分子探針在細菌計數(shù)中的應(yīng)用

焦洋，羅健，楊彥鳳

(1.重慶子勻環(huán)保工程有限公司，重慶 400039；2.中國兵器工業(yè)第五九研究所，重慶 400039)

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分子探針在細菌計數(shù)中的應(yīng)用

焦洋1，羅健1，楊彥鳳2

(1.重慶子勻環(huán)保工程有限公司，重慶 400039；2.中國兵器工業(yè)第五九研究所，重慶 400039)

分子探針是一種已知特異性的分子，在與生物靶分子結(jié)合以后，其帶有的標記物可供反應(yīng)后檢測，從而反映出靶分子或其所在結(jié)構(gòu)單元的各種信息。通過詳細綜述幾種常見的分子探針，并且與其他類型的探針進行比較與區(qū)分，認為分子探針能夠克服傳統(tǒng)細菌計數(shù)法的缺點，可以對不同類型的細菌進行計數(shù)，具有快速、適用對象廣泛的特點。但是，還需要開展進一步的工作，形成統(tǒng)一的判斷標準和方法標準，并提高抗干擾性，以推動分子探針在細菌檢測技術(shù)中的廣泛應(yīng)用。

水環(huán)境；分子探針；細菌計數(shù)；細菌

水環(huán)境中廣泛分布著各種各樣的細菌，它們構(gòu)成了水體中微生物的主體。尤其是異養(yǎng)細菌在自然界物質(zhì)和能量代謝圈中具有舉足輕重的作用，能不斷地促進水體中有機物質(zhì)的分解或合成，并引起與之相關(guān)的一系列能量的轉(zhuǎn)化，從而對水體水質(zhì)產(chǎn)生重要的影響，是決定水質(zhì)變化的關(guān)鍵之一。測定水體中細菌的數(shù)目是研究水體中細菌作用的基礎(chǔ)。由于細菌種類的極端多樣性，細菌計數(shù)技術(shù)一直受到廣泛的關(guān)注和研究開發(fā)。目前常用的培養(yǎng)計數(shù)方法存在許多局限。由于分子生物學領(lǐng)域的突破，采用分子探針的細菌計數(shù)技術(shù)得到了迅速發(fā)展，正在成為水環(huán)境微生物學中十分重要的一個領(lǐng)域。

1 傳統(tǒng)活菌計數(shù)方法的局限性

典型的傳統(tǒng)細菌計數(shù)方法主要有平板計數(shù)法和最大或然計數(shù)法(MPN法)等等，這些方法均在固體或液體培養(yǎng)基中對待測菌種進行培養(yǎng)，然后根據(jù)培養(yǎng)后顯現(xiàn)出的宏觀結(jié)果(例如菌落密度(平板計數(shù)法)、液體培養(yǎng)基的顯色情況(MPN法))來判斷原始樣品中的活菌濃度。這些方法普遍存在以下兩個最主要的不足之處。

(1)培養(yǎng)時間長。細菌對培養(yǎng)基的適應(yīng)以及細菌的生長繁殖都需要一定的時間，所以產(chǎn)生可觀測到的結(jié)果需要較長的時間，通常在24 h以上甚至一周左右。

(2)培養(yǎng)條件對結(jié)果影響大。傳統(tǒng)方法中，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等對檢測結(jié)果都有很大的影響，一種培養(yǎng)基往往僅能檢測出一種或數(shù)種能夠在該培養(yǎng)基中生存的細菌的數(shù)目，這只占實際細菌數(shù)量的極少部分，例如通常的平板計數(shù)只能檢測到水中細菌數(shù)目的0.1%～10%[1]，從而大大影響了結(jié)果的準確性。表1給出了應(yīng)用平板計數(shù)法對各類水樣中的細菌進行計數(shù)時，所能檢測到的細菌數(shù)占實際細菌數(shù)的比例[2]。

