基于 HPLC 指紋圖譜對救必應(yīng)與其偽品的鑒別研究

馬玉翠，王淳，王蔚，吳翠，杜寧，孫文，李慧，巢志茂

1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.北京市理化分析測試中心，北京 100094

基于 HPLC 指紋圖譜對救必應(yīng)與其偽品的鑒別研究

馬玉翠1，王淳1，王蔚2，吳翠1，杜寧2，孫文1，李慧1，巢志茂1

1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.北京市理化分析測試中心，北京 100094

目的 建立救必應(yīng)與其偽品米碎木的 HPLC 指紋圖譜，進(jìn)行真?zhèn)舞b別。方法 收集各地名為“救必應(yīng)”的藥材，采用 HPLC 指紋圖譜方法對救必應(yīng)及其偽品米碎木進(jìn)行檢測，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng) 2004A 版》對指紋圖譜進(jìn)行評價。結(jié)果 建立了救必應(yīng)和米碎木的 HPLC 指紋圖譜，方法學(xué)考察符合指紋圖譜技術(shù)要求。救必應(yīng)與其偽品米碎木指紋圖譜輪廓特征明顯不同，救必應(yīng)有31個共有峰，米碎木有 28 個共有峰。主成分分析可將樣品分為 2 組，聚類分析也可將樣品分為 2 類。結(jié)論 采用 HPLC 指紋圖譜及其數(shù)據(jù)分析，可以對救必應(yīng)與其偽品進(jìn)行鑒別，為救必應(yīng)的質(zhì)量評價提供有效方法。

救必應(yīng)；米碎木；高效液相色譜法；指紋圖譜；主成分分析；質(zhì)量控制

冬青科植物鐵冬青 Ilex rotunda Thunb.是嶺南地區(qū)多濕熱環(huán)境中生長的喬木，主要分布于廣東、廣西、福建、臺灣、云南等地[1]。其干燥樹皮為中藥救必應(yīng)，功效清熱解毒、利濕止痛，用于暑濕發(fā)熱、咽喉腫痛、濕熱瀉痢、脘腹脹痛、風(fēng)濕痹痛等癥[2]，主要含三萜及其苷類、黃酮類、酚類、鞣質(zhì)類化學(xué)成分，具有降低冠脈流量、抗心律失常、降壓、減慢心率、提高耐缺氧能力、抗腫瘤、抑菌、抗炎、止血等活性，用于治療消化系統(tǒng)疾病、心血管疾病及多種感染性疾病[3-5]，是腹可安片、腸胃適膠囊、復(fù)方救必應(yīng)膠囊等中成藥的組成之一[6-7]。救必應(yīng)還是嶺南地區(qū)涼茶的主要組成成分[8]，在牙膏中也有應(yīng)用[9-10]。救必應(yīng)的偽品米碎木為米碎木 I. godajam (Colebr.) Wall.的干燥樹皮[11]，外觀與救必應(yīng)極其相似，在商品流通中也常有米碎木混作救必應(yīng)的現(xiàn)象[12]，導(dǎo)致救必應(yīng)的質(zhì)量參差不齊。曾有報道對救必應(yīng)進(jìn)行高效薄層指紋圖譜[13]、定性定量分析[12]等的研究，并對救必應(yīng)和米碎木進(jìn)行了性狀、顯微、薄層色譜的比較[11-12]。

中藥指紋圖譜是一種綜合、宏觀和可量化的鑒別手段，可用于對中藥材和中成藥進(jìn)行真?zhèn)舞b別，能較全面地反映中藥的品質(zhì)，控制中藥材的質(zhì)量[14]。本研究收集 16 個批次稱為“救必應(yīng)”的樣品，進(jìn)行 HPLC指紋圖譜的表征和比較，并進(jìn)行相似度分析、主成分分析和聚類分析，為救必應(yīng)的鑒別和質(zhì)量評價提供依據(jù)，并為臨床用藥的安全性和有效性提供技術(shù)保障。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）：SPD-M 20A 二極管陣列檢測器（PDA）、SIL-20A 自 動 進(jìn) 樣 器 、 DGU-20A5在 線 脫 氣 機(jī) 、CTO-10ASvp 柱溫箱和 Shimadzu LC-solution 工作站；KQ-100E 型超聲清洗器（100 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；HHS 型電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）；Sartorius CP225D 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）。

