二氫楊梅素對(duì)絨癌JAR細(xì)胞MicroRNA373表達(dá)的影響*

王 琳，許 倩，劉 鐳，李玉紅△，朱佳蒙，范興源

（1.承德醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院 2012級(jí)臨床本科）

二氫楊梅素對(duì)絨癌JAR細(xì)胞MicroRNA373表達(dá)的影響*

王 琳1，許 倩1，劉 鐳1，李玉紅1△，朱佳蒙2，范興源2

（1.承德醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院 2012級(jí)臨床本科）

目的:探討二氫楊梅素（DMY）對(duì)絨癌JAR細(xì)胞MicroRNA373表達(dá)的影響。方法：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期絨癌JAR細(xì)胞隨機(jī)分組，DMY終濃度分別為0μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml作用24h，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)JAR細(xì)胞MicroRNA373 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：DMY組JAR細(xì)胞MicroRNA373的表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組；并且，隨著DMY濃度的增加，JAR細(xì)胞MicroRNA373的表達(dá)逐漸升高（P＜0.05）。結(jié)論：DMY可升高絨癌JAR細(xì)胞MicroRNA373的表達(dá)，且呈一定的濃度依賴性。

DMY；MicroRNA373；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；絨毛膜上皮癌

絨毛膜上皮癌簡(jiǎn)稱絨癌，是女性常見(jiàn)的高度惡性腫瘤，病人的死亡率較高，嚴(yán)重影響女性的生殖和健康。目前，絨癌化療效果較好，能顯著提高患者的生存率[1]；但化療藥物具有較大的毒副作用，因此尋找低毒高效的治療藥物具有重大意義[2]。

MicroRNA是一種內(nèi)源性的非編碼雙鏈RNA分子，可通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)或翻譯來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[3]。MicroRNA373是眾多MicroRNA中的一種，在乳腺癌、宮頸癌、肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌及粘液性腸癌等多種腫瘤中均發(fā)揮著基因調(diào)控的作用[4-7]。

二氫楊梅素（DMY）的主要活性成分是黃酮類化合物，具有清除自由基、抗菌、抗腫瘤、護(hù)肝、調(diào)節(jié)血脂血糖、松弛血管平滑肌和抗高血壓等多種生物活性[8-9]；尤其在抗腫瘤方面，DMY具有抗增殖、促凋亡、抑制侵襲等作用[10]，但DMY對(duì)絨癌作用的研究報(bào)道甚少。本研究通過(guò)觀察DMY作用后絨癌細(xì)胞MicroRNA373表達(dá)水平的變化，探討了DMY對(duì)絨癌JAR細(xì)胞MicroRNA373表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 絨癌JAR細(xì)胞，廣州吉尼歐生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶（EDtA），美國(guó)GiBco公司；培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板，美國(guó)Coring公司；MicroRNA373引物，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

DMY，北京恒元啟天化工有限公司。DMY母液（320mg/ml）的配置：精稱40.82mg DMY凍干粉，125ml二甲基亞砜DMSO（DMSO為GiBco高純?cè)噭┤芙夥盅b，-20℃避光保存；DMY工作液（1600μg/ml）的配置：取DMY母液5μl，加培養(yǎng)基995μ l現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 絨癌JAR細(xì)胞于含15% FBS的DMEM中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，常規(guī)消化細(xì)胞后種植到6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，按1:6傳代種板，待細(xì)胞融合度達(dá)30%時(shí)，加入DMY工作液，DMY終濃度分別為60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml，作用24h；同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，空白對(duì)照組細(xì)胞不加DMY，含15% FBS的DMEM常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)JAR細(xì)胞MicroRNA373 mRNA的表達(dá) 加入DMY工作液后JAR細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h。trizol裂解細(xì)胞，常規(guī)提取細(xì)胞總RNA，取1μg總RNA為模板，根據(jù)Micro RNA的特異性設(shè)計(jì)合成反轉(zhuǎn)錄引物（引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1），按照染料法Hairpin-ithsa-miR-373定量試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：25℃孵育30min，42℃孵育30min，85℃孵育5min，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性12s，62℃退火40s，72℃延伸1min，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。同時(shí)，以U6作為內(nèi)參照，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。相對(duì)定量結(jié)果采用2-△△Ct法分析。2-△△Ct=2-（△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct空白對(duì)照組），△Ct實(shí)驗(yàn)組=各實(shí)驗(yàn)組Ct值的均值-對(duì)應(yīng)內(nèi)參U6的均值，△Ct空白對(duì)照組=空白對(duì)照組Ct值的均值-對(duì)應(yīng)內(nèi)參U6的均值。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