表1 平板培養(yǎng)計數(shù)法的局限性

傳統(tǒng)活菌計數(shù)方法的上述缺點，在很大程度上限制了其在環(huán)境微生物學中的應(yīng)用范圍。另外，水樣中的細菌種類繁多，不可能也沒有必要在任何情況下都分門別類地對各種細菌都單獨培養(yǎng)計數(shù)。而且，在實際情況下，一個有限范圍內(nèi)的各種細菌之間不可避免地發(fā)生著相互作用[3]，水體的宏觀微生物學特性是它們共同作用的結(jié)果。而所有的傳統(tǒng)技術(shù)在培養(yǎng)過程中都將細菌置于偏離它們原來的小環(huán)境的、新的人為的操縱條件下[4]，使其形成與原來并不完全相同的群落結(jié)構(gòu)，甚至引起細菌偏離在自然狀況下的生理習性，從而不能反映出它們的實際生長情況。因此，通過任何傳統(tǒng)活菌計數(shù)技術(shù)都不能全面客觀地認識水體微生物特性。

2 分子探針的概念

鑒于科學研究的需要以及傳統(tǒng)活菌計數(shù)法的缺陷，研究人員開始致力于研究新的、準確有效的活菌計數(shù)方法[5]，分子探針技術(shù)作為一種主流方法，逐漸引起人們的關(guān)注。

從化學和生物學的意義上理解，分子探針是一種已知特異性的分子，在與靶分子結(jié)合以后，它帶有的標記物可供反應(yīng)后檢測，從而反映出靶分子或其所在結(jié)構(gòu)單元的各種信息。例如核酸分子探針，可通過嵌入作用、靜電作用或者采用引物標記或衍生方法與核酸連接[6]；又如蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的熒光探針，能在溶液中與蛋白質(zhì)分子靜電吸引或氫鍵結(jié)合[6]。分子探針不僅僅適用于檢測生物大分子，也適用于對非生物大分子進行分析，例如在色譜分析中，利用含有肼基(—NH-NH2)的分子探針可以與醛或酮等含有羥基的化合物發(fā)生縮合反應(yīng)，生成相應(yīng)的腙類化合物[6]，如下式所示。

靶分子與合適的探針結(jié)合后，可以通過分光光度分析、熒光檢測[6]或者利用化學反應(yīng)中產(chǎn)生的化學發(fā)光現(xiàn)象對靶分子被放大的結(jié)構(gòu)、生理生化功能等目標特性進行檢測。

因此，從結(jié)構(gòu)上來講，可以認為分子探針是這樣一類有機試劑：它由母體、取代基和反應(yīng)基團組成。反應(yīng)基團與靶分子結(jié)合，取代基不參加反應(yīng)。當適宜的分子探針通過反應(yīng)基團與靶分子結(jié)合后，靶分子所包含的難以直接獲得的待測信息就通過有機試劑的母體及取代基的固有特性或者整個有機試劑與靶分子結(jié)合以后的產(chǎn)物的新特性得以體現(xiàn)。

3 用分子探針對細菌計數(shù)的核心問題

分子探針的特異性和對微觀體系的放大功能使之在微生物學上具有廣泛的用途，最常見的是利用分子探針鑒定微生物的種屬以及對微生物進行純種分離[7-9]。這些方法普遍利用不同的核酸分子探針測定核酸分子中的核苷酸序列，從而精確地揭示微生物種類和遺傳的多樣性，可以跟蹤特定的基因寄宿主微生物，并可以在同一時間研究多種微生物。

用分子探針進行活菌計數(shù)，實質(zhì)在于利用分子探針鑒別細菌的“活性”，即側(cè)重于從整體上把握細胞的生理特性，但是，用分子探針進行活菌計數(shù)應(yīng)當明確下面兩個要點：

