蘇木、川芎對(duì) PG-BE1 干細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)志蛋白ABCG2影響的體內(nèi)研究

王耀焓，張培彤，楊棟，韓海英，郭秀偉，祁鑫，張蕓

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科，北京 100053

蘇木、川芎對(duì) PG-BE1 干細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)志蛋白ABCG2影響的體內(nèi)研究

王耀焓，張培彤，楊棟，韓海英，郭秀偉，祁鑫，張蕓

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科，北京 100053

目的 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量蘇木、川芎對(duì)腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)志物 ABCG2 的影響。方法 將無血清培養(yǎng)獲得的球細(xì)胞接種于裸鼠腋下，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、蘇木高劑量組、蘇木低劑量組、川芎高劑量組和川芎低劑量組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，21 d 后檢測(cè)抑瘤率，激光共聚焦、Western blot和 RT-PCR分別檢測(cè)瘤體 ABCG2 蛋白和 mRNA 表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)無血清培養(yǎng)獲得的球細(xì)胞具有無限增殖、抗凋亡、高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物等干細(xì)胞性能，川芎高、低劑量組可明顯抑制瘤體生長(zhǎng)（P＜0.05），其中川芎低劑量組抑瘤率明顯高于川芎高劑量組，蘇木高、低劑量組雖對(duì)瘤體有一定的抑制作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組比較，川芎低劑量組可明顯抑制ABCG2蛋白的表達(dá)，蘇木高、低劑量組對(duì)ABCG2蛋白表達(dá)均無抑制作用，除川芎低劑量組外，各給藥組對(duì) ABCG2 mRNA 表達(dá)均有上調(diào)作用。結(jié)論 低劑量川芎可能通過抑制腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2蛋白的表達(dá)，靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞。

蘇木；川芎；腫瘤干細(xì)胞；ABCG2蛋白

化療在改善腫瘤患者生存質(zhì)量、提高患者生存率方面起到重要作用。然而，化療耐藥的存在一直制約著臨床療效的發(fā)揮。有研究顯示，經(jīng)化療后再?gòu)?fù)發(fā)或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，大約 40%是由于化療耐藥引起的[1]。因此，尋找可以增強(qiáng)化療敏感性的藥物是目前面臨的挑戰(zhàn)。近幾年來，腫瘤干細(xì)胞理論的提出對(duì)化療耐藥的治療提出了新的理念。該理論認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、多向分化、化療耐藥等性能，是腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的主要原因。課題組前期研究表明，蘇木、川芎嗪對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用[2-3]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，蘇木、雞血藤及二者聯(lián)合順鉑可以將腫瘤細(xì)胞阻滯在 G0/G1 期，并可抑制與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、低氧誘導(dǎo)因 子 -1α （HIF-1α ）表 達(dá) ，另 外 對(duì) P16-Cyclin D1-CDK4-RB 途徑也具有調(diào)節(jié)作用，三者相互作用共同阻滯腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，我們選用川芎、蘇木作為活血的代表藥，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量蘇木、川芎對(duì)肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的干預(yù)作用。ABCG2 蛋白是目前比較公認(rèn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物之一。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究在體內(nèi)環(huán)境中不同劑量川芎、蘇木對(duì) PG-BE1 干細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)志蛋白 ABCG2的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

BALB/c-nu 裸鼠，4～6 周齡，體質(zhì)量（16±2）g，雌雄各半，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào) SYXK（京）2013-0032，飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 細(xì)胞系

高轉(zhuǎn)移性人巨細(xì)胞肺癌細(xì)胞 PG-BE1，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤研究室。

1.3 藥物

蘇木、川芎，康美藥業(yè)股份有限公司；順鉑注射液，齊魯制藥（海南）有限公司，批號(hào) 20120724。

1.4 主要試劑與儀器

Human FGF-basic（美國(guó) Pero Tech），Human EGF（美國(guó) Pero Tech），B27 Supplement（50×，美國(guó)Gibco），Tripsin inhibition from Glycine max（soybea，美國(guó) Sigma），Anti-BCRP/ABCG2 抗體（美國(guó) Abcam），CCK8 試劑盒（日本同人），ANNEXIN V（美國(guó) BD），ABCG2 Gene、A lexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG（H+L）、TRIzol Reagent（美國(guó) Life Technologies）。高速冷凍離心機(jī)（美國(guó) Sigma），NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)（美國(guó) Thermo Scientific），PROGENE PCR 擴(kuò)增儀（英國(guó) Techene），Applied Biosysterns 7500 RT-PCR Systems（美國(guó) ABI），DYY-12 型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠），Chem iDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó) Bio-Rad），ZEISS LSM 710 激光共聚焦顯微鏡（德國(guó) Zeiss），水平電泳槽（美國(guó) Bio-Rad）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備、分組及給藥

