低淀粉飼糧條件下不同瘤胃降解淀粉水平對體外瘤胃發(fā)酵的影響

雒國彬 王利軍 劉 巖 張廣寧 孫凱晶 王馨影 張永根

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030)

低淀粉飼糧條件下不同瘤胃降解淀粉水平對體外瘤胃發(fā)酵的影響

雒國彬 王利軍 劉 巖 張廣寧 孫凱晶 王馨影 張永根*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030)

本試驗旨在研究玉米作為淀粉來源的低淀粉飼糧條件下不同瘤胃降解淀粉(RDS)水平對體外瘤胃發(fā)酵的影響。以3頭安裝有永久性瘤胃瘺管的健康荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體，各組分別以不同RDS水平飼糧作為發(fā)酵底物，體外產(chǎn)氣法測定培養(yǎng)48 h時產(chǎn)氣量和瘤胃發(fā)酵參數(shù)以及24 h時瘤胃微生物區(qū)系變化。結(jié)果表明：1)隨著飼糧RDS水平的提高，體外培養(yǎng)48 h時產(chǎn)氣量、潛在產(chǎn)氣部分和產(chǎn)氣速率呈線性升高(P<0.05)，快速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量呈線性下降(P<0.05)，干物質(zhì)消失率呈線性升高(P<0.05)；2)隨著飼糧RDS水平的提高，體外培養(yǎng)48 h時發(fā)酵液微生物蛋白、乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度呈線性升高(P<0.05)，pH和氨態(tài)氮濃度沒有顯著變化(P>0.05)；3)隨著飼糧RDS水平的提高，體外培養(yǎng)24 h時發(fā)酵液中白色瘤胃球菌和嗜淀粉瘤胃桿菌的相對數(shù)量呈線性升高(P<0.05)，黃色瘤胃球菌、琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌、牛鏈球菌和溶淀粉琥珀酸單胞菌的相對數(shù)量沒有顯著變化(P>0.05)。綜合考慮，低淀粉飼糧條件下提高RDS水平有利于瘤胃發(fā)酵。

瘤胃降解淀粉；產(chǎn)氣量；瘤胃發(fā)酵；微生物區(qū)系

淀粉是奶牛飼糧中重要的能量來源。淀粉是瘤胃中丙酸生成的前體，同時作為葡萄糖的來源直接在小腸被消化吸收。淀粉占谷物中非結(jié)構(gòu)碳水化合物的70%～80%，通常在瘤胃被迅速降解，幾乎全部被消化(很多谷物淀粉的消化率在90%以上)。谷物在奶牛中被普遍應(yīng)用于滿足奶牛對淀粉和能量的需求。隨著發(fā)展中國家和生物燃料市場對谷物需求量的日益增加，谷物價格持續(xù)上漲。顯然，谷物價格的上漲將會影響到奶牛場的盈利，所以低淀粉飼糧引起牛場經(jīng)營者的關(guān)注。目前普遍推薦泌乳奶牛飼糧淀粉水平為23%～30%(干物質(zhì)基礎(chǔ))[1]。Dann[2]綜述表明，泌乳牛飼糧中副產(chǎn)品飼料(比如豆皮和甜菜顆粒等)替代部分玉米情況下，低淀粉水平(18%～21%)飼糧對奶牛瘤胃發(fā)酵和泌乳性能沒有負面影響。

飼糧淀粉在瘤胃中降解的速率和程度由幾個因素共同決定，包括飼糧淀粉來源、飼糧組成、單次采食量、機械作用(谷物加工和奶牛咀嚼)、化學(xué)作用(糊化度)和瘤胃微生物對飼糧的適應(yīng)程度[3]。NRC(2001)[4]給出了泌乳牛全混合日糧中中性洗滌纖維(NDF)最小推薦量和非纖維性碳水化合物(NFC)最大推薦量，而瘤胃降解淀粉(RDS)水平的變化會影響瘤胃液pH[5]、瘤胃揮發(fā)性脂肪酸(VFA)組成[6-7]、干物質(zhì)采食量(DMI)[5,8-9]、消化率[8,10]、乳脂率[8]和氮利用率[7,11]，所以，飼糧RDS水平會影響飼糧中NDF和NFC的適宜用量，適宜的RDS水平對奶牛生產(chǎn)性能發(fā)揮十分必要。在我國，玉米是奶牛飼糧的主要來源，壓片玉米和粉碎玉米是奶牛場常用的玉米加工和飼喂形式，壓片玉米相比粉碎玉米提高了淀粉的瘤胃降解率(80.3% vs. 67.9%)[12]。本試驗通過改變飼糧中粉碎玉米和蒸汽壓片玉米的比例設(shè)計出3種不同RDS水平的飼糧，通過體外產(chǎn)氣法，研究低淀粉飼糧[淀粉含量約為22%(干物質(zhì)基礎(chǔ))]條件下不同RDS水平對體外瘤胃產(chǎn)氣參數(shù)、發(fā)酵參數(shù)和微生物區(qū)系的影響，為低淀粉飼糧和淀粉在奶牛生產(chǎn)中的有效應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料樣品的制備及成分分析

