靈芝多糖對(duì)小鼠黑素瘤B16F10細(xì)胞分泌VEGF的抑制作用

李 紅，陸 潔，段昕所，齊?；?，孫立新

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,河北 承德 067000）

靈芝多糖對(duì)小鼠黑素瘤B16F10細(xì)胞分泌VEGF的抑制作用

李 紅，陸 潔，段昕所，齊?；?，孫立新△

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,河北 承德 067000）

目的:探討靈芝多糖對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的影響。方法：用不同濃度的靈芝多糖處理B16F10黑素瘤細(xì)胞，以正常培養(yǎng)基代替靈芝多糖培養(yǎng)B16F10黑素瘤細(xì)胞為對(duì)照。分別采用Western blot法和Rt-PCR法檢測(cè)靈芝多糖作用48h后B16F10黑素瘤細(xì)胞VEGF蛋白和mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果：濃度為0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml的靈芝多糖處理B16F10細(xì)胞后，B16F10細(xì)胞VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：靈芝多糖可能通過抑制B16F10黑素瘤細(xì)胞分泌VEGF起到抑制腫瘤的作用。

靈芝多糖；B16F10黑素瘤細(xì)胞；VEGF

黑素瘤(melanoma)是目前首位致死性皮膚腫瘤，發(fā)病率呈急速上升趨勢(shì)，大多見于30歲以上的成年人，可發(fā)生于皮膚、黏膜和內(nèi)臟器官[1]。黑素瘤的主要表現(xiàn)是色素性皮損，在數(shù)月或數(shù)年中發(fā)生明顯改變，雖然發(fā)病率低但惡性程度高，易轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是目前已知活性最強(qiáng)、專屬性最高的促血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，也是腫瘤血管新生過程中重要的始動(dòng)因素。黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移依賴新生血管生成，在惡性黑素瘤中VEGF的表達(dá)水平明顯增高，有利于惡性黑素瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而抑制VEGF的表達(dá)可減少新血管生成，抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖[2-3]。靈芝多糖(GL-PS)是靈芝的主要有效成分之一，大量研究顯示靈芝多糖具有良好的抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能等作用[4-5]。本研究采用不同濃度的靈芝多糖作用于B16F10黑素瘤細(xì)胞，觀察靈芝多糖對(duì)B16F10細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響，以期為黑素瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 靈芝多糖（福州綠谷生物藥業(yè)技術(shù)研究所），Rt-PCR的M-MLV第一鏈合成試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640、trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司），β-actin、VEGF一抗（美國(guó)Santa Cruz公司），PCR試劑盒和引物設(shè)計(jì)(上海生工生物公司)，胎牛血清(FBS，武漢三利生物技術(shù)有限公司)，B16F10黑色素瘤細(xì)胞(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。1.2 細(xì)胞培養(yǎng) B16F10細(xì)胞用含10%胎牛血清、100U/L青霉素和鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)液，37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)4h后更換為正常培養(yǎng)基或靈芝多糖繼續(xù)培養(yǎng)48h用于實(shí)驗(yàn)（靈芝多糖的濃度分別為0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml）。

1.3 B16F10黑色素瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)的檢測(cè)

1.3.1 VEGF蛋白：采用Western blot法。提取細(xì)胞總蛋白，定量，每組各取75μg的總蛋白加入上樣孔，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗（VEGF 1:1000，β-actin 1:1000）4℃孵育過夜，tBSt洗滌后二抗（1:5000）室溫孵育2h，ECL發(fā)光液膠片顯影。膠片掃描膠后的圖像后采用Image J 軟件進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，以VEGF蛋白條帶與β-actin條帶的灰度值比值作為VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 VEGF mRNA：采用Rt-PCR法。引物序列：上游引物為5′-tCtCGCCAtCttttAtCtCCCAG-3′，下游引物為5′-CAGAACCCAAAtCCCGttAttG-3′。trizol提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃ 2min預(yù)變性；然后變性、退火、延伸（94℃ 30s，57℃30s，72℃ 1min），30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 5min延伸。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，BioRad凝膠成像儀采集、分析圖像，以VEGF mRNA條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

