基于3，5-二硝基水楊酸比色法建立一種快速測定總糖含量的方法

任 婧，李景富，張 佳，劉俊芳，許向陽，姜景彬

(東北農(nóng)業(yè)大學 園藝園林學院，哈爾濱 150036)

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基于3，5-二硝基水楊酸比色法建立一種快速測定總糖含量的方法

任 婧，李景富，張 佳，劉俊芳，許向陽，姜景彬

(東北農(nóng)業(yè)大學 園藝園林學院，哈爾濱 150036)

本實驗利用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法對番茄果實總糖含量進行了測定，并初步建立了微型化DNS比色法測定總糖含量的實驗方法和DNS比色法測定番茄總糖含量的最佳條件，對影響測定結果的因素：測定波長、顯色劑用量、顯色時間進行了單因素試驗。結果表明，540 nm波長、0.2 mL DNS、沸水浴4 min為最佳測定條件。該最佳測定條件下，葡萄糖含量在20～200 μg與吸光值呈良好的線性關系。利用得到優(yōu)化方法對4個番茄品種的總糖含量進行了測定，結果表明測定樣品在1.5 h內(nèi)的吸光值較為穩(wěn)定，RSD為2.19%～2.88%。本研究得到番茄果實總糖含量測定的優(yōu)化方法，是一種穩(wěn)定、高效可行的測定方法，為番茄高糖品種的鑒定和篩選提供了依據(jù)。

番茄；DNS；酶標儀

番茄(Lycopersicon esculentum Mill)，原產(chǎn)于南美洲的秘魯和墨西哥，營養(yǎng)豐富，是人們餐桌上不可缺少的蔬菜。番茄也是全世界種植最為普遍的蔬菜作物之一。番茄含有VA、VC、葉酸、鉀等主要的營養(yǎng)元素，其中富含的番茄紅素可以清除人體內(nèi)的活性氧自由基，延緩衰老，同時具有預防癌癥、心血管疾病等功能[1]。因此，近些年番茄果實的風味品質(zhì)和營養(yǎng)含量也越來越受到人們的關注[2]。含糖量是番茄風味品質(zhì)的重要組成部分[3]，同時也是番茄品質(zhì)育種的重要指標。而番茄含糖量的測定的方法較多，如高效液相色譜法[4]、斐林試劑法[5]、蒽酮比色法[6]、3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[7]等，大多是利用紫外可見光吸收法，但這些方法存在一些明顯的缺點，如價格昂貴、操作復雜、測定時間長、污染嚴重，不能進行批量測定。DNS比色法是半微量測定糖法[8]，操作簡便、快速，適合批量測定。本實驗對3，5-二硝基水楊酸法測定番茄總糖含量的反應條件進行了優(yōu)化，尋找最佳實驗條件以保證試驗的精確度，獲得可靠的實驗數(shù)據(jù)為番茄育種提供參考。

1 儀器與試藥

酶標儀(伯騰Epoch)；水浴鍋；天平；容量瓶；離心管；3，5-二硝基水楊酸；6 mol/L HCl；6 mol/L NaOH；0.5%酚酞；葡萄糖；蒸餾水。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 DNS 試液的配制

將6.3 gDNS和2 mol/LNaOH溶液362 mL，加到500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結晶酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中備用[9]。

2.1.2 葡萄糖標準液的配制

精密稱定葡萄糖1 g，加水溶解并定容至1 000 mL 的容量瓶，即得濃度為1 mg/mL。

2.1.3 待測總糖溶液的制備

將-80℃冷凍的番茄“16588”、“16698”、“16541”、“16513”去皮、籽，取3 g，充分研磨成勻漿，放入離心管，加入6 mol/L鹽酸10 mL和蒸餾水15 mL，沸水浴40 min，過濾，冷卻后滴入1滴酚酞，用6 mol/L NaOH中和至pH中性，定容至100 mL。

2.2 優(yōu)化實驗

為建立一種快速、準確測定還原糖的含量的方法，對3，5-二硝基水楊酸比色法的測定波長、顯色劑用量、顯色時間進行單因素試驗。

2.2.1 最佳波長

取葡萄糖標準液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL、180 μL、200 μL到0～10號離心管中，加蒸餾水至200 μL，DNS 0.4 mL于離心管中混合，沸水浴5 min，立即冰水冷卻，靜置10 min，加入1 600 μL水混勻，搖勻后以酶標板空白孔為空白對照，在300～800 nm波長下測定吸光值。以波長值為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制曲線。在300～460 nm波長內(nèi)各濃度不都有對應吸光值，550～800 nm波長內(nèi)空白對照的值為負值，均不考慮(圖1)。470～540 nm波長內(nèi)對應的標準曲線的相關系數(shù)在540 nm處最大(R2=0.9757y=0.003x-0.0194)，故選擇540 nm為最佳波長。