以玉米作為淀粉來源，參照我國《奶牛飼養(yǎng)標準》[13](NY/T 34—2004)配制3種不同RDS水平的低淀粉飼糧：低RDS水平飼糧(飼糧RDS水平為61.07%，L-RDS組)、中RDS水平飼糧[飼糧RDS水平為67.82%，M-RDS組]和高RDS水平飼糧[飼糧RDS水平為73.74%，H-RDS組]，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

1)每千克預(yù)混料含有One kg of premix contained the following：VA 400 000 IU，VD 40 000 IU，VE 600 IU，Ca 160 g，P 33 g，Na 118 g，Mg 29 g，Zn 2 600 mg，Mn 2 400 mg，Cu 550 mg，Se 12 mg，I 25 mg。

2)泌乳凈能根據(jù)《奶牛飼養(yǎng)標準》[13]計算得出，其他營養(yǎng)水平為實測值。NELwas calculated based onFeedingStandardsofDairyCattle, while the other nutrient levels were measured values.

飼糧RDS水平采用半體內(nèi)尼龍袋法[14]測定。試驗選用3頭帶有永久性瘤胃瘺管的健康中國荷斯坦奶牛[體重：(678±27) kg；產(chǎn)奶量：(20.6±2.5) kg；泌乳天數(shù)：(276±19) d]，試驗牛飼糧由28.9%的玉米青貯、24.2%的羊草和46.9%的精料(均為干物質(zhì)基礎(chǔ))組成。每天飼喂2次，擠奶2次，自由采食與飲水，單欄栓系飼養(yǎng)。飼糧粉碎通過3 mm孔徑篩，準確稱取5 g待測樣品，裝入已知重量標號的尼龍袋(10 cm×20 cm,孔徑為50 μm；Ankom公司提供)，樣品分別在瘤胃中培養(yǎng)0、2、4、8、12、24、48和72 h。尼龍袋瘤胃培養(yǎng)和培養(yǎng)后操作步驟參照Yu等[21]，樣品65 ℃烘48 h，回潮至恒重，粉碎過1 mm孔徑篩用于飼糧淀粉瘤胃降解參數(shù)的測定。飼糧淀粉瘤胃降解參數(shù)見表2。

表2 飼糧淀粉瘤胃降解參數(shù)Table 2 Starch degradation parameters of diets

假設(shè)瘤胃外流速率為6%/h Assuming a rumen outflow rate of 6%/h。

1.2 瘤胃液的采集與處理

2016年6月在黑龍江省雙城市雀巢奶牛養(yǎng)殖培訓(xùn)中心奶牛場選用3頭體重約600 kg的安裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體牛，于晨飼前2 h通過瘤胃瘺管采集瘤胃液，混合后裝于預(yù)加熱保溫瓶中迅速帶回實驗室，將采集的瘤胃液充分混合后經(jīng)4層紗布過濾[過濾同時通入二氧化碳(CO2)]備用，整個操作在39 ℃溫水浴中進行。

