氣質(zhì)聯(lián)用-內(nèi)標(biāo)法測(cè)定豆類中脂肪酸含量及因子分析

錢宗耀 劉河疆 張維維 帕爾哈提

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所；農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

氣質(zhì)聯(lián)用-內(nèi)標(biāo)法測(cè)定豆類中脂肪酸含量及因子分析

錢宗耀 劉河疆 張維維 帕爾哈提

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所；農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

對(duì)市售9種豆類(鷹嘴豆、黃豆、青豆、花蕓豆、扁豆、豌豆、綠豆、黑豆、紅豆)中的脂肪酸組分進(jìn)行含量測(cè)定，以十一烷酸甘油三酯為內(nèi)標(biāo)物，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)各個(gè)樣品中脂肪酸甲酯組分進(jìn)行分析，輔助NIST檢索工具鑒定各脂肪酸組分。建立內(nèi)標(biāo)法計(jì)算豆類中脂肪酸組分含量的方法。結(jié)果表明，9種豆類樣品脂肪酸組分及含量均有差異，其中青豆的總脂肪含量最高，鷹嘴豆的不飽和脂肪酸含量最高。通過軟件分析相關(guān)性，其中各組分間除十五烷酸外，都具有很好的顯著相關(guān)性，主成分分析獲得前2個(gè)主成分可以解釋全部變異的98%。聚類分析將9種豆類歸入4大類。該方法前處理簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確度高，分析時(shí)間較短，可為內(nèi)標(biāo)法測(cè)定脂肪酸含量的研究提供借鑒。

豆類 脂肪酸 氣質(zhì)聯(lián)用 內(nèi)標(biāo)法 因子分析 聚類分析

當(dāng)今社會(huì)人們對(duì)膳食結(jié)構(gòu)的研究日益關(guān)注，對(duì)食品的要求也從生理需要向營(yíng)養(yǎng)、食用健康等方面關(guān)注，豆類的品種很多，泛指所有能產(chǎn)生豆莢的豆科植物，是中國(guó)人的傳統(tǒng)食品。各種豆類均含有人體必須的營(yíng)養(yǎng)成分，有很高的食用和保健價(jià)值，可以提高人體的抵抗能力，能有效降低心臟病和癌癥的發(fā)病幾率[1-2]，天然食物均含有各種不同的脂肪酸成分，脂肪酸有著重要的生理功能，是人類所需的營(yíng)養(yǎng)之一，脂肪酸的種類很多，不同脂肪酸對(duì)人體的作用各不相同，單獨(dú)討論某種或某類脂肪酸的好壞是不科學(xué)