連翹、防風和辛夷混合揮發(fā)油提取及包合工藝研究

于競新，李冰韶，邱玥，張曉陽，連增林，吳清

1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102；2.北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100730；

3.北京亦創(chuàng)生物技術產業(yè)研究院生物中藥技術研究所，北京 101111

連翹、防風和辛夷混合揮發(fā)油提取及包合工藝研究

于競新1，李冰韶1，邱玥1，張曉陽2，連增林3，吳清1

1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102；2.北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100730；

3.北京亦創(chuàng)生物技術產業(yè)研究院生物中藥技術研究所，北京 101111

目的 篩選連翹、防風和辛夷混合的揮發(fā)油提取及 β-環(huán)糊精包合的最佳工藝。方法 以混合揮發(fā)油收取量為指標，單因素試驗考察混合揮發(fā)油的最優(yōu)提取工藝；選用飽和水溶液法，以混合揮發(fā)油包合率為指標，正交試驗設計考察混合揮發(fā)油與 β-環(huán)糊精投料比、包合時間和包合溫度對包合工藝的影響；通過 X 射線衍射法、紅外光譜法以及掃描電鏡法對包合物進行驗證。結果 混合揮發(fā)油提取最優(yōu)工藝為：加 10 倍量水，浸泡 3 h，粉碎成細粉，提取 5 h。最佳包合工藝為：揮發(fā)油（m L）與 β-環(huán)糊精（g）比例為 1∶10，包合溫度為 50 ℃，包合時間為 2 h。X 射線衍射法、紅外光譜法及掃描電鏡均表明混合揮發(fā)油包合物構建相對穩(wěn)定。結論 優(yōu)選的提取和包合工藝穩(wěn)定可行，為進一步制劑開發(fā)提供了研究基礎。

連翹；防風；辛夷；混合揮發(fā)油；β-環(huán)糊精；包合工藝

祛風勝濕方是北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科治療變應性鼻炎的臨床經驗方，其基于中醫(yī)風藥理論，以祛風、疏風、散風藥物為主，輔以開竅清解之品立法配伍而成。全方溫清并舉、疏風散邪、祛風勝濕，對變應性鼻炎具有良好的治療作用。該方由連翹、防風和辛夷等藥組成，連翹、防風和辛夷均含揮發(fā)油且具有抗炎、抗過敏作用。荊防揮發(fā)油對大鼠弗氏完全佐劑所致的關節(jié)炎腫脹、小鼠被動異種皮膚過敏反應抑制作用明顯[1]。辛夷揮發(fā)油能夠調節(jié)變態(tài)反應性鼻炎豚鼠外周血中 Th 細胞免疫，從而維持 Th1/Th2 的動態(tài)平衡[2]。連翹揮發(fā)油有明顯抑制大鼠角叉菜膠性足腫脹和大鼠棉球肉芽形成的作用[3]。3 味藥共同使用，可以共同發(fā)揮對變應性鼻炎的治療作用。因混合揮發(fā)油的水溶性、穩(wěn)定性及具有刺激性氣味等問題，本研究將連翹、防風和辛夷提取揮發(fā)油后，采用 β-環(huán)糊精（β-CD）包合制備包合物，在改善上述問題的同時發(fā)揮其藥效，為其制劑研發(fā)提供基礎，并通過X射線衍射法、紅外光譜法及掃描電鏡法對包合物進行驗證，以確定包合物的成型。

1 儀器與試藥

98-1-B 電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；SARTORIUS 分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（北京科偉永興儀器有限公司）；XD-3X 射線衍射儀（北京普析通用儀器有限責任公司）；Quanta250 掃描電子顯微鏡（捷克 FEI）；NEXUS 傅立葉變換紅外光譜儀（Thermo Nicolet）；高速萬能粉碎機 FW 100，真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（上海知信實驗儀器技術有限公司）；CX-300型超聲波清洗器（北京醫(yī)療設備廠）。