取蘇木、川芎各 15 g，雙蒸水浸泡 30 min，煎煮2 次，將 2 次煎劑濃縮至 60 m L，濃度 0.25 g/m L，為高劑量藥液。另取蘇木、川芎各 5 g，雙蒸水浸泡 30 min，將 2 次煎劑濃縮至 100 m L，濃度 0.05 g/m L，為低劑量 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、川芎低劑量組、川芎高劑量組、蘇木高劑量組、蘇木低劑量組，每組5只，蘇木低、高劑量和川芎低、高劑量小鼠給藥劑量相當(dāng)于成人（體質(zhì)量 60 kg）臨床給藥量 10、30 倍（成人每日臨床給藥量為蘇木、川芎各10 g）。小鼠給藥體積為 200 μL/次，1 次/d。

2.2 干細(xì)胞樣細(xì)胞分選

常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng) PG-BE1 細(xì)胞，待其生長(zhǎng)至 70%～80%時(shí)，胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，PBS 清洗 2 次，重懸于含 0.02 μg/m L EGF、0.02 μg/m L bFGF、5 μg/m L 胰島素、2%B27、4%BSA 的 DMEM/F-12 的培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度 2×104/孔，接種于低黏附 6 孔板，待細(xì)胞成球且折光率變低時(shí)收集 PG-BE1 球細(xì)胞，離心、胰酶消化，1 mg/m L 大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化，重懸于上述完全培養(yǎng)基 DMEM/F-12 中。使用傳代至第 3 代的 PG-BE1 球細(xì)胞。

2.3 干細(xì)胞樣細(xì)胞鑒定

2.3.1 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 分別收集PG-BE1貼壁細(xì)胞及第 3 代 PG-BE1 球細(xì)胞，接種于 96 孔板，1000 個(gè)/孔，分為 3、4、5、6、7 d 組，每組 5 個(gè)復(fù)孔。分別于第 3、4、5、6、7 日時(shí)加入 Cell Counting Kit-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑，10 μL/100 μL 培養(yǎng)基，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（OD）。

2.3.2 AV/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分別收集PG-BE1貼壁細(xì)胞及第 3 代 PG-BE1 球細(xì)胞，預(yù)冷的 PBS 清洗細(xì)胞2 次，并重懸于 1×Binding Buffer，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/m L。取 100 μL 上述細(xì)胞懸液置于流式管中，加 5 μL FITC Annexin V 及 5 μL PI。輕柔震蕩細(xì)胞，室溫（25 ℃）避光孵育 15 m in。每管加 400 μL 1×Binding Buffer，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.3.3 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞 ABCG2 表達(dá) 分別收集PG-BE1 貼壁細(xì)胞及第 3 代 PG-BE1 球細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×105/m L，接種于 96 孔板。24 h 后，每孔依次加入 4%多聚甲醛固定，0.1%Triton-X 透膜，免疫熒光封閉液室溫封閉 1 h，一抗 4 ℃孵育過夜，熒光二抗避光孵育 1 h，滴加 DAPI避光孵育 5 min，最后加入適量抗熒光淬滅封片液。

2.3.4 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞 ABCG2、SOX-2、Nanog、OCT-4 表達(dá) 分別收集 PG-BE1 貼壁細(xì)胞及第 3 代PG-BE1 球細(xì)胞，提取蛋白。BCA 法測(cè)定各組總蛋白濃度，分別制備濃縮膠與分離膠，加樣后分別行蛋白電泳、電轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉封閉后，一抗（稀釋倍數(shù) 1∶1000）、二抗（稀釋倍數(shù) 2∶1000）孵育各 1 h，暗室中滴加超敏發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2.4 川芎、蘇木對(duì)裸鼠模型抑瘤率的影響

將 1×107/m L 濃度 PG-BE1 球細(xì)胞接種于裸鼠腋下，0.2 m L/只，24 h 后，連續(xù)給藥 21 d，小鼠脫頸處死，稱量瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量－對(duì)照組平均瘤質(zhì)量）÷對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

2.5 激光共聚焦檢測(cè)瘤體內(nèi) ABCG2 蛋白表達(dá)