●對水樣中各種已知或未知種類的細菌，建立統(tǒng)一的“死”與“活”的界定標準

●合理選擇分子探針

第一點是分子探針進行活菌計數(shù)的理論依據(jù)。一切活菌計數(shù)法都必然有其合理的依據(jù)，例如平板計數(shù)法，實際上認為在培養(yǎng)基上能夠生長的細菌是具有“活性”的細菌。因而用分子探針對活菌計數(shù)，也必須有參照的標準。在對微生物進行計數(shù)時，基于不同標準的檢測結(jié)果存在著重大差異[10]。所以針對分子探針法建立合理的界定標準，是具體技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用的基礎(chǔ)。

第二點是分子探針進行活菌計數(shù)的技術(shù)核心，具體體現(xiàn)為三個方面：一是所選擇的分子探針對“死”“活”兩種狀態(tài)下的細胞的滲透能力或與細胞中靶分子的結(jié)合能力要有顯著差異。二是在同時使用兩種或兩種以上分子探針測定活菌數(shù)和總細菌數(shù)時，探針之間不能發(fā)生對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響的化學反應(yīng)，而且探針的響應(yīng)結(jié)果應(yīng)有明顯差異(例如兩種熒光探針的熒光光譜波長應(yīng)有較大間隔)。三是引入的分子探針不會在有限的時間內(nèi)破壞細菌的活性而造成檢測結(jié)果的嚴重失真。

4 幾種常見的用于細菌計數(shù)的分子探針

下面介紹幾種常見的分子探針，利用它們可以對細胞進行染色計數(shù)。

(1)碘化丙錠[6]

碘化丙錠(PI)是一種菲啶類核酸熒光分子探針，分子結(jié)構(gòu)如下式所示。

其中，菲啶環(huán)是它的熒光團。它具有較大的水溶性和較小的膜滲透性，排斥活細菌，只能進入細胞膜遭到破壞的細菌。碘化丙錠與兩種核酸(DNA和RNA)基本上屬于無序結(jié)合，DNA的每4～5個堿基對同一個染料分子化學計量結(jié)合。碘化丙錠只能對死細胞進行染色，染色后能夠發(fā)出波長為630 nm的紅色熒光。

(2)吖啶橙(AO)

吖啶橙屬于吖錠類熒光分子探針，分子結(jié)構(gòu)如下式所示。

這個分子對細胞膜具有很強的滲透能力，既能夠進入細胞膜遭到破壞的細菌內(nèi)，也能夠進入細胞膜完好的細胞內(nèi)，然后通過嵌入或靜電作用與DNA和RNA作用[6]。當與DNA結(jié)合時，該染料有綠色熒光，最大發(fā)射波長為525 nm；當與RNA結(jié)合時，最大發(fā)射波長移至650 nm左右，為紅色熒光。

(3)DAPI

DAPI的化學名稱為4’,6-二脒基-2-苯基吲哚，分子結(jié)構(gòu)如下式所示。

它是一種含有吲哚環(huán)的熒光分子探針，能夠進入活細菌及死細菌的體內(nèi)與dsDNA的小溝槽結(jié)合，選擇性地鍵合到A-T堿基一簇，在激發(fā)光源的作用下發(fā)射藍色熒光[6]。

(4)16S rRNA 寡聚核苷酸探針[11]

細胞的活性可通過核糖體的含量表現(xiàn)出來。利用16S rRNA 寡聚核苷酸標記探針原位雜交，可以反映出核糖體含量。由于這類探針只在核苷酸含量很高時才能具有可檢出的結(jié)果(1000～10 000個/單細胞)，所以能與16S rRNA寡聚核苷酸探針雜交的細菌被認為是具有代謝活性的。用四甲基若丹明標記寡聚核苷酸分子探針，在綠色激發(fā)光下能放射出紅色熒光。