連翹飲片、防風飲片和辛夷飲片均購于安國萌露飲片銷售有限公司，經檢驗符合 2015 年版《中華人民共和國藥典》標準；β-環(huán)糊精（β-CD，天津市光復精細化工研究所，分析純），無水乙醇（北京化工廠，分析純），水為超純水。

2 方法與結果

2.1 混合揮發(fā)油提取工藝

按處方比例稱取 4 倍處方量飲片，即連翹 48 g、防風和辛夷各 40 g，按 2015 年版《中華人民共和國藥典》（四部）2204 通則揮發(fā)油測定法甲法提取，收集揮發(fā)油，無水硫酸鈉脫水，連翹、防風、辛夷混合油為淡黃色液體，密閉，置 4 ℃冷藏備用。

采用單因素試驗方法對連翹、防風和辛夷的混合揮發(fā)油提取工藝進行考察，分別選取浸泡與否、粉碎粒度、提取時間和加水倍量4個因素，以混合揮發(fā)油收取量為指標進行評價。

2.1.1 浸泡與否 稱取連翹 48 g、防風和辛夷各 40 g，加 10倍量水浸泡，以潤濕為標準（經前期試驗，以浸泡 3 h 為宜），之后進行水蒸汽蒸餾提取，至揮發(fā)油量不再增加，讀取揮發(fā)油量，結果見表 1。可見，浸泡與否影響出油速度，浸泡后混合揮發(fā)油能更快提取完全，因而選取浸泡進行提取。

2.1.2 提取時間 稱取連翹 48 g、防風和辛夷各 40 g，加 10倍量水浸泡后提取，蒸餾至揮發(fā)油量不再增加，讀取揮發(fā)油量，結果提取 4、5、6、7、8 h 的揮發(fā)油收取量依次為 1.67、1.73、1.73、1.73、1.73 m L?？梢?，當提取 5 h 后，混合揮發(fā)油的收取量不再增加，因此選取 5 h 作為提取時間。

表 1 浸泡與否對混合揮發(fā)油收取量的影響（m L）

2.1.3 粉碎粒度 稱取連翹 48 g、防風和辛夷各 40 g，加 10 倍量水浸泡，分別以不粉碎、粗粉（10 目）和細粉（80目）進行提取，至揮發(fā)油量不再增加，讀取揮發(fā)油量，結果見表 2?？梢?，粉碎粒度對混合揮發(fā)油提取有一定影響，藥材粉碎成細粉（80目）與不粉碎和粗粉（10目）比較，提取時間短且混合揮發(fā)油提取量最多。因此，選取細粉作為最佳粉碎粒度。

表 2 不同提取時間下粉碎粒度對混合揮發(fā)油收取量的影響（m L）

2.1.4 加水倍量 稱取連翹 48 g、防風和辛夷各 40 g，粉碎成細粉（80 目），分別加入 8、10、12、15 倍量水浸泡后提取，至揮發(fā)油量不再增加，讀取揮發(fā)油量，結果見表 3。可見，加水倍量對混合揮發(fā)油提取有一定影響，但從 10 倍量開始，混合揮發(fā)油的提取量 5 h后基本不再增加，且提取量差異不大，故綜合考慮選用 10倍量水提取。

表 3 不同提取時間下加水倍量對混合揮發(fā)油收取量的影響（m L）

2.1.5 驗證試驗 綜合以上單因素試驗結果，最終選取水蒸汽蒸餾提取混合揮發(fā)油的最優(yōu)工藝為：加 10倍量水，浸泡 3 h，粉碎成細粉，提取 5 h。并對最優(yōu)工藝進行驗證試驗，結果見表 4?？梢?，此工藝驗證結果與之前試驗結果一致，說明優(yōu)選的提取工藝合理、可行。