1.3 體外發(fā)酵

體外發(fā)酵裝置采用德國Endress+Hauser公司生產(chǎn)的產(chǎn)氣全自動記錄裝置(Cerabar T PMP131，Memograph M RSG40)和軟件系統(tǒng)(奧特奇公司提供)。將試驗所用樣品粉碎并全部通過孔徑為1 mm的樣品篩。準確稱取0.5 g樣品放入150 mL厭氧發(fā)酵瓶中，每組6個重復(fù)，并做3個空白。接種時邊攪拌邊加入已在39 ℃預(yù)熱的緩沖液50 mL和新鮮瘤胃液25 mL，所用液體培養(yǎng)基采用Menke等[15]方法配制，向瓶中持續(xù)通入CO25 s后，將每個產(chǎn)氣裝置的傳感器與數(shù)據(jù)記錄儀相連接，發(fā)酵瓶于39.2 ℃下連續(xù)培養(yǎng)24和48 h。

1.4 樣品收集和預(yù)處理

體外培養(yǎng)24和48 h后各樣品組分別取出3個發(fā)酵瓶，24 h時取10 mL發(fā)酵液快速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱內(nèi)保存，用于微生物總DNA的提取。48 h時結(jié)束發(fā)酵，立即測定發(fā)酵液pH，從發(fā)酵瓶中采集50 mL發(fā)酵液分裝于離心管中，按與發(fā)酵液1∶5的比例添加25%偏磷酸溶液，混勻后于-20 ℃冷凍保存，用于微生物蛋白(MCP)、氨態(tài)氮(NH3-N)和VFA濃度的測定。尼龍袋(孔徑：40 μm;規(guī)格:45 mm×55 mm)過濾體外培養(yǎng)48 h發(fā)酵液，將尼龍袋過濾的濾渣連同尼龍袋在水龍頭下沖洗至水澄清，在65 ℃烘箱內(nèi)烘至恒重，計算樣品的體外干物質(zhì)消失率(DMD)。

1.5 測定指標及方法

干物質(zhì)、粗灰分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和無機物含量的測定參照AOAC(1990)[16]中方法。pH采用Sartorius Basic pH Meter PB-20型酸度計(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)測定。淀粉含量測定采用淀粉葡萄糖苷酶/α-淀粉酶方法，試劑盒購自愛爾蘭Megazyme公司。酸性洗滌纖維(ADF)和NDF含量參照Van Soest等[17]方法，采用Ankom 220纖維分析儀(美國ANKOM公司)測定。

NH3-N濃度采用Broderick等[18]所述的靛酚比色法測定，儀器采用UV-2000型分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)。

MCP濃度采用Makkar等[19]所述的嘌呤法測定，具體方法為：利用酵母RNA制作標準曲線，取8 mL發(fā)酵液在13 200 r/min下離心20 min，進行前處理后利用UV-2000型分光光度計在260 nm波長下進行比色，根據(jù)吸光度(OD)值和標準曲線計算樣品RNA測定值。MCP濃度計算公式為：

微生物蛋白氮濃度(mg/mL)=RNA

測定值(mg/mL)×RNA含氮量(17.83%)/

細菌氮中RNA含氮量(10%)×稀釋倍數(shù)；

MCP濃度(mg/mL)=微生物蛋白氮

濃度(mg/mL)×6.25。

VFA濃度采用日本島津GC-200氣相色譜儀測定[20]，測定時氣譜條件為：氣化室參數(shù)為載氣氮氣(N2)，分流比40∶1，進樣量0.4 μL，溫度220 ℃；色譜柱參數(shù)為HP-INNOwax毛細管色譜柱恒流模式，流量2.0 mL/min，平均線速度38 cm/s；柱溫箱參數(shù)為程序升溫120 ℃(3 min)→10 ℃/min→180 ℃(1 min)；檢測器參數(shù)為氫氣(H2)流量40 mL/min，空氣流量450 mL/min，柱流量+尾吹氣流量45 mL/min，火焰離子檢測器(FID)溫度250 ℃。

微生物區(qū)系測定：采用珠磨-十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取瘤胃微生物總DNA[21]。提取后，用紫外可見分光光度計測定所提取總DNA的濃度和純度，確保260與280 nm處OD的比值在1.6～1.8之間。采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)檢測微生物相對數(shù)量，所用儀器為ABI7500型PCR儀，RT-qPCR的反應(yīng)條件參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑建立20 μL反應(yīng)體系。從瘤胃微生物總DNA中擴增細菌16S rDNA。PCR反應(yīng)體系：10×緩沖液2 μL，10 mmol/L的dNTP 0.4 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL，25 mmol/L的氯化鎂(MgCl2)1.6 μL，模板(瘤胃總DNA)0.4 μL，TaqDNA聚合酶2 μL，雙蒸水(ddH2O)為13.6 μL，總體積為20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃變性7 min，95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。引物序列及參考文獻見表3，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表3 實時熒光定量PCR所用引物Table 3 Primers used for RT-qPCR