乙腈為色譜純（德國 Merck 公司），水為重蒸水，其他試劑為分析純。收集的 16批樣品均經(jīng)廣州市藥品檢驗(yàn)所劉柏英鑒定，樣品信息見表 1，保存在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 1016 實(shí)驗(yàn)室。

表 1 救必應(yīng)與米碎木樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

樣品粉碎，過 3 號篩，精密稱取 0.1 g，加入 50%甲醇 25 m L，稱定質(zhì)量，超聲處理 30 m in，放冷，再稱定質(zhì)量，用 50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

采用 Agilent Zorbax SB-C18 色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動相 A 為乙腈、B 為水，流速1 m L/m in，檢測波長 210～370 nm Max Plot，進(jìn)樣量10 μL，柱溫 30 ℃，梯度洗脫程序見表 2。

表 2 流動相梯度洗脫程序（%）

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取 S6 樣品粉末，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，采用軟件對樣品的HPLC圖譜進(jìn)行自動匹配。結(jié)果顯示相似度均大于 0.98，且 RSD 值均小于 1%，表明該儀器的精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取 S6 樣品粉末 0.1 g，6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣 6次，采用軟件對樣品的 HPLC 圖譜進(jìn)行自動匹配。結(jié)果顯示相似度均大于 0.98，且RSD 值均小于 1%，表明該方法的重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取 S6 的供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，采用軟件對樣品的 HPLC 圖譜進(jìn)行自動匹配。結(jié)果顯示 24 h內(nèi)色譜圖的相似度均大于 0.98，且 RSD 值均小于 1%，表明該供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立

將 16 批樣品按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行 HPLC 測定，可以明顯將圖譜分成 2 類。其中 S1～S9 的 9 批樣品為一類（見圖 1），與通過性狀鑒別鑒定的救必應(yīng)一致；S10～S16的 7 批樣品為另一類（見圖 2），與通過性狀鑒別鑒定的米碎木一致。

圖 1 救必應(yīng) HPLC 指紋圖譜疊加圖

圖 2 米碎木 HPLC 指紋圖譜疊加圖

2.5 相似度評價

將9批救必應(yīng)指紋圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng) 2004A 版》中，以中位數(shù)生成救必應(yīng)對照指紋圖譜（R1），確定了 31 個共有峰。R1的相似度定為 1，計算各指紋圖譜與 R1的相似度，見表 3。將 7批米碎木進(jìn)行相同處理，生成米碎木對照指紋圖譜（R2），確定了 28 個共有峰，計算各指紋圖譜與 R2的相似度值，見表 4。

2.6 救必應(yīng)的真?zhèn)舞b別

2.6.1 聚類分析 將16批樣品HPLC 指紋圖譜中各色譜峰的峰面積與樣品號建立矩陣，導(dǎo)入 SPSS19.0軟件，采用組間聯(lián)接法，以歐氏距離的平方為測度，對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，得到所有樣品的聚類分析譜圖，見圖 3。結(jié)果表明，16 批樣品可明顯地分為 2 類，S1～S9 聚為一類，S10～S16 聚為另一類，與相似度分析結(jié)果一致。

圖 3 16 批樣品指紋圖譜聚類分析圖

2.6.2 主成分分析 采用 SPSS19.0 軟件對全部樣品進(jìn)行主成分分析，見圖 4。結(jié)果表明，S1～S9 分布在軸右側(cè)區(qū)域，而 S10～S16 分布在軸左側(cè)區(qū)域。該圖直觀反映了各批樣品之間的差異大小，與聚類分析、相似度分析結(jié)果一致。

圖 4 主成分分析圖

3 討論

救必應(yīng)主要含有黃酮類和三萜類化合物，這2類化合物的最大吸收波長差異較大，相關(guān)文獻(xiàn)中的檢測波長也不一致，有 210 nm[12]、265 nm[15]、290 nm[16]。島津高效液相色譜儀 PDA 檢測器有 Max Plot繪圖功能，每個峰都是在其最大吸收波長下采集的，因此本試驗(yàn)結(jié)果可以反映各化合物最優(yōu)的色譜圖。