以上列舉的是細菌計數(shù)中常用的幾種分子探針。在實際工作中，往往將兩種或兩種以上分子探針聯(lián)合使用以同時測定細菌的總數(shù)和活菌數(shù)目。例如，Williams等人發(fā)明了一種聯(lián)合應(yīng)用DAPI和PI(碘化丙錠)同時對活菌和死細菌進行計數(shù)的方法[11]，就是利用DAPI能對活細菌與死細菌同時染色，而PI只能對死細菌染色，且染色后發(fā)射光譜明顯不同的特點同時對細菌總數(shù)和死菌數(shù)目進行測定，二者之差即為活菌數(shù)目。另一種目前廣泛使用的用于活菌計數(shù)的試劑叫作Live/Dead BacLight，它由兩種核酸分子探針組成，一種是上面提到的碘化丙錠，另一種叫作SYSO9。后者既能滲透活細胞的細胞膜，也能滲透死細胞的細胞膜。當兩種染色劑并存時，碘化丙錠穿透被破壞的細胞膜后與SYTO9試劑競爭性地同核酸結(jié)合。由于碘化丙錠與核酸的結(jié)合能力較強，就將SYTO9試劑從核酸中置挀出樸。這樣，有完整細胞膜的活細菌呈現(xiàn)綠色熒光，細胞膜被破壞的死細菌呈現(xiàn)出紅色熒光。利用落射熒光顯微鏡配合適當?shù)臑V光設(shè)備，活細菌和死細菌就能分別或同時被觀察到。

它能夠滲透細菌的細胞膜進入細胞中?；罴毦孽ッ妇哂谢钚裕軌蚯袛郌DA分子的二乙酸基團，從而使FDA顯出熒光性[15]。

5 用分子探針對細菌計數(shù)的優(yōu)缺點

較之傳統(tǒng)細菌計數(shù)法，分子探針具有不可比擬的優(yōu)越性，主要體現(xiàn)在以下幾點。

快速。例如用吖啶橙對細菌染色時，大約只需要30 min的培養(yǎng)時間；用Live/Dead BacLight對細菌染色，培養(yǎng)時間也在15～20 min。這些方法均大大縮短了細菌計數(shù)的時間，使得在線監(jiān)測成為可能，同時也在一定程度上避免了將細菌從原來的生存環(huán)境中長期分離而引起偏差。

適用對象廣泛。鑒于分子探針的靶物通常是細胞內(nèi)普遍存在的生物大分子，不因細菌的種類不同而存在或缺乏。所以在一般情況下，其計數(shù)結(jié)果與細菌的種類無關(guān)。這種普適性也使得計數(shù)的結(jié)果更接近于水樣中細菌的實際情況。

可同光電技術(shù)等結(jié)合，使操作更為方便靈活。例如，利用分光光度計或者流式細胞儀能夠即刻獲得結(jié)果。

但是，在現(xiàn)階段，利用分子探針對細菌進行計數(shù)，也存在著許多尚待解決的問題。首先是方法的結(jié)果比較不穩(wěn)定，各種分子探針得到的結(jié)果之間可比性相對較差，這是因為這些方法基于各自不同的鑒定標準。其次是干擾因子對結(jié)果的影響較大。例如對于多細胞真核生物，也可能被檢測出來，造成檢測的不準確性；又如水體中有很多類似于細菌的可染色微粒，用DAPI和AO染色的結(jié)果不能將這些微粒從細菌中區(qū)分出去，造成結(jié)果失真[5]；細胞膜的通透性的變化對測定的結(jié)果也會產(chǎn)生影響[4]。

