CYP2C19、PON1基因多態(tài)性與腦梗死患者氯吡格雷治療預后的相關性研究

郭朝群,孫建赟,袁莉莉,曹 燦,丁賢慧,黃顯軍,葛 良,周志明

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 神經內科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 腫瘤內科，安徽 蕪湖 241000)

CYP2C19、PON1基因多態(tài)性與腦梗死患者氯吡格雷治療預后的相關性研究

郭朝群1,孫建赟1,袁莉莉1,曹 燦2,丁賢慧1,黃顯軍1,葛 良1,周志明1

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 神經內科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 腫瘤內科，安徽 蕪湖 241000)

目的：探討大動脈粥樣硬化型腦卒中(LAA)患者服用氯吡格雷短期預后與CYP2C19、PON1基因多態(tài)性的關系。方法：對最終入組的96例首發(fā)LAA患者給予阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷治療30 d，后氯吡格雷單藥長期治療，治療前及3個月后對患者進行改良RANKIN量表(mRS)評分，mRS≤2表示預后好，mRS>2表示預后差；使用非擴增熒光染色原位雜交技術進行基因分型。通過比較各種基因型與mRS評分的相關性，判斷患者預后與上述兩種基因的基因多態(tài)性之間的關系，mRS≤2表示預后好，mRS>2表示預后差。結果：治療前，CYP2C19三種不同基因型與患者mRS評分無統(tǒng)計學差異，3個月后，CYP2C19三種基因型與mRS評分有統(tǒng)計學差異(P﹤0.05)，攜帶有CYP2C19 EM型等位基因的患者預后較好(P﹤0.05)，即未攜帶CYP2C19無功能等位基因的患者預后較攜帶者好。治療前，PON1 (576G>A)三種基因型與患者mRS評分無統(tǒng)計學差異，3個月后預后改善在三種基因型之間亦無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結論：大動脈粥樣硬化性卒中患者服用氯吡格雷后短期預后與 CYP2C19基因多態(tài)性有關。

CYP2C19；PON1 (576G>A)；基因多態(tài)性；大動脈粥樣硬化性腦卒中；氯吡格雷

急性缺血性腦卒中是神經科常見疾病，具有高發(fā)病率、致殘率等特點[1]。按TOAST分型，缺血性腦卒中可分為：大動脈粥樣硬化性卒中(large artery atherosclerotic，LAA)、心源性腦栓塞(cardioembolism,CE)、小動脈閉塞性卒中或腔隙性卒中(small-artery occlusion lacunary,SAA)、不明原因的缺血性卒中(stroke of other undetermined etiology,SUE)、其他原因性卒中(acute stroke of other determined etiology,SOE)。其中，LAA型臨床最多見，建議口服抗血小板藥物預防腦卒中復發(fā)及其他心血管事件發(fā)生(ⅠA)[2]。 迄今為止，抗血小板最佳推薦藥物為阿司匹林或氯吡格雷[2]，氯吡格雷較阿司匹林在減少急性缺血性腦卒中風險方面更占優(yōu)勢[3]。然而，常規(guī)劑量氯吡格雷治療時，并非所有患者都能達到很好臨床效果，可能由氯吡格雷抵抗[4]所致。氯吡格雷經腸道吸收入血后需經CYP2C19基因編碼的肝臟細胞色素P450酶系氧化，再經對氧磷酶-1(PON1)等水解形成活性產物從而發(fā)揮抗血小板聚集作用。本研究旨在探討CYP2C19、PON1 (576G>A)基因多態(tài)性與LAA患者接受氯吡格雷治療后神經功能的恢復之間的關系。