表 4 混合揮發(fā)油提取工藝驗證試驗結果

2.2 混合揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合工藝

2.2.1 空白回收率測定 精密量取混合揮發(fā)油1 m L，置 500 m L 圓底燒瓶中，加入蒸餾水 250 m L，按 2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）2204 通則揮發(fā)油測定法甲法測定，計算空白回收率（揮發(fā)油收取量÷?lián)]發(fā)油加入量×100%）。結果揮發(fā)油的空白回收率為 94%。

2.2.2 正交試驗設計 選擇飽和水溶液法對混合揮發(fā)油進行包合。選取包合溫度、包合時間、混合揮發(fā)油與 β-CD 比例為考察因素，每個因素 3 個水平（見表 5），以混合揮發(fā)油包合率（包合物回收油量÷?lián)]發(fā)油加入量×空白回收率×100%）為考察指標，采用L9（34）正交設計進行試驗。

表 5 揮發(fā)油包合工藝正交試驗因素水平表

2.2.3 包合物制備 按正交試驗安排進行試驗，取一定量的 β-CD 置錐形瓶中，加入蒸餾水 80 m L，加熱使溶解，制成 β-CD 飽和溶液，冷卻至相應溫度并置于磁力攪拌器上恒溫，加入 1 m L 混合揮發(fā)油與等量無水乙醇的混合溶液，恒溫攪拌至規(guī)定時間，冷卻至室溫，放入冰箱冷藏 24 h，抽濾，包合物用適量水洗滌，再用 5 m L 無水乙醇洗滌，包合物置真空干燥箱中干燥 3 h，即得。

2.2.4 包合率的測定 取收集的干燥包合物，精密稱定，置 500 m L 圓底燒瓶中，加入 250 m L 蒸餾水，連接揮發(fā)油提取裝置，按 2015 年版《中華人民共和國藥典》（四部）2204 通則揮發(fā)油測定法甲法提取揮發(fā)油，保持微沸 5 h，至油量不再增加，收集混合揮發(fā)油，計算混合揮發(fā)油的包合率，結果見表 6、表 7。

2.2.5 正交試驗結果與分析 直觀分析結果顯示，最優(yōu)包合工藝為 A3B2C2。方差分析結果表明，各因素對揮發(fā)油包合率均無顯著影響。因此，確定最優(yōu)包合工藝為 A3B2C2，即揮發(fā)油（m L）與 β-CD（g）比例為 1∶10、包合溫度為 50 ℃、包合時間為 2 h。

表 6 混合揮發(fā)油包合工藝正交試驗結果

表 7 混合揮發(fā)油包合工藝方差分析

2.2.6 包合工藝驗證試驗 按照直觀分析的最優(yōu)包合工藝條件，進行 3批驗證試驗，結果見表 8。由驗證結果可知，混合揮發(fā)油 β-CD 包合工藝所得包合率RSD＜2%，表明確定的包合工藝合理、穩(wěn)定、可行。

表 8 混合揮發(fā)油包合工藝驗證試驗結果（%）

2.3 包合物驗證

2.3.1 X 射線衍射鑒定 采用 X 射線衍射鑒定進行表征，鑒定包合物的包合情況。取 β-CD、混合揮發(fā)油 β-CD 包合物以及 β-CD 和混合揮發(fā)油的物理混合物，分別進行 X 射線衍射試驗，以掃描角度為橫坐標，衍射強度為縱坐標，采用 Origin 軟件繪制 X 射線衍射圖，結果見圖 1?？梢姡?CD、包合物和物理混合物的特征峰存在明顯區(qū)別，包合物在 2θ為 5°～8°、10°～12°、16°～26°、16°～26°左右產生新的吸收峰，在 8°～10°、12°～14°、26°～28°、34°～36°左右的吸收峰消失或減弱。因此，可以認為混合揮發(fā)油已經進入 β-CD 空腔結構內，形成揮發(fā)油包合物。