JAR細(xì)胞MicroRNA373表達(dá)的變化：DMY三個(gè)濃度組JAR細(xì)胞MicroRNA373的表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組；并且，隨著DMY作用濃度的增加，JAR細(xì)胞MicroRNA373的表達(dá)逐漸升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2：

表2 JAR細(xì)胞MicroRNA373表達(dá)的變化

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是眾多信號(hào)通路復(fù)雜作用的結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA能夠通過(guò)作用于信號(hào)通路中相應(yīng)靶向mRNA，加快其脫腺苷化進(jìn)程進(jìn)而加速mRNA的降解，從而調(diào)控并參與細(xì)胞的凋亡、分化、代謝和增殖。目前，MicroRNA日漸成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。作為MicroRNA的一員，MicroRNA373可參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、分化、侵襲等生物進(jìn)程，且有多項(xiàng)研究顯示，MicroRNA373能作為抑癌基因調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Wang等[11]采用PCR等方法分別檢測(cè)正常宮頸組織和宮頸癌組織MicroRNA373 mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中MicroRNA373的表達(dá)量較高；在對(duì)結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MicroRNA373能夠使致癌因子RAB22A的表達(dá)降低，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]；曲蘊(yùn)慧等[13]發(fā)現(xiàn)，MicroRNA373能通過(guò)介導(dǎo)bcl-6抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力；武衛(wèi)華等[14]也發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞A549中通過(guò)轉(zhuǎn)染的方法過(guò)表達(dá)MicroRNA373，可使鈣粘蛋白E（E-cadherin）的表達(dá)水平增高，從而降低體外培養(yǎng)的人肺癌A549細(xì)胞的遷移能力。

絨癌是一種起源于滋養(yǎng)細(xì)胞的惡性腫瘤，對(duì)化療具有一定的敏感性，但仍有一部分患者由于耐藥、高危和副作用等原因治療效果不理想。如何降低化療藥物的毒性，改善治療效果成為絨癌治療中亟待解決的問(wèn)題。DMY提取于我國(guó)特有的植物—藤茶，初期研究發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、抗氧化、護(hù)肝降糖等作用[9]。近年的抗腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，DMY可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能、抑制腫瘤血管生長(zhǎng)、促凋亡抑增殖、增加化療敏感性等發(fā)揮較強(qiáng)的抗癌作用。DMY可阻滯細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展，使大量腫瘤細(xì)胞停滯在G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成與翻譯，因此，DMY可通過(guò)阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用；另外，DMY還能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和粘附，阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）與其受體相結(jié)合，減慢腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，抑制腫瘤血管生成，從而阻止腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移。本課題組的前期研究亦發(fā)現(xiàn)，DMY可促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡[15]。上述研究結(jié)果提示，DMY可能成為一種新的抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床，但DMY對(duì)絨癌的作用目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，DMY可升高絨癌JAR細(xì)胞MicroRNA373的表達(dá)，且隨著DMY濃度的增加，JAR細(xì)胞MicroRNA373的表達(dá)逐漸升高，呈一定的量效關(guān)系。本研究提示，DMY可能通過(guò)增強(qiáng)抑癌基因MicroRNA373的表達(dá)發(fā)揮抑制絨癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，但此種調(diào)控作用是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞周期還是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，尚需進(jìn)一步的探討。

[1]陳瑜.妊娠合并部分性葡萄胎或絨癌臨床研究分析[J].中外醫(yī)療，2011，30（36）：60.