1 資料與方法

1.1 對象 本研究所有患者為2016年1～9月弋磯山醫(yī)院神經內科收治的96例首發(fā)的LAA患者(男69例，女27例，年齡18～80歲)。入組標準：①發(fā)病時間<7 d；②符合2010 年《中國急性缺血性腦卒中診治指南》提出的急性缺血性腦卒中標準；③經心電圖、心臟彩超、頭顱CT、頭顱MRI及腦血管造影術等相關檢查排除其他缺血性腦卒中亞型；④3個月隨訪，并順利完成mRS評分[5]；⑤均簽訂知情同意書。排除標準為：①對阿司匹林或氯吡格雷過敏或不可耐受者；②患有血液系統(tǒng)疾病、出血性疾病或存在出血傾向者；③嚴重肝腎功能障礙者；④合并其他嚴重軀體疾病者，如腫瘤、嚴重的冠心病、某一臟器功能不全者等。

1.2 方法

1.2.1 藥物治療方法 所有患者首次給予氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林治療 30 d(氯吡格雷首日負荷量 300 mg，繼之 50 mg /d，阿司匹林 100 mg/d)，1個月后以氯吡格雷單藥治療(50 mg / d)，總療程為90 d。

1.2.2 分組(神經功能恢復情況) 對入組患者治療前及治療3個月后改良Rankin量表(Modified RANKIN scale，mRS)評分[5]，根據評分結果，mRS≤2分為良好組(good prognosis)；3≤mRS≤6分為不良組(poor prognosis)。

1.2.3 CYP2C19、PON1 (576G>A)基因型測定 使用非擴增的熒光染色原位雜交技術(“北京精準醫(yī)學平臺”分析軟件)檢測方法對患者靜脈血進行CYP2C19及PON1 (576G>A)基因型測定。①血液樣本制備：先將預處理液(10×NH4Cl)與雙蒸水按1∶9比例配置成1×NH4Cl的工作液，取若干1.5 mL離心管，然后將EDTA抗凝管采集到的臨床靜脈血液150～200 μL及1.2 mL的上述工作液中分別加入至離心管中，3000 r/min離心后棄上清，沉淀加入30～50 μL耀金保(核酸純化試劑，北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司)，得到白細胞混懸液。取1.5 μL白細胞混懸液加到1支耀金染試劑(地高辛染色液，北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司)中，充分混均并短暫離心，完成后蓋緊管蓋，置入熒光檢測儀；②采用熒光染色原位雜交及染色體核型分析系統(tǒng)自動判讀熒光信號值，獲取熒光曲線圖，進行CYP2C19*2(681G>A)、CYP2C19*3(636G>A)、PON1 (576G>A)基因分型，并作陽性質控。

1.2.4 臨床分型 據CYP2C19基因檢測結果，將CYP2C19編碼的藥物代謝酶CYP2C19分為弱代謝型(PM型CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3)、中間代謝型(IM型CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3)及強代謝型(即正常代謝型)(EM 型，CYP2C19*1/*1)[6]；據PON1 (576G>A)基因檢測結果，將PON1編碼的藥物水解酶PON1分為：野生型(GG)、突變雜合型(GA)、突變純合型(AA)[7]。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17．0軟件分析數據。卡方檢驗用來比較患者在入院時及隨訪3個月時 mRS 評分與CYP2C19、PON1 (576G>A)基因每三種變異型的關系。如患者mRS評分與上述基因有統(tǒng)計學意義時，再分別將上述三種變異基因型的預后率進行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 本研究入組患者130例，存在出血傾向13例，合并其他疾病8例，無法完成隨訪及mRS評分13例，最終共96例(男69例，女27例，年齡18～80歲)LAA患者入組，根據mRS評分分為良好(mRS≤2：治療前24例/治療后3個月71例)，不良(3≤mRS≤6：治療前72例/治療后3個月25例)。

2.2 基因檢測結果 據CYP2C19基因檢測結果,CYP2C19*2和 CYP2C19*3分為野生純合型(GG)、突變雜合型(GA)和突變純合型(AA)[8]，據PON1 (576G>A)基因檢測結果，將PON1編碼的藥物水解酶PON1分為：野生型(GG)、突變雜合型(GA)、突變純合型(AA)[7]?；颊邿晒馇€圖分別見圖1～3。