圖 1 混合揮發(fā)油 β-CD 包合物 X 射線衍射圖

2.3.2 紅外光譜法鑒定 在波長 400～4000 cm-1范圍內對混合揮發(fā)油、β-CD、混合揮發(fā)油 β-CD 包合物、混合揮發(fā)油與 β-CD 的物理混合物進行紅外光譜掃描。采用 KBr壓片法，將一定量 β-CD、包合物、物理混合物與 KBr混合研磨后壓成薄片（每 2 mg 樣品加 200 mg 干燥 KBr粉末）。混合揮發(fā)油則搭載于 KBr所制薄片上。先使用空白 KBr薄片作為背景采集，然后進行樣品紅外光譜掃描，分辨率為 8，掃描次數(shù)為60 次，比較紅外吸收區(qū)吸收峰的變化，結果見圖 2。

圖 2 混合揮發(fā)油 β-CD 包合物紅外光譜圖

β-CD 紅外光譜圖中，在 3385.70 cm-1處的吸收峰是-OH 伸縮振動產生的，在 2925.02 cm-1處的吸收峰是-CH2-的 C-H 伸縮振動產生的，在 1651.94 cm-1處的吸收峰是 H-O-H 彎曲振動產生的，在 1157.56 cm-1處的吸收峰是 C-O 伸縮振動產生的，在 1030.00 cm-1處的吸收峰是 C-O-C 伸縮振動產生的?；旌蠐]發(fā)油紅外光譜圖中，在 2961.48 cm-1處的吸收峰是=CH2伸縮振動產生的，在 2927.45 cm-1處的吸收峰是-CH2-的 C-H伸縮振動產生的，在 1647.27 cm-1處的吸收峰是 C=C伸縮振動產生的，在 1452.74 cm-1處和 1377.13 cm-1處的吸收峰是-CH2-彎曲振動產生的，在 1234.96 cm-1處的吸收峰是 CH2=CH-振動產生的。物理混合物的紅外光譜約為 β-CD 和混合揮發(fā)油吸收峰的疊加，而包合物的紅外光譜與揮發(fā)油完全不同。在包合物的紅外光譜圖中，混合揮發(fā)油在 2961.48、1647.27、1452.74、1234.96 cm-1處的吸收峰均消失，而且與 β-CD 在3385.70 、 1651.94 cm-1處 相 對 應 的 吸 收 峰 移 到 了3375.41、1637.58 cm-1，同時在 1333.52、1079.74 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰。以上說明混合揮發(fā)油與 β-CD相互作用形成了新的物象，證實包合物已經形成。

2.3.3 掃描電鏡鑒定 以 β-CD、混合揮發(fā)油 β-CD包合物、混合揮發(fā)油與 β-CD 的物理混合物為樣品，分別置于雙面膠帶上并粘在樣品臺上，于真空條件下噴金，掃描電鏡觀察樣品的表觀形態(tài)，結果見圖3。

圖 3 混合揮發(fā)油 β-CD 包合物掃描電鏡圖（×2000）

由掃描電鏡結果可知，β-CD 為板狀晶體，表面較為光滑；物理混合物類似于 β-CD，物理混合物表面附載著大量的油滴，且可觀察到油附著于 β-CD 的晶體上；包合物為結晶狀物質，其晶體的形狀和大小不同于 β-CD 和物理混合物，晶體體積比 β-CD 和物理混合物小，而且表面幾乎沒有油滴附著。上述結果可證明混合揮發(fā)油已經進入 β-CD 的空腔內形成了新物相。

3 討論

本研究選取 β-CD 對祛風勝濕方中連翹、防風和辛夷混合揮發(fā)油進行包合工藝研究，是考慮到 β-CD本身無不良反應，且在中藥揮發(fā)油制劑中應用廣泛[4-7]。但目前對此 3 種藥物的混合揮發(fā)油包合工藝尚無相關報道，故綜合文獻所報道的 β-CD 中藥揮發(fā)油包合工藝及包合物驗證試驗方法，選擇飽和水溶液法制備混合揮發(fā)油包合物，并通過X射線衍射法、紅外光譜法以及掃描電鏡法對混合揮發(fā)油包合物進行驗證[8-10]，以確保包合物制備方法穩(wěn)定可行。最終，本試驗制備出較為穩(wěn)定的混合揮發(fā)油 β-CD 包合物，使液體藥物粉末化，增強了混合揮發(fā)油的水溶性，提高了其穩(wěn)定性，掩蓋了藥物的刺激性氣味，為日后制劑的制備提供了研究基礎。