2.2.2 顯色劑用量

取葡萄糖標準液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL、180 μL、200 μL到0～10號離心管中，加蒸餾水至200μL，分別加入DNS 0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL于離心管中混合，沸水浴5 min，立即冰水冷卻，靜置10 min，加入1 600 μL水混勻，以0號管為空白對照，在540 nm波長下測定吸光值，每組進行3次重復。以葡萄糖含量為橫坐標，吸光值(A540)為橫坐標繪制標準曲線。在0.2 mL DNS加入量時標準曲線的相關系數(shù)(R2=0.996 1)最大(圖2)，故選擇0.2 mL為DNS最適加入量。

圖1 不同濃度葡萄糖在不同波長下的吸光值Fig.1 The absorbance of different concentrations of glucose at different wavelengths

圖2 不同濃度DNSFig.2 Different concentrations of DNS

2.2.3 顯色時間

取葡萄糖標準液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL、180 μL、200μl到0～10號離心管中，加蒸餾水至200 μL，加入DNS 0.2 mL于離心管中混合，分別沸水浴1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，立即冰水冷卻，靜置10 min，加入1 600 μL水混勻，以0號管為空白對照，在540 nm波長下測定吸光值，每組進行3次重復。以葡萄糖含量為橫坐標，吸光值(A540)為縱坐標繪制標準曲線，4 min時標準曲線的相關系數(shù)(R2=0.997 5)最大(圖3)，故選擇4 min為最適加熱時間。

2.3 標準曲線繪制

取葡萄糖標準液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL、180μL、200 μL到0～10號離心管中，加蒸餾水至200 μL，加入DNS 0.2 mL于離心管中混合，沸水浴4 min，立即冰水冷卻，靜置10 min，加入1 600 μL水混勻，以葡糖糖含量為橫坐標，吸光值(A540)為縱坐標，繪制標準曲線。

圖3 不同加熱時間Fig.3 Different heating times

圖4 標準曲線Fig.4 The standard curve

2.4 精密度試驗

將不同濃度的葡萄糖標準液(20 μL、100 μL、200 μL)，按上述方法顯色，加到同一個酶標板上測定吸光值，隨后分別加到3個不同的酶標板上測量吸光值。同樣處理進行第二批次，不同酶標板在540 nm處的吸光值相對標準偏差在0.86%～3.07%(表1)，表明儀器的精密性良好，可用于測定吸光值。

表1 精度測定值

2.5 番茄總糖含量的測定

2.5.1 總糖含量測定

取測定液200 μL稀釋到600 μL，取稀釋后的溶液200 μL加入DNS 0.2 mL到離心管，沸水浴4 min，立即冰水冷卻，加入蒸餾水1 600 μL，靜置10 min，使用酶標儀測定吸光值，同時按2.3方法繪制標準曲線。計算得到“16698”、“16588”、“16541”、“16513”總糖含量分別為42.06 mg/g、54.38 mg/g、57.36 mg/g、49.41 mg/g。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗

精密量取稀釋待測液200 μL，按2.5.1項下方法顯色，室溫放置，每隔 30 min測定一次吸光度。結果表明，在顯色 1.5 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為2.19%～2.88%。

2.5.3 回收率試驗

精密稱取已知含量的總糖溶液各5份，分別精密加入葡萄糖對照品20 μg，按照2.5.1與2.3項方法分別測定其吸光值，代入標準曲線方程，計算回收率。結果(表2)表明測定結果可靠性良好，該方法可用于測定番茄總糖含量。

表2 回收率測定

3 討論

DNS比色法測定總糖含量的原理是利用酸水解法將沒有還原性的雙糖和多糖使其降解成有還原性的單糖進行測定，還原糖在堿性條件下被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物，3，5-二硝基水楊酸被還原為棕色3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)，還原糖含量與棕色物質(zhì)顏色的深淺成正比關系，利用酶標儀測定其吸光值，帶入標準曲線計算總糖含量。測定的關鍵步驟有測定波長的選擇、顯色液用量、顯色時間、穩(wěn)定時間等。