圖1 CYP2C19*2基因分型及熒光曲線圖

圖2 CYP2C19*3基因分型及熒光曲線圖

圖3 PON1 (576G>A)基因分型及熒光曲線圖

2.3 CYP2C19 基因多態(tài)性與患者預后 治療前，mRS≤2組中EM、IM、PM 所占比例分別為28.6%、21.6% 、23.5%，CYP2C19三種不同基因型患者 mRS 評分比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。3個月后，mRS≤2組中EM、IM、PM 所占比例分別為 90.5%、59.5%、64.7%，3組患者mRS評分比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)；EM組患者的預后良好率與IM、PM組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

表1 不同CYP2C19 基因型mRS 評分比較

時間EM(good/poor)IM(good/poor)PM(good/poor)χ2P治療前12/30(28.6%)8/29(21.6%)4/13(23.5%)0.5310.7673個月后38/4(90.5%)22/15(59.5%)11/6(64.7%)10.7440.005

注：*P<0.05，**P<0.01。

圖4 CYP2C19 三種基因型預后良好率之間的比較

2.4 PON1 (576G>A)與患者預后治療前及治療3個月后，PON1 (576G>A)三種基因型 mRS評分無統(tǒng)計學差異(表2)。

表2 不同PON1 (576G>A) 基因型mRS 評分比較

時間GG(good/poor)GA(good/poor)AA(good/poor)χ2P治療前5/29(14.7%)14/28(33.3%)5/15(25%)3.4770.1763個月后26/8(76.5%)32/10(76.2%)13/7(65%)1.0530.591

3 討論

我們通過比較患者在入院及治療3個月后mRS評分與CYP2C19、PON1 (576G>A)三種基因型的關系，探究LAA的短期預后與CYP2C19、PON1 (576G>A)基因多態(tài)性的關系。攜有CYP2C19 EM型等位基因的患者預后較好，而攜帶IM等位基因患者預后較PM者無顯著不同。而治療前及治療3個月后PON1 (576G>A)的三種基因型預后均無明顯差異。

氯吡格雷經腸道吸收、肝臟代謝活化、有所選擇的且不可逆地阻斷了ADP與血小板膜表面ADP受體(P2Y12)的結合，進而發(fā)揮抑制血小板聚集的作用[9]。其低反應性是多因素的，如患者的依從性、吸收或代謝功能、藥物反應等，然而基因多態(tài)性占有較大比重，且其潛在機制不明[10]。它在體內的生物轉化是在各種酶的參與下共同完成，包括PON1、CYP2C19、ABCB1、CYP3A4、CYP3A5酶等，而CYP2C19、PON1基因多態(tài)性對氯吡格雷代謝的影響越來越受重視。氯吡格雷療效欠佳可能與CYP2C19基因多態(tài)性有關[11]。CYP2C19*2基因型是CYP2C19第5外顯子在第681位的突變(681G/A)，可造成外顯子5′端40 bp堿基缺失，改變mRNA閱讀框架，產出無功能蛋白(CYP2C19*2)酶[12]。CYP2C19*3基因型是第4外顯子在第636位的突變(636G/A)造成終止碼提前，產生出代謝功能極低的CYP2C19*3酶[12]。這兩種蛋白均難以將氯吡格雷代謝轉化為活性代謝產物，嚴重影響其抗血小板功能。亞洲人群常見等位基因是CYP2C19*1，CYP2C19*2及CYP2C19*3，野生型為CYP2C19*1，突變型為CYP2C19*2及CYP2C19*3。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶1個或大于1個CYP2C19等位基因(*2或*3)的變異性基因，可明顯降低氯吡格雷抗血小板聚集效果，發(fā)生更高比率的心腦血管不良事件[13]。故Parég等[6]將只有野生型等位基因的 CYP2C19* 1 /* 1 來定義為EM 型，攜帶一種無功能等位基因的CYP2C19*1/*2或CYP2C19*1/*3來定義為 IM型，而攜帶兩種無功能等位基因的CYP2C19* 2 /* 3，CYP2C19* 2 / * 2，CYP2C19 * 3 / * 3 來定義為 PM型。我們對CYP2C19基因多態(tài)性的研究與上述研究結果一致。也有學者指出PON1 (576G>A)基因多態(tài)性與氯吡格雷療效有關[14]。PON1由肝臟合成，其在血清中和載脂蛋白A1緊密結合是借助于極端疏水的N端，是氯吡格雷代謝關鍵酶，參與調控PON1轉錄與翻譯。Bouman等[14]發(fā)現(xiàn)PON1是氯吡格雷生物代謝的關鍵酶，在氯批格雷由中間產物代謝轉化為有活性的硫醇終產物過程中起重要作用。PON1QQ192純合子個體相對于RR192純合子有著更高的支架血栓形成風險，更低的PON1活性產物及抗血小板聚集效果，故他們認為PON1是氯吡格雷的主要決定因素，多項研究支持這些結果[15]。但另有研究提出相反結論[16]。Hulot等[17]研究發(fā)現(xiàn)PON1基因突變體并不會影響到氯吡格雷藥物代謝動力學、藥效學及心肌梗死患者的臨床效果。Dirk等[18]在歐美人群中同樣發(fā)現(xiàn) PON1 基因 Q192R 多態(tài)位點與 CR 發(fā)生無明顯相關關系。本試驗的研究結果與Dirk的研究成果一致，PON1 (576G>A)多態(tài)性和氯吡格雷抵抗無關系。