將腫瘤組織從液氮中取出，冷凍切片包埋劑包埋，置于-20 ℃冰凍切片機(jī)中待其凝固；將已凝固腫瘤組織進(jìn)行粗切片，直至露出腫瘤組織為止，切取 8 μm厚度、完整的組織切片，平鋪在防脫磨砂載玻片上，室溫放置 10 min；然后將玻片浸泡于 4 ℃丙酮中，固定 10 min；PBS 沖洗 3 次×10 m in；再將玻片浸泡于免疫封閉液中，封閉 1 h；PBS 沖洗 3 次，滴加一抗Anti-BCRP/ABCG2（按 1∶100 比例稀釋），4 ℃過夜；PBS 沖洗 3 次，滴加 Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG（H+L）二抗（稀釋濃度 1∶200），室溫避光孵育1 h；PBS 沖洗，滴加 DAPI，室溫避光孵育 5 m in；PBS沖洗，滴加抗熒光淬滅封片液，蓋玻片封片，激光共聚焦顯微鏡拍照。

2.6 Western blot 檢測(cè)腫瘤組織 ABCG2 蛋白表達(dá)

分別收集各組腫瘤組織，提取蛋白。用 BCA 法測(cè)定各組總蛋白濃度，分別制備濃縮膠與分離膠，加樣后分別行蛋白電泳、電轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉封閉后，一抗（稀釋倍數(shù) 1∶1000）、二抗（稀釋倍數(shù) 2∶1000）孵育各 1 h 后于暗室中滴加超敏發(fā)光液，于 ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用 Image J 軟件分析各組蛋白表達(dá)量。

2.7 RT-PCR 檢測(cè)腫瘤組織 ABCG2 基因表達(dá)

分別提取各組腫瘤組織 RNA，應(yīng)用 Nanodrop 測(cè)定RNA濃度與純度，并驗(yàn)證RNA完整性。將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量，檢測(cè)各組基因表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s 表示，符合正態(tài)分布用 t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 干細(xì)胞樣細(xì)胞分選結(jié)果

接種后第3日可見細(xì)胞球形成，隨時(shí)間延長(zhǎng)，球體積變大，折光率變低，傳代至第 3 代的 PG-BE1 球細(xì)胞，見圖1。

圖 1 PG-BE1 球細(xì)胞成球情況（×200）

4.2 CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果

PG-BE1 球細(xì)胞組第 3、4、5、6、7 日 OD 值明顯高于 PG-BE1 貼壁細(xì)胞（P＜0.01）；以 PG-BE1 貼壁細(xì)胞 OD 值為基線，其 PG-BE1 球細(xì)胞第 3、4、5、6、7 日相對(duì) OD 值分別為 0.10、0.17、0.21、0.24、0.32，見圖 2。

圖 2 PG-BE1 球細(xì)胞增殖趨勢(shì)圖

4.3 AV/PI 檢測(cè)結(jié)果

PG-BE1 球細(xì)胞和貼壁細(xì)胞早期凋亡率分別為0.638%、1.273%（P＜0.05）；中晚期凋亡率分別為2.53%、2.78%，PG-BE1 球細(xì)胞中晚期凋亡率低于PG-BE1 貼壁細(xì)胞（P＞0.05），見圖 3。

圖 3 PG-BE1 球細(xì)胞和貼壁細(xì)胞凋亡率比較

4.4 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

PG-BE1 球細(xì)胞 ABCG2 高表達(dá)，而 PG-BE1 貼壁細(xì)胞ABCG2低表達(dá)甚至不表達(dá)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 4、圖 5。

圖 4 PG-BE1 球細(xì)胞 ABCG2 蛋白表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

圖 5 PG-BE1 貼壁細(xì)胞 ABCG2 蛋白表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

4.5 Western blot 檢測(cè)結(jié)果

ABCG2 蛋白在 PG-BE1 球細(xì)胞中表達(dá)量明顯高于 PG-BE1 貼壁細(xì)胞（P＜0.05）。OCT-4、Nanog 在PG-BE1 貼壁細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，而在 PG-BE1球細(xì)胞中可見明顯表達(dá)（P＜0.05）；SOX-2 在 PG-BE1球細(xì)胞及貼壁細(xì)胞中表達(dá)也有明顯差異（P＜0.01）。見圖6。

圖 6 腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)