DNS比法測定還原糖含量最佳吸收光譜的確定，不同的作物需要采用不同的檢測波長。朱海霞等[10]在馬鈴薯還原糖測定確定λmax=510 nm、趙凱等[11]在測定還原糖含量的研究確定λmax=550 nm、王俊麗等[12]對DNS法測定最佳波長的研究中確定λmax=520 nm，這些與本實驗得出的λmax=470 nm 有所不同。這可能由于最佳波長的確定受到儀器靈敏度、試驗中葡萄糖含量及DNS用量、蒸餾水加入量等因素的影響。因此應采用合適的實驗反應體系和測定儀器來確定所需的最佳條件。本實驗根據(jù)單因素試驗得到在470 nm波長處不同含量的葡萄糖標準液(20～200 μg)均能測到吸光值且為最大值，但標準曲線在此波長下的線性較差，相關系數(shù)較低，可能與DNS顯色液自身在此波長下也有極高的吸光值有關，這種自身吸光值高可能會對樣品測定值產(chǎn)生誤差，所以還原糖顯色后具有最大吸光值的波長不一定是最佳測定波長。在540 nm波長處顯色液自身吸光值最低且大于零，標準曲線相關性最好，綜合相關系數(shù)和顯色液自身吸光值，選定540 nm為最適測定波長。

實驗使用酶標儀測定吸光值，酶標儀和分光光度計原理基本相似，對樣品的吸光值可以進行批量測定，同時操作方便，減少了傳統(tǒng)紫外分光光度計比色皿清洗不徹底從而影響測定值的問題。酶標法的線性范圍良好，穩(wěn)定性、可重復性和精密度較高，測定時需要的樣品量少[13]。本實驗根據(jù)單因素試驗和RSM分析最終確定了最佳測定波長為540 nm，顯色劑用量為0.2 mL，顯色時間為4 min，穩(wěn)定靜置最少時間為10 min。根據(jù)最佳條件測定的番茄總糖糖含量在1.5 h內(nèi)吸光值穩(wěn)定，該方法可用于批量集中測定番茄總糖含量。番茄總糖的測定受到多種因素的干擾，如：水解時間、水解溫度、HCl的加入量、番茄紅素等。為了排除番茄糖液提取過程中色素對測定的干擾，試用活性炭除色素，以對照品溶液試驗時，吸光值略有增加，說明活性炭吸附了色素等可以影響到吸光值測定的因素，與江建麗[14]測定五味子還原糖含量使用活性炭的結果不同，可能是由于測定樣品不同，提取方法不同造成。從2.5.2 測定結果可以看出，不同品種番茄的測定值較為穩(wěn)定、可靠，具有方便快捷、安全、準確、低成本等特點，可用于不同品種番茄總糖含量測定。

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A method for rapid determination of total sugar content based on 3, 5-dinitrosalicylic acid colorimetry

REN Jing, LI Jing-fu, ZHANG Jia, LIU Jun-fang, XU Xiang-yang, JIANG Jing-bin

(Northeast Agricultural University, College of Horticulture and Landscape, Harbin 150036, China)

In this study, a colorimetric method was used to estimate the total sugars content in tomato with 3, 5-dinitrosalicylic acid. An experimental method for the determination of total sugar content by miniaturiza DNS colorimetric method were initially established and we obtained the optimize conditions for the determination of total sugar content in tomato by DNS colorimetric method. The single-factor test and response surface methodology were applied to optimize conditions including the determination wavelength, color developer amount, time and stability of the reaction. The results showed that 540 nm wavelength, 0.2 mL, DNS and boiling water bath 4min were the best conditions for determination. There was a linear relationship between the content of glucose in the range of 20～200 μg and absorbance at this optimum determination conditions. The optimized method was used to determine the total sugar content of 4 tomato cultivars. The results showed that the properties of the samples were stable in 1.5 hour, and RSD was 2.19% to 2.88%. In this study, the optimal method for the determination of total sugar content in tomato fruit is a stable, efficient and feasible method which provided basis for identification and screening of high sugar cultivars.

Tomato; DNS; Microplate reader

2017-04-09

番茄雜種優(yōu)勢利用技術與強優(yōu)勢雜交種創(chuàng)制(2016YFD0101703)

任婧(1992-)，女，碩士。

李景富(1943-)，男，教授，博士研究生導師，e-mail：Lijf_2005@126.com。

TS255.7

A

1674-8646(2017)10-0066-04