本試驗(yàn)對色譜條件考察了乙腈-0.5%冰乙酸溶液、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.5%冰乙酸溶液等不同流動相體系[1，11-13]，結(jié)果甲醇-0.5%冰乙酸溶液的色譜峰峰形好且穩(wěn)定，大多數(shù)峰分離良好；同時考察了 25、30、35 ℃柱溫條件下各色譜峰的分離情況，結(jié)果表明，不同柱溫條件下色譜峰略有區(qū)別，當(dāng)溫度升高時，部分峰發(fā)生位移與合并，使分離度降低，因此選擇柱溫為 30 ℃[13，16]。

本試驗(yàn)分別對提取溶劑（30%、50%、70%、100%甲醇）、提取方式（超聲、加熱回流）、提取時間（30、60 m in）及提取體積（10、20、30 m L）進(jìn)行了考察，最終選用 50%甲醇超聲提取 30 m in，提取體積 10 m L，可以使提取更為完全，提取效率更高。

《中華人民共和國藥典》對救必應(yīng)性狀的描述是“厚 1～15 mm”，但本研究收集的 16 批樣品厚度均不超過 10 mm，米碎木厚度也有低于 15 mm 的，厚度不應(yīng)成為救必應(yīng)與米碎木的區(qū)別特征。文獻(xiàn)[12，17]認(rèn)為救必應(yīng)與米碎木的特征性區(qū)別在于后者斷面呈沙粒樣，但本研究收集的救必應(yīng)藥材的斷面也具有少量的沙粒樣。兩者表面均比較粗糙，內(nèi)表面均具有淺條紋，救必應(yīng)更多地具有卷筒狀外觀，米碎木并不都是塊狀。依據(jù)這些性狀尚不能確切對兩者進(jìn)行鑒別。

本研究成功建立了救必應(yīng)及其偽品米碎木的HPLC 指紋圖譜，指出了救必應(yīng)與米碎木的顯著差異，救必應(yīng)有 31 個共有峰，米碎木有 28 個共有峰。從 16批樣品 HPLC 指紋圖譜的相似度及聚類分析、主成分分析可以看出，S1～S9 為一類，S10～S16 為另一類，與性狀鑒別的鑒定結(jié)果一致，能夠客觀、準(zhǔn)確地判別救必應(yīng)藥材的真?zhèn)?，可以有效用于救必?yīng)藥材的質(zhì)量控制。本研究建立的指紋圖譜評價方法簡便易行、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，可為進(jìn)一步提高救必應(yīng)的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

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Identification of Ilicis Rotundae Cortex and Its Adulterant Based on HPLC Fingerprint

Yu-cui1, WANG Chun1, WANG Wei2, WU Cui1, DU Ning2, SUN Wen1, LI Hui1, CHAO Zhi-mao1(1. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; 2. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100094, China)

Objective To establish HPLC fingerprints for the identification of Ilicis Rotundae Cortex (Jiubiying), dried bark of Ilex rotunda Thunb., and its adulterant, dried bark of Ilex godajam (Colebr.) Wall.. Methods Some samples named “Jiubiying” were collected from some medicine markets and drugstores. The HPLC fingerprints were obtained to detect Jiubiying and Ilex godajam. The software “Similarity Evaluation System of Chromatographic Fingerprints of Traditional Chinese Medicine (2004A edition)” was used to evaluate fingerprints. Results The fingerprints of Jiubiying and Ilex godajam were established. Methodological study met the technical requirements of fingerprints. There were 31 and 28 common peaks in Jiubiying and Ilex godajam, respectively. Jiubiying and Ilex godajam could be classified into two clusters by principal component analysis and hierarchical clustering analysis. Conclusion Jiubiying and Ilex godajam can be identified by HPLC fingerprints. This method can provide an effective method for quality evaluation of Jiubiying.

Ilicis Rotundae Cortex (Jiubiying); Ilex godajam (Colebr) Wall.; HPLC; fingerprint; principal component analysis; quality control

R284.1

A

1005-5304(2017)08-0089-04

2017-01-03）

（

2017-02-27；編輯：陳靜）

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局行業(yè)科研專項(xiàng)（201210209）

巢志茂，E-mail：chaozhimao@163.com

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.020