4.6 不同劑量川芎、蘇木對(duì)抑瘤率的影響

川芎高、低劑量組和蘇木高、低劑量組抑瘤率分別為 36.26%、42.63%、24.60%、26.32%。與對(duì)照組比較，川芎高、低劑量組可明顯抑制瘤體生長(zhǎng)（P＜ 0.05），其中川芎低劑量抑瘤率明顯高于川芎高劑量組（P＜0.05）；蘇木各劑量組雖對(duì)瘤體有一定的抑制作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 7。

圖 7 各組 PG-BE1 球細(xì)胞抑瘤率比較

4.7 激光共聚焦檢測(cè)不同劑量川芎、蘇木對(duì)瘤組織ABCG2 蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，蘇木各劑量組 ABCG2蛋白表達(dá)無明顯差異，川芎各劑量組可明顯抑制 ABCG2蛋白的表達(dá)，見圖8。

圖 8 激光共聚焦檢測(cè) ABCG2 蛋白表達(dá)（×200）

4.8 Western blot 檢測(cè)不同劑量川芎、蘇木對(duì) ABCG2蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，川芎低劑量組可抑制ABCG2蛋白的表達(dá)（P＜0.05），川芎高劑量組對(duì) ABCG2 蛋白的表達(dá)無明顯的抑制作用；蘇木各劑量組對(duì) ABCG2蛋白表達(dá)均無抑制作用。見圖9。

圖 9 各組瘤組織 ABCG2 蛋白表達(dá)

4.9 RT-PCR 檢測(cè)不同劑量川芎、蘇木對(duì) ABCG2 mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，除川芎低劑量組外，各給藥組對(duì)ABCG2 mRNA 表達(dá)均有上調(diào)作用，見圖 10。

圖 10 各組瘤組織 ABCG2 mRNA 表達(dá)比較

5 討論

側(cè)群（side population，SP）細(xì)胞可以特異性地將Hoechst33342 染料快速泵出細(xì)胞外。研究發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞具有某些干細(xì)胞特性，如具有極強(qiáng)的自我更新及增殖能力[6]。目前，在許多組織胚胎及腫瘤細(xì)胞中，都發(fā)現(xiàn)了 SP 細(xì)胞的存在[7-11]。他們具有與干細(xì)胞相似的干性，如同源性、自我更新能力、多向分化潛能?；诖?，很多學(xué)者認(rèn)為 SP細(xì)胞中富含干細(xì)胞，是干細(xì)胞研究的重要資源，可以作為干細(xì)胞分離、鑒定的一種方法[12]。

而 SP 細(xì)胞之所以可以將 Hoechst33342 染料泵出細(xì)胞外，是因?yàn)?ABCG2蛋白的存在。三磷酸腺苷結(jié)合盒（ATP binding cassette，ABC）超家族是一種由多種轉(zhuǎn)運(yùn)體組成的、在機(jī)體內(nèi)廣泛表達(dá)的大家族。ABCG2蛋白作為 ABC 家族成員之一，與 SP 細(xì)胞表型的表達(dá)存在密切關(guān)系，如 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性可被ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑或者鈣離子通路阻滯劑所抑制，從而減少 SP 表型[13]。Zhou S 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，雖然不同 SP細(xì)胞來源于不同的組織，但均表達(dá) ABC 家族中的 ABCG2/BCRP1 耐藥基因，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，ABCG2/BCRP1 的表達(dá)與 SP 細(xì)胞表型呈強(qiáng)相關(guān)，即 ABCG2/BCRP1 是 SP 細(xì)胞表型特征的決定因素。因此，認(rèn)為 ABCG2蛋白可以作為另一種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物用于腫瘤干細(xì)胞的鑒定。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用無血清培養(yǎng)法獲得 PG-BE1 球細(xì)胞，經(jīng)抗凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)球細(xì)胞凋亡能力、CCK-8 法檢測(cè)球細(xì)胞增殖能力、Western blot檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力、抗凋亡能力，高表達(dá) ABCG2、Nanog、OCT-4、SOX2 等蛋白。而 Nanog、OCT4、SOX2 基因是干細(xì)胞中代表性標(biāo)志物，與干細(xì)胞多潛能性和自我更新能力有密切關(guān)系，是目前腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物之一。本實(shí)驗(yàn)中獲得的 PG-BE1 球細(xì)胞在高表達(dá) SOX2、OCT-4、Nanog 蛋白的同時(shí)高表達(dá)ABCG2蛋白，表明 ABCG2蛋白作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的可靠性。以上體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無血清球培養(yǎng)獲得的 PG-BE1 球細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞干性。