1.6 計算公式

根據(jù)瘤胃動力學(xué)數(shù)學(xué)指數(shù)模型計算飼糧RDS水平[27]，運用SAS 9.2非線性回歸最小二乘法對數(shù)據(jù)進行處理。

采用動態(tài)發(fā)酵模型GP=a+b(1-e-ct)[28]，根據(jù)非線性最小二乘法原理，求出a、b和c值，其中a為快速發(fā)酵部分的產(chǎn)氣量(mL)；b為慢速發(fā)酵部分的產(chǎn)氣量(mL)；c為b的產(chǎn)氣速率(%/h)；a+b為潛在產(chǎn)氣量(mL)；GP為t時的產(chǎn)氣量(mL)。

樣本干物質(zhì)消失率(%)=[(樣本質(zhì)量-

殘渣質(zhì)量)/樣本質(zhì)量]×100。

根據(jù)以下公式將瘤胃微生物相對數(shù)量表示為相對于瘤胃總細菌16S rDNA的百分比：

目標菌相對數(shù)量(%)=

2-(Ct目標菌-Ct總細菌)×100。

式中：Ct目標菌為以目標菌引物所測的Ct值；Ct總細菌為以總細菌為引物所得的Ct值。

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件處理后，采用SAS 9.1軟件中MIXED模型進行統(tǒng)計分析，對飼糧RDS水平的線性和二次曲線效應(yīng)進行正交多項式對比分析，P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示具有差異顯著的趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同RDS水平飼糧對體外培養(yǎng)48 h產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣參數(shù)及干物質(zhì)消失率的影響

由表4可知，隨著飼糧RDS水平的提高，體外培養(yǎng)48 h的產(chǎn)氣量、潛在產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率和干物質(zhì)消失率呈線性升高(P<0.05)，快速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量則呈線性降低(P<0.05)。L-RDS組和M-RDS組間的所有指標均不存在顯著差異(P>0.05)。除了快速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量顯著低于L-RDS組(P<0.05)外，H-RDS組的其他指標均顯著高于L-RDS組(P<0.05)。H-RDS組的產(chǎn)氣量和潛在產(chǎn)氣量顯著高于M-RDS組(P<0.05)，兩者間的其他指標無顯著差異(P>0.05)。

表4 不同RDS水平飼糧對體外培養(yǎng)48 h產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣參數(shù)及干物質(zhì)消失率的影響Table 4 Effects of different RDS level diets on GP, gas production parameters and DMD after 48 h in vitro incubation

同行數(shù)據(jù)肩標無字母或相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 不同RDS水平飼糧對體外培養(yǎng)48 h發(fā)酵液pH及MCP、NH3-N、VFA濃度的影響

由表5可知，飼糧RDS水平對發(fā)酵液pH、NH3-N濃度和乙酸/丙酸值沒有顯著影響(P>0.05)。隨著飼糧RDS水平的提高，發(fā)酵液MCP、乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度呈線性升高(P<0.05)，其中M-RDS組除MCP濃度顯著低于H-RDS組(P<0.05)外，其他指標2組間無顯著差異(P>0.05)，而H-RDS組上述指標都顯著高于L-RDS組(P<0.05)。L-RDS組發(fā)酵液MCP、丙酸和丁酸濃度與M-RDS組無顯著差異(P>0.05)，但乙酸和TVFA濃度顯著低于M-RDS組(P<0.05)。

2.3 不同RDS水平飼糧對體外培養(yǎng)24 h發(fā)酵液微生物區(qū)系的影響

由表6可知，隨著飼糧RDS水平的提高，發(fā)酵液中白色瘤胃球菌(R.albus)和嗜淀粉瘤胃桿菌(R.amylophilus)的相對數(shù)量呈線性升高(P<0.05)，其中H-RDS組R.albus和R.amylophilus的相對數(shù)量顯著高于L-RDS組和M-RDS組(P<0.05)，L-RDS組和M-RDS組間差異不顯著(P>0.05)。飼糧RDS水平對發(fā)酵液中黃色瘤胃球菌(R.flavefaciens)、琥珀酸絲狀桿菌(F.succinogenes)、溶纖維丁酸弧菌(B.fibrisolvens)、牛鏈球菌(S.bovis)和溶淀粉琥珀酸單胞菌(S.amylolytica)的相對數(shù)量的影響不顯著(P>0.05)。