但有文獻報道粉碎與否對于揮發(fā)油提取的規(guī)模化生產的顧慮[11]，也有文獻報道將藥材粉碎成細粉進行揮發(fā)油提取[5]。本試驗選取細粉作為粉碎粒度的最優(yōu)工藝，主要有以下2個原因：首先，有文獻報道粉碎藥材對揮發(fā)油提取效果更好[12]。本試驗所用 3 味藥，連翹入藥部位為果實，防風入藥部位為根，辛夷入藥部位為花蕾[13]，其中連翹果實和辛夷花蕾均有較為堅硬的外殼，而防風的根也較為堅實。因此，將三者粉碎有助于混合揮發(fā)油提取，不僅能夠增加混合揮發(fā)油提取量，還可縮短提取時間，有利于提高規(guī)模化生產效率及節(jié)省能源消耗。且試驗結果也證實粉碎較不粉碎混合揮發(fā)油提取效果佳，粉碎成細粉提取效果更佳。其次，將3味藥材粉碎成細粉進行后續(xù)提取，在提取過程中并未發(fā)生糊化、爆沸及過篩困難等問題而致提取不能順利進行[14]。故認為可嘗試根據(jù)試驗最優(yōu)結果，將連翹、防風和辛夷粉碎成細粉，進行混合揮發(fā)油的規(guī)模化提取。

連翹、防風和辛夷的混合揮發(fā)油成分較為復雜，單一指標包合率不足以全面評價包合物的質量，今后還應增加新的指標測定，如混合揮發(fā)油成分在包合前后的變化及相應質量評價，從而制定更完善的標準控制包合物的質量。

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Study on Extraction and Inclusion Processes of M ixed Volatile Oils from Forsythiae Fructus, Saposhnikoviae Radix and M agnoliae Flos

YU Jing-xin1, LI Bing-shao1, QIU Yue1, ZHANG Xiao-yang2, LIAN Zeng-lin3, WU Qing1(1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; 2. TCM Department, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730, China; 3. TCM Biotechnology Institute of Beijing Yichuang Biotechnology Academy, Beijing 101111, China)

Objective To optimize the extraction process of mixed volatile oil from Forsythiae Fructus, Saposhnikoviae Radix and Magnoliae Flos and inclusion process of β-cyclodextrin (β-CD). Methods With yield ratio of volatile oil as evaluation index, single factor experiments were used to study the extraction process of volatile oil; saturated aqueous solution was used, With inclusion rate of volatile oil as index, and orthogonal design was adopted to examine effects of charge ratio of volatile oil and β-CD, inclusion temperature and inclusion time on the inclusion process; X-ray scattering technique, infrared spectroscopy and scanning electron microscopy were used to characterize the inclusion compound. Results The optimum extraction process of volatile oil was soaking fine powder extracted 5 hours With 10 folds the amount of water. The optimum conditions of inclusion process were as follows∶mixed ratio of volatile oil (m L) and β-CD (g) was 1∶10; inclusion temperature was 50 ℃; the inclusion time was 2 h. X-ray scattering technique, infrared spectroscopy and scanning electron microscopy proved the inclusion compound had been formed. Conclusion Optimum extraction and inclusion processes are stable and feasible, and can provide research foundation for further research and development of preparation.

Forsythiae Fructus; Saposhnikoviae Radix; Magnoliae Flos; mixed volatile oil; β-cyclodextrin; inclusion process

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.018

R283.5

A

1005-5304(2017)08-0080-05

2016-12-20）

（

2017-01-09；編輯：陳靜）

吳清，E-mai l：qwu@vip.sina.com