我們的研究觀察了氯吡格雷與預后的關系，為氯吡格雷用藥提出了指導性建議，同時支持了既往的研究結果。但本研究樣本較少，未來尚需進一步研究。

[1] SMITH S J,ALLEN J,BLAIR S N,etal.AHA/ACC guidelines for secondary prevention for patients with coronary and other atherosclerotic vascular disease: 2006 update: endorsed by the National Heart,Lung,and Blood Institute[J].Circulation,2006,113(19): 2363-2372.

[2] WALTER N KERNAN,BRUCE OVBIAGELE,HENRY R BLACK,etal.Guidelines for the Prevention of Stroke in Patients With Stroke and Transient Ischemic Attack[J].Stroke，2014，45: 2160-2236.

[3] CAPRIE Steering Committee.A randomised,blinded,trial ofclopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events(CAPRIE) [J].Lancet，1996，348(9038):1329-1339.

[4] WIVIOTT SD,ANTMAN EM.Clopidogrel resistance: a new chapter in a fast-moving story[J].Circulation,2004,109(25):3064-3067.

[5] JIA DONGMEI,CHEN ZHIBIN,ZHANG MEIJUAN,etal.CYP2C19 Polymorphisms and Antiplatelet Effects of Clopidogrel in Acute Ischemic Stroke in China[J].Stroke,2013,44:1717-1719.

[6] PARéG,MEHTA SR,YUSUF S,etal.Effects of CYP2C19 genotype on outcom es of clopidogrel treatmenl [ J ].N Engl J Med,2010,363 ：1704-1714.

[7] 楊振華,王文惠,應雅韻,等.腦梗死與對氧磷酶1基因192G/A位點多態(tài)性的關系[J].診斷學理論與實踐,2011，10(1):50-54.

[8] YI XINGYANG,WANG YANFEN,LIN JING,etal.Interaction of CYP2C19,P2Y12,and GPIIIa Variants Associates With Efficacy of Clopidogrel and Adverse Events on Patients With Ischemic Stroke[J/OL].Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis，2016.DOI: https: //doi.org/10.1177 /1076029616648408.

[9] MARTINEZ-QUINTANA E,TUGORES A.Clopidogrel: a multifaceted affair[J].Clinical Pharmacology， 2015，55(1):1-9.

[10] SIBBING D,MORATH T,STEGHERR J,etal.Impact of proton pumpinhibitors on the antiplatelet effects of clopidogrel[J].Thromb Hae-most，2009，101(4):714-719.