表5 不同RDS水平飼糧對體外培養(yǎng)48 h發(fā)酵液pH及MCP、NH3-N、VFA濃度的影響Table 5 Effects of different RDS level diets on fermentation fluid pH and MCP, NH3-N and VFA concentrations after 48 h in vitro incubation

表6 不同RDS水平飼糧對體外培養(yǎng)24 h發(fā)酵液微生物區(qū)系的影響Table 6 Effects of different RDS level diets on fermentation fluid microflora after 24 h in vitro incubation

3 討 論

3.1 不同RDS水平飼糧對體外培養(yǎng)48 h瘤胃產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣參數(shù)及干物質(zhì)消失率的影響

體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量是評定飼料可發(fā)酵程度的重要指標，即飼料的可發(fā)酵性越強，瘤胃中微生物的活性越高，產(chǎn)氣量越大，反之則越少。本試驗體外培養(yǎng)48 h的產(chǎn)氣量隨飼糧RDS水平的提高而升高，這與Palizdar等[29]和張婷等[30]報道的結(jié)果一致，因為飼糧中壓片玉米替代粉碎玉米使淀粉更容易被微生物和酶利用[31]，淀粉降解產(chǎn)生大量能量促進微生物的生長繁殖，提高了發(fā)酵產(chǎn)氣量。本試驗結(jié)果表明高RDS水平飼糧提高了潛在產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率，這與Palizdar等[29]的研究結(jié)果一致，淀粉的快速降解促進微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，促進了發(fā)酵，干物質(zhì)消失率提高提供部分解釋；而快速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量隨飼糧RDS水平的提高呈下降趨勢，可能歸因于飼糧淀粉瘤胃培養(yǎng)可溶部分的降低。

3.2 不同RDS水平飼糧對體外培養(yǎng)48 h發(fā)酵液pH及MCP、NH3-N、VFA濃度的影響

pH作為瘤胃內(nèi)環(huán)境變化的重要指標，受飼糧的組成、唾液分泌量和有機酸的累積等多種因素影響。普遍觀點認為提高可發(fā)酵碳水化合物水平會增加短鏈脂肪酸產(chǎn)量和瘤胃酸中毒的風(fēng)險，導(dǎo)致瘤胃pH降低[32]。本試驗結(jié)果表明飼糧RDS水平對體外培養(yǎng)48 h發(fā)酵液pH沒有顯著影響，這與張婷等[30]的體外試驗的結(jié)果一致。其原因可能是隨著體外培養(yǎng)時間的延長，各組淀粉降解率趨于相似，而pH與淀粉降解的相關(guān)性很高[33]，所以培養(yǎng)48 h時各組間發(fā)酵液pH差異不顯著。瘤胃中NH3-N濃度是反映瘤胃氮代謝的重要指標，其濃度大小可反映蛋白質(zhì)的降解程度和微生物利用氨氮的能力。Murphy等[34]報道微生物發(fā)酵的最佳NH3-N濃度為6.3～27.5 mg/dL，本試驗各組發(fā)酵液NH3-N濃度均在適合微生物發(fā)酵的范圍內(nèi)。本試驗結(jié)果還表明，提高飼糧RDS水平對發(fā)酵液NH3-N濃度的影響不顯著。張婷等[30]研究得出體外發(fā)酵壓片玉米替代粉碎玉米飼糧對發(fā)酵液NH3-N濃度的影響不顯著，本試驗結(jié)果與此一致。而與Zhong等[8]和Aldrich等[35]體內(nèi)試驗報道的通過蒸汽壓片玉米提高RDS水平降低了瘤胃NH3-N濃度的結(jié)果不一致。結(jié)果不一致原因可能是：一方面，谷物加工后增加4～8 h時間段體外培養(yǎng)淀粉降解率[36]，此時能氮釋放同步性能促使微生物生長繁殖和MCP的合成，提高了微生物對NH3-N的利用，而培養(yǎng)時間延長使各組淀粉降解率趨于相似，促使微生物對NH3-N利用能力趨于一致；另一方面，蒸汽壓片技術(shù)破壞玉米蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，提高了蛋白質(zhì)瘤胃降解率[37]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的分解和NH3-N的生成。