[2]鄧曉晶，鄧敏，宋育林，等.miRNA-34a對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖凋亡的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50（8）：1090-1094.

[3]Hafez MM,Hassan ZΚ,Zekri AR,et al.MicroRNAs and metastasis -related gene expression in Egyptian breast cancer patients[J]. Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(2):591-598.

[4]劉文稚.miR-373在食管鱗狀細(xì)胞癌中的功能及作用機(jī)制研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2016.

[5]邱鈞.miR-200c、miR-373在乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)及其靶基因分析[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2011.

[6]Eyking A,Reis H,Frank M,et al.MiR-205 and mir-373 are associated with aggressive human mucinous colorectal cancer[J].PLoS One,2016,11(6):e0156871.

[7]Adi Harel S,Bossel Ben-Moshe N, Aylon Y,et al. Reactivation of epigenetically silenced miR-512 and miR-373 sensitizes lung cancer cells to cisplatin and restricts tumor growth[J].Cell Death Differ,2015,22(8):1328-1340.

[8]Rais J,Jafri A,Siddiqui S,et al.Phytochemicals in the treatment of ovarian cancer[J].Front Biosci(Elite Ed),2017,9:67-75.

[9]董倩倩，陳立峰.二氫楊梅素藥理研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2005，3(5)：295-298.

[10]Tang N,Ma J,Wang ΚS,et al.Dihydromyricetin suppresses TNF-alpha-induced NF-kappaB activation and target gene expression [J].Mol Cell Biochem,2016,422(1-2):11-20.

[11]Wang LQ,Zhang Y,Yan H,et al.MicroRNA-373 functions as an oncogene and targets YOD1 gene in cervical cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun,2015,459(3):515-520.

[12]梁敏，史志周，白潔.miR-373與腫瘤相關(guān)研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2013，25(7)：685-689.

[13]曲蘊(yùn)慧，劉紅濤，鄭麗娟，等.微小RNA-373對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響及其機(jī)制[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2017，97（8）：603-607.

[14]武衛(wèi)華.MicroRNA-373誘導(dǎo)E-鈣粘蛋白表達(dá)及其對(duì)肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2011.

[15]孫大永，左彥珍，梁鴻鵠，等.二氫楊梅素對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡的作用[J].解剖學(xué)報(bào)，2015，46（3）：359-362.

(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)欄目編輯：陳志宏)

EFFECTS OF DMY ON MICRORNA373 EXPRESSION IN CHORIOCARCINOMA JAR CELLS

WANG Lin, XU Qian, LIU Lei, et al
(Institute of Oncology, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate the effects of dihydromyricetin (DMY) on MicroRNA373 expression in choriocarcinoma JAR cells. Methods: JAR cells in logarithmic growth phase were treated with different concentrations of DMY (0μg/ml, 60μg/ml, 80μg/ml, 100μg/ml) for 24 hours, then the MicroRNA373 mRNA expression in JAR cells were detected by real time fluorescence quantitative PCR. Results:The MicroRNA373 expression of JAR cells in 3 DMY groups was all obviously higher than blank control group. Moreover, the MicroRNA373 expression gradually increased with increasing of DMY concentration (P＜0.05). Conclusions: DMY can increase the MicroRNA373 expression in choriocarcinoma JAR cells in concentration dependent manner.

Dihydromyricetin (DMY); MicroRNA373; Real time fuorescence quantitative PCR; Choriocarcinoma

R737.33

A

1004-6879（2017）04-0278-03

2016-09-30）

* 河北省高校重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（冀教高【2013】4號(hào)），河北省自然基金項(xiàng)目（H2012406010），河北省計(jì)生委項(xiàng)目（2013-A13），河北省教育廳項(xiàng)目（QN2016012）

△ 通訊作者