[11] BUONAMICI M ARCUCCI R,MIGLIORIRII A,etal.Impact of platelet reactivity after clopiclogrel adm inistration on drug-eiuting stent throm bosis[J].J Am Coll Cardiol,2007，49 ：2312.

[12] PHARM GKB.Variant in CYP2C19[D].Stanford University,2012．

[13] WALLENTIN L,JAMES S,STOREY RF,etal.PLATO investigators.Effect of CYP2C19 and ABCB1 single nucleotide polymorph-isms on outcomes of treatment with ticagrelor versus clopidogrelfor acute coronary syndromes: a genetic substudy of the PLATOtrial[J].Lancet，2010，376(9749):1320-1328.

[14] BOUMAN HJ,SCHOMIG E,WERKUM JW VAN,etal.Paraoxonase-1 is a major determinant of clopidogrel efficacy[J].Nat Med,2011,17(1):110.

[15] WU H,QIAN J,XU J,etal.Besides CYP2C19,PON1 genetic variant influencespost-clopidogrel platelet reactivity in Chinese patients[J].Int J Cardiol，2013， 165(1):204-206.

[16] ZHANG L,CHEN Y,JIN Y,etal.Genetic determinants of high on-treatment platelet reactivity in clopidogrel treated Chinese patients[J].Thromb Res， 2013，132(1):81-87.

[17] HULOT JS,COLLET JP,CAYLA G,etal.CYP2C19 but not PON1 genetic variants influence clopidogrel pharmacokinetics,pharmacodynamics,and clinical efficacy in post-myocardial infarction patients[J].Circ Cardiovasc Interv,2011,4(5):422-428.

[18] SIBBING D,KOCH W,MASSBERG S,etal.No association of paraoxonase-1 Q192R genotypes with platelet response to clopidogrel and risk of stent thrombosis after coronary stenting[J].Eur Heart J， 2011， 32: 1605-1613.

Correlation analysis between the CYP2C19 and PON1 gene polymorphism and prognosis of cerebral infraction patients following clopidogrel therapy

GUO Chaoqun,SUN Jianyun,YUAN Lili,CAO Can,DING Xianhui,HUANG Xianjun,GE Liang,ZHOU Zhiming

Department of Neurology,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective：To investigate the relationship between CYP2C19 and PON1 gene polymorphisms and the prognosis in patients with large artery atherosclerotic stroke following medication of clopidogrel.Methods: Ninety-six patients with first large artery atherosclerotic stroke attack were included and given clopidogrel plus aspirin medication for 30 days,followed by simple chronic clopidogrel regimen.Modified RANKIN scale(mRS)was used before and 3 months after medication to assess the therapeutic effects.Patients with mRS scoring ≤ 2 were considered as ′good prognosis′,and those with mRS scoring>2 were considered as ′poor prognosis′.The genotypes of CYP2C19 and PON1 (576G>A) were detected with non-amplified fluorescent dyes in situ hybridization technique,and compared with the mRS scoring for estimating the relationship between the CYP2C19 and PON1 (576G>A) polymorphisms and prognosis following medication.Results: The difference was not significant between mRS scores and different three genotypes of CYP2C19 in patients before therapy,yet the difference was significant 3 months after medication(P<0.05),and patients with CYP2C19 EM alleles had better prognosis than those with CYP2C19 with loss-of-functional alleles(P<0.05).The three genotypes for PON1 (576G>A) remained no statistical difference with mRS scores before therapy 3 months after medication(P>0.05).Conclusion: The prognosis appears to be associated with CYP2C19 gene polymorphism in patients with large artery atherosclerotic stroke following short use of clopidogrel.

CYP2C19；PON1 (576G>A)；gene polymorphisms；large artery atherosclerotic stroke；clopidogrel

1002-0217(2017)04-0329-04

國家自然科學基金項目(81171110)

2016-12-12

郭朝群(1990-)，女，2015級碩士研究生，(電話)18895375296，(電子信箱)18895375296@163.com; 周志明，男，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導師,(電子信箱)neuro_depar@hotmail.com,通信作者。

R 543;R 743.3

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.04.007