本試驗結(jié)果表明提高飼糧RDS水平提高了MCP的合成，與之前Plascencia等[6]和Theurer等[38]的報道一致，MCP合成取決于瘤胃可利用能量和可利用氮的數(shù)量以及發(fā)酵速度的同步性。高飼糧RDS水平下R.albus和R.amylophilus的相對數(shù)量較高，表明高飼糧RDS水平促進了有關(guān)微生物的生長，這可能因為高RDS水平有更高的瘤胃降解有機物水平[39]，為瘤胃微生物生長繁殖提供能量，同時，壓片玉米蛋白瘤胃降解率的提高可能是提高MCP濃度的另一原因。也有相關(guān)報道表明提高飼糧RDS水平對MCP濃度的影響不顯著[11]，結(jié)果不一致可能是由于瘤胃內(nèi)快速降解淀粉降低了瘤胃內(nèi)纖維物質(zhì)消化率，對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生負面效應(yīng)，減少了瘤胃降解有機物水平，影響了MCP的合成。VFA是反芻動物能量代謝的主要能量來源，而乙酸、丙酸和丁酸的量占主要能源物質(zhì)的80%。本試驗發(fā)現(xiàn)，提高飼糧RDS水平可不同程度地提高乙酸、丙酸和丁酸的濃度。張婷等[30]體外試驗表明飼糧中壓片玉米代替普通玉米有升高乙酸濃度的趨勢，使丙酸和丁酸濃度顯著升高，與本試驗結(jié)果類似。而相關(guān)體內(nèi)試驗表明提高飼糧RDS水平降低了乙酸濃度[7]，提高了丙酸濃度[10]，對丁酸濃度無顯著影響[7,10]。試驗飼糧中壓片玉米中淀粉相比粉碎玉米中淀粉更易被微生物和酶利用，淀粉的快速降解導(dǎo)致丙酸濃度升高，而乙酸和丁酸濃度升高可能是由于高RDS水平有更高的瘤胃降解有機物水平[39]，可為微生物生長提供能量，促進了微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的分解，提高了乙酸和丁酸的產(chǎn)量。本試驗結(jié)果表明飼糧RDS水平對乙酸/丙酸值沒有顯著影響，結(jié)果與張婷等[30]所得結(jié)果一致，與Shen等[7]所得結(jié)果不一致，可能是因為不同飼糧情況下RDS對瘤胃發(fā)酵的影響不同，導(dǎo)致了乙酸和丙酸濃度的差異。

3.3 不同RDS水平飼糧對體外培養(yǎng)24 h發(fā)酵液微生物區(qū)系的影響

瘤胃中的纖維分解菌主要有R.flavefaciens、R.albus和F.succinogenes，本試驗結(jié)果表明體外培養(yǎng)24 h發(fā)酵液R.albus相對數(shù)量隨飼糧RDS水平的提高而升高，而各組R.flavefaciens和F.succinogenes相對數(shù)量差異不顯著。李飛[40]研究表明，飼糧中不同比例的小麥替代玉米飼喂奶山羊，瘤胃液中R.flavefaciens相對數(shù)量呈線性下降，F(xiàn).succinogenes相對數(shù)量呈二次曲線變化趨勢，對R.albus相對數(shù)量的影響不顯著。胡紅蓮[41]研究表明，隨著飼糧中玉米比例的提高，奶山羊瘤胃液中3種纖維分解菌(R.flavefaciens、F.succinogenes和R.albus)的相對數(shù)量逐漸下降。上述研究結(jié)果不一致可能是由于瘤胃液pH不同造成的，因為提高可發(fā)酵碳水化合物水平會增加短鏈脂肪酸產(chǎn)量和瘤胃酸中毒的風(fēng)險，導(dǎo)致瘤胃pH降低[32,42]，纖維分解菌普遍對瘤胃pH敏感，當(dāng)pH低于6.0時，瘤胃球菌和F.succinogenes等主要的纖維降解菌的生長將受到抑制[43]。而本試驗中各組發(fā)酵液pH處于正常范圍，同時NH3-N濃度在適合微生物發(fā)酵的范圍內(nèi)，R.albus相對數(shù)量的增長可能是因為高RDS水平提供了更多的瘤胃降解有機物[39]，從而為瘤胃微生物的生長繁殖提供了能量。B.fibrisolvens的不同菌株表現(xiàn)差異較大，有的菌株具有很強的淀粉降解活性，有的菌株具有很強的纖維降解活性，本試驗中各組發(fā)酵液中B.fibrisolvens相對數(shù)量差異不顯著，此結(jié)果與申軍士[44]所得結(jié)果一致。S.bovis、R.amylophilus和S.amylolytica是主要的淀粉降解菌，申軍士[44]研究表明，飼糧中壓片玉米替代粉碎玉米飼喂奶牛，瘤胃液S.bovis相對數(shù)量上升，R.amylophilus相對數(shù)量下降，S.amylolytica相對數(shù)量沒有顯著變化。李飛[40]研究表明，飼糧中壓片玉米替代粉碎玉米飼喂奶牛，瘤胃液S.amylolytica相對數(shù)量升高，對S.bovis和R.amylophilus相對數(shù)量無顯著影響。上述研究結(jié)果不完全一致，可能與飼糧RDS水平和淀粉降解速率的差異有關(guān)，其原因有待進一步研究。