6 發(fā)展方向

鑒于前面討論過的分子探針對細菌計數(shù)的核心問題，結(jié)合現(xiàn)階段存在的問題，可以考慮從兩個方面對分子探針技術(shù)進行改進和完善。

首先是建立更加科學合理、更為全面的界定標準。這里涉及概念的標準化和方法的標準化。概念的標準化，即以定義的形式明確被檢測對象的基本特征。當概念明確后，就能限定操作結(jié)果的范圍，從而避免其他干擾因素引起的混亂。例如，利用分子探針對活菌計數(shù)時，有關(guān)于“活性”的概念，目前就主要是從下面三個層次闡述的[16]：一是生長繁殖能力(viability)。這個概念對于檢驗細菌的“活性”而言最為嚴格，它不僅涉及代謝活力，也涉及細胞膜的完整性。但是，在DNA遭到了不可逆的破壞、生長環(huán)境缺乏營養(yǎng)或者生長極其緩慢等情況下，就難以對生長繁殖能力進行衡量；二是代謝活力(activity)。這個概念相對于第一個概念來說要“寬松”一些，它反映了細菌進行生命活動的可能性。但是如果由于細胞損傷、饑餓等引起能量或代謝途徑的缺失時，用這個概念去衡量細菌的“活性”存在著一定的問題；三是細胞膜的完整性(integrity of membrane)。如果細胞膜不完整，細菌就不能維持膜電位，代謝將終止，從而可認為該細菌已經(jīng)“死亡”。而且其內(nèi)部結(jié)構(gòu)將暴露在外界環(huán)境中，最終將會分解。這三個層次的概念在不同程度上對細菌的“活性”進行了界定，顯然由第一個概念所得到的計數(shù)結(jié)果相對比較嚴格，但是基于此概念的檢測手段必然更為復(fù)雜。第三個概念最具有直觀性，相應(yīng)也最為簡單，因此目前多數(shù)分子探針都是基于第三個概念對細菌進行計數(shù)的。

方法標準化，即在建立概念明確的基礎(chǔ)上，建立相應(yīng)的標準方法。標準方法一旦確定，就使得檢測結(jié)果之間具有可比性，技術(shù)更加規(guī)范化。

其次是開發(fā)更準確、更具有針對性的技術(shù)。更準確，是指所采用的分子探針技術(shù)能夠更好地排除前述的干擾因素，對細菌能夠具有更強的專一性。這一點對于方法的標準化也是十分重要的。更具有針對性，是指能夠開發(fā)出具有明確使用目的的分子探針。例如在研究水體受污染程度時，往往需要了解水體中厭氧微生物和好氧微生物的情況，而目前尚未有專門針對這兩類微生物的分子探針。一般認為，好氧細菌普遍含有超氧化物歧化酶(SOD)，而專性厭氧細菌中這種酶的含量很少(或完全沒有)，因此，如果能夠開發(fā)出專門針對SOD的分子探針，無疑對于研究好氧微生物與厭氧微生物的關(guān)系具有十分重要的意義。由此可見，專一性的分子探針的出現(xiàn)，必將對環(huán)境微生物的研究起到重要的推動作用。

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Application of Molecular Probes in Bacteria Counting

JIAO Yang1, LUO Jian1, YANG Yan-feng2

(1.Chongqing Ziyun Environment Engineering Co., Ltd., Chongqing 400039, China; 2.No.59 Institute, China Ordnance Industry, Chongqing 400039, China)

Molecular probes are a kind of molecules that can specifically be combined with bio-targeted molecules. The markers of the probes can be detected after the reaction, thus reflecting the information of the targeted molecules or the structures including the molecules. In this paper, several molecular probes are further described in detail and compared with other kinds of probes. It is concluded that molecular probes can overcome the deficiencies of traditional bacterial counting methods, and different types of bacteria can be counted in a rapid manner. Molecular probes can be applicable to a wide range of objects. On the other hand, further work needs to be done to unify the identification standard of judgment and method, so as to improve the anti-interference of the method, thus promoting the application of molecular probes in bacteria detection.

water environment; molecular probe; bacteria counting; bacteria

2017-06-12

焦洋(1978—)，男，貴州貴陽人，工程師，碩士，主要研究方向為工業(yè)廢水處理，E-mail：122089103@qq.com

羅健(1971—)，男，四川瀘縣人，工程師，主要研究方向為環(huán)境工程微生物， E-mail：673359479@qq.com

10.14068/j.ceia.2017.04.020

X835

A

2095-6444(2017)04-0088-05