目前大量實(shí)驗(yàn)研究顯示，中藥提取物或中醫(yī)復(fù)方在殺傷腫瘤干細(xì)胞方面存在較好療效。研究發(fā)現(xiàn)異甘草素可以通過抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新及多向分化而明顯降低乳腺癌細(xì)胞中 SP 及 CSC 的比率[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GRP78 作為異甘草素的直接作用靶點(diǎn)，異甘草素可以剪短 ATP 表達(dá)域中 GRP78 的表達(dá)，進(jìn)而抑制 ATP 酶的活性、促進(jìn) β-catenin 降解，導(dǎo)致β-catenin/ABCG2 信號(hào)通路失活；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，異甘草素可通過 GRP78/β-catenin/ABCG2 信號(hào)通路增強(qiáng)乳腺癌干細(xì)胞的化療敏感性，且對(duì)周圍組織及乳腺干細(xì)胞無毒副作用。姜黃素通過誘導(dǎo) ABCG2耐藥蛋白的低表達(dá)，提高乳腺癌干細(xì)胞對(duì)絲裂霉素的敏感性，達(dá)到殺傷乳腺癌干細(xì)胞、減少球細(xì)胞形成、低表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物 CD44+CD24-的目的。經(jīng)姜黃素干預(yù)的乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇、順鉑、阿霉素等化療藥的敏感性明顯提高[16]。片仔癀對(duì) SP 細(xì)胞分選出的結(jié)腸癌干細(xì)胞有顯著的殺傷作用，且呈劑量依賴性。其可以抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞活性及成球能力，深入研究發(fā)現(xiàn)片仔癀對(duì)腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用與其可以抑制ABCG2 mRNA 的表達(dá)有關(guān)[17]。

本研究以ABCG2蛋白作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，觀察蘇木、川芎體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì) PG-BE1 干細(xì)胞樣細(xì)胞的作用，經(jīng)激光共聚焦及 Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，低、高劑量蘇木及高劑量川芎對(duì) ABCG2蛋白并無抑制作用，而低劑量川芎可明顯抑制 ABCG2蛋白的表達(dá)。故而認(rèn)為低劑量川芎對(duì) PG-BE1 干細(xì)胞樣細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。進(jìn)一步經(jīng) RT-PCR 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，低劑量川芎組可明顯抑制 ABCG2 mRNA 的表達(dá)，其余各組對(duì) ABCG2 mRNA 表達(dá)均為上調(diào)作用，Western blot與 RT-PCR 的結(jié)果基本一致。因此，考慮低劑量川芎對(duì) ABCG2 蛋白的抑制作用可能與其抑制 ABCG2 mRNA 的表達(dá)相關(guān)，低劑量川芎對(duì) PG-BE1 干細(xì)胞樣細(xì)胞殺傷作用可能是通過抑制ABCG2蛋白在mRNA水平的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1] GERBER B. Recur rent breast cancer：t reatment strategies for maintaining and prolonging good qual ity of l ife[J]. Dtsch Arztebl Int,2010,107(6)：85-91.

[2] 楊棟,張培彤,王耀焓,等.川芎嗪對(duì)高轉(zhuǎn)移性人肺巨細(xì)胞癌 PG-BE1 干細(xì)胞樣細(xì)胞黏附能力的影響[J].中醫(yī)雜志,2015,56(13)：1140-1144.

[3] 江保中,張培彤,楊棟,等.蘇木對(duì) PG 細(xì)胞增殖、黏附及侵襲能力的影響[J].中國(guó)腫瘤,2014,23(3)：239-243.

[4] 郭秀偉,張培彤,楊棟,等.蘇木含藥血清對(duì)人肺癌 PG 細(xì)胞增殖周期影響的對(duì)比研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014,34(6)：745-750.

[5] 郭秀偉,張培彤,楊棟,等.雞血藤血清聯(lián)合順鉑對(duì)人肺癌 PG 細(xì)胞增殖及周期影響的研究[J].中國(guó)腫瘤,2016,26(3)：219-225.

[6] YEH J Y, HUANG W J, KAN S F, et al. Ef fects of bufalin and cinobufagin on the proli feration of androgen dependent and independent prostate cancer cel ls[J]. Prostate,2003,54(2)：112-124.

[7] NIGAM A. Breast cancer stem cel ls, pathways and therapeytic perspect perspectives 2011[J]. Indian J Surg,2013,75(3)：170-180.

