304)

張國權(quán),男,1973-01生,博士,副教授,E-mail:zhangguoquan2005@163.com

2017-03-21

R587.2

A

1007-6611(2017)07-0665-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.006