濃度為0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml的靈芝多糖處理B16F10細(xì)胞后，VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)明顯低于0μg/ml組（P＜0.05）；靈芝多糖濃度為0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml的B16F10細(xì)胞，VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見附表、圖1-2：

附表 B16F10細(xì)胞VEGF的表達(dá)情況（±s ，n=3)

附表 B16F10細(xì)胞VEGF的表達(dá)情況（±s ，n=3)

與0μg/ml組比較：aP＜0.05；與0.2μg/ml組比較：bP＜0.05

靈芝多糖（μg/ml）VEGF蛋白VEGF mRNA 01.63±0.471.28±0.160.21.77±0.161.13±0.090.80.74±0.07ab0.97±0.08a3.20.82±0.07ab0.88±0.06a12.80.41±0.10ab0.75±0.14ab

圖1 Western blot法檢測(cè)B16F10細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)（1.0μg/ml，2.0.2μg/ml，3.0.8μg/ml，4.3.2μg/ml，5.12.8μg/ml）

圖2 RT-PCR法檢測(cè)B16F10細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)（1.0μg/ml，2.0.2μg/ml，3.0.8μg/ml，4.3.2μg/ml，5.12.8μg/ml）

3 討論

黑素瘤(melanoma)是一種發(fā)生于黑素細(xì)胞的惡性腫瘤，侵襲能力高，致病原因尚未完全闡明，基因、環(huán)境及基因/環(huán)境共同作用等危險(xiǎn)因素與黑素瘤的發(fā)生有關(guān)，出血、瘙癢、壓痛、潰瘍等是黑素瘤的主要臨床表現(xiàn)。黑素瘤容易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移且因?qū)煯a(chǎn)生耐藥而預(yù)后不良，因此需要尋找有效的措施治療黑素瘤[6]。靈芝多糖由肽多糖、葡聚糖、雜多糖等組成，研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤、降血糖及抗糖尿病并發(fā)癥等多方面的作用[7-8]。

研究表明，缺氧是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的主要原因之一。在人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)越活躍、局部代謝就越旺盛，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因缺氧而加強(qiáng)誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成并且使處于休眠狀態(tài)的脈管系統(tǒng)開始脈管芽生[9-12]。足夠的血液供應(yīng)是腫瘤不斷生長(zhǎng)和在轉(zhuǎn)移部位定位生長(zhǎng)所必需的，腫瘤血管新生有利于腫瘤的血供，而VEGF在腫瘤血管新生中具有重要作用，因此，抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)對(duì)于控制腫瘤具有積極意義[13-14]。本研究采用不同濃度的靈芝多糖作用于黑素瘤B16F10細(xì)胞，觀察了B16F10細(xì)胞VEGF蛋白和mRNA表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml濃度的靈芝多糖處理黑素瘤B16F10細(xì)胞，VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)水平明顯降低，說明靈芝多糖具有抑制B16F10細(xì)胞表達(dá)VEGF的作用，這可能是靈芝多糖發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。因此，值得深入探討靈芝多糖的抗腫瘤作用機(jī)制。

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INHIBITORY EFFECTS OF GANODERMA LUCIDUM POLYSACCHARIDES ON VEGF SECRETION IN B16F10 MELANOMA CELLS

LI Hong, LU Jie, DUAN Xin-suo, et al
(the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the effects of Ganoderma lucidum polysaccharides (GL-PS) on secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF) in B16F10 melanoma cells. Methods: B16F10 melanoma cells were treated with or without different concentrations of GL-PS for 48h, then the expression of VEGF protein and mRNA was respectively detected by Western-blot and RT-PCR. Results:Compared with control group, the expression of VEGF protein and mRNA in B16F10 melanoma cells decreased obviously after the B16F10 melanoma cells were treated with different concentrations of GL-PS (0.8μg/ml, 3.2μg/ml, 12.8μg/ml) for 48h (P＜0.05). Conclusions:GL-PS may play a role in inhibiting tumor by inhibiting secretion VEGF in B16F10 melanoma cells.

Ganoderma lucidum polysaccharides;B16F10 melanoma cells;Vascular endothelial growth factor (VEGF)

R33

A

1004-6879（2017）04-0276-03

2016-10-14）

△通訊作者