[8] GAO Y J, LI B, WU X Y, et al. Thyroid tumor-initiating cel ls：increasing evidence and opportunities for anticancer therapy (review)[J]. Oncol Rep,2014,31(3)：1035-1042.

[9] ZHANG H H, CAI A Z, WEI X M, et al. Characterization of cancer stem-like cel ls in the side population cel ls of human gastric cancer cel l l ine MKN-45[J]. J Zhej iang Univ-Sci B,2013,14(3)：216-223.

[10] LIU J, CHI N, ZHANG J Y, et al. Isolation and characterization of cancer stem cel ls f rom medul loblastoma[J]. Genet Mol Res,2015, 14(2)：3355-3361.

[11] XIE Z Y, LV K, XIONG Y, et al. ABCG2-meditated mul tidrug resistance and tumor-initiating capacity of side population cel ls f rom colon cancer[J]. Oncol Res Treat,2014,37(11)：666-668.

[12] CHALLEN G A, LITTLE M H. A side order of stem cel ls：the SP phenotype[J]. Stem Cel ls,2006,24(1)：3-12.

[13] UNNO K, JAIN M, LIAO R. Cardiac side population cel ls：moving toward the center stage in cardiac regeneration[J]. Circ Res, 2012,110(10)：1355-1363.

[14] ZHOU S, SCHUETZ J D, BUNTING K D, et al. The ABC transpor ter BCRP1/ABCG2 is expressed in awide variety of stem cel ls and is a molecular determinant of the side-population phenotype[J]. Nat Med,2001,7(9)：1028-1034.

[15] WANG N, WANG Z H, CHENG P, et al. Dietary compound isol iquiritigenin targets GRP78 to chemosensitize breast cancer stem cel ls via β-catenin/ABCG2 signal ing[J]. Carcinogenesis, 2014,35(11)：2544-2554.

[16] ZHOU Q M, YE M N, LU Y Y, et al. Curcumin improves the tumoricidal ef fect of mitomycin C by suppressing ABCG2 expression in stem cel l-l ike breast cancer cel ls[J]. PLoS One,2015,10(8)：e0136694.

[17] WEI L H, CHEN P Y, CHEN Y Q, et al. Pien Tze Huang suppresses the stem-l ike side population in colorectal cancer cel ls[J]. Molecular Medicine Reports,2014,9(1)：261-266.

Effects of Sappan Lignum and Chuanxiong Rhizoma on Expression of ABCG2 Protein of PG-BE1 Stem Like Cells in Vivo

WANG Yao-han, ZHANG Pei-tong, YANG Dong, HAN Hai-ying, GUO Xiu-wei, QI Xin, ZHANG Yun (Department of Oncology, Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China)

Objective To observe the effects of different doses of Sappan Lignum and Chuanxiong Rhizoma on tumor stem cells marker ABCG2 in vivo. Methods Sphere cells obtained from serum culture were inoculated in nude mouse armpit, which were random ly divided into 5 groups∶ control group, Sappan Lignum high- and low-dose groups, and Chuanxiong Rhizoma high- and low-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage. 21 days later, inhibition tumor rate and ABCG2 protein and mRNA expression were detected With confocal m icroscope, Western blot, and RT-PCR. Results The sphere cells obtained from serum free culture had the abilities of cancer stem cells, such as proliferation, anti-aptosis and high expression of cancer stem cells markers. Chuanxiong Rhizoma high- and low-dose groups could inhibit tumor grow th (P＜0.05), and the inhibitory rate of Chuanxiong Rhizoma low-dose group was higher than the Chuanxiong Rhizoma high-dose group. Sappan Lignum high- and low-dose groups inhibited tumor grow th Without statistical significiance (P＞0.05). Compared With the control group, Chuanxiong Rhizoma low-dose group could significantly inhibit the expression of resistant protein of ABCG2. Sappan Lignum high- and low-dose groups could not inhibit the protein expression of ABCG2. Each medication group up-regulated the mRNA expression of ABCG2 except for Chuanxiong Rhizoma low-dose group. Conclusion Low dose of Chuanxiong Rhizoma can inhibit the expression of ABCG2 protein levels, which can be the targeting killer for cancer stem cells.

Sappan Lignum; Chuanxiong Rhizoma; cancer stem cells; ABCG2 protein

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.014

R285.5

A

1005-5304(2017)08-0060-06

2016-11-06）

（

2017-02-26；編輯：華強(qiáng)）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81173450）

張培彤，E-mai l：zhangpeitong@sohu.com