4 結(jié) 論

低淀粉飼糧條件下提高飼糧RDS水平提高了體外培養(yǎng)48 h的產(chǎn)氣量、潛在產(chǎn)氣部分和產(chǎn)氣速率，提高了體外培養(yǎng)48 h發(fā)酵液MCP、乙酸、丙酸、丁酸和TVFA濃度，而對pH和氨態(tài)氮濃度無顯著影響，并提高了體外培養(yǎng)24 h發(fā)酵液白色瘤胃球菌和嗜淀粉瘤胃桿菌的相對數(shù)量。由此得出，低淀粉飼糧條件下提高飼糧RDS水平有利于瘤胃發(fā)酵。

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*Corresponding author, professor, E-mail: zhangyonggen@sina.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)

Effects of Different Ruminally Degradable Starch Levels in Low Starch Diet oninVitroRuminal Fermentation

LUO Guobin WANG Lijun LIU Yan ZHANG Guangning SUN Kaijing WANG Xinying ZHANG Yonggen*

(SchoolofAnimalScienceandTechnology,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

This trial was performed to examine the effects of different ruminally degradable starch levels in the diet with low corn-based starch oninvitroruminal fermentation. Three Holstein cows fitted with permanent rumen fistulas were used as the donor of rumen fluid. Diets with different ruminally degradable starch levels were used as substrates, and the changes of gas production and ruminal fermentation parameters during 48 h incubation were determined usinginvitrogas production method, and the ruminal microflora change during 24 h incubation was also determined. The results showed as follows: 1) with the ruminally degradable starch level increasing, gas production (GP), potential gas production (a+b) and gas production rate constant for “gas production from the slowly soluble fraction (b)” (c) were linearly increased (P<0.05), the gas production from the immediately soluble fraction (a) was linearly decreased (P<0.05), and the dry matter digestibility was linearly increased after 48 hinvitroincubation (P<0.05). 2) With the ruminally degradable starch level increasing, fermentation fluid microprotein (MCP), acetate, propionate, butyrate and total volatile fatty acids (TVFA) concentrations were linearly increased after 48 hinvitroincubation (P<0.05), but the pH and ammoni anitrogen concentration were not significantly changed (P>0.05). 3) With the ruminally degradable starch level increasing, the relative counts ofR.albusandR.amylophilusin fermentation fluid after 24 hinvitroincubation were linearly increased (P<0.05), while the relative counts ofR.flavefacien,F.succinogenes,B.fibrisolvens,S.bovisandS.amylolyticahad no significant changes (P>0.05). It is concluded that incraesing ruminally degradable starch level can improve ruminal fermentation under the condition of low starch diet.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(7)：2482-2491]

ruminally degradable starch; gas production; rumen fermentation; microflora

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.07.033

2016-12-29

國家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-37)

雒國彬(1982—)，男，山東廣饒人，博士研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail: guobinluo@126.com

*通信作者：張永根，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: zhangyonggen@sina.com

S816

A

1006-267X(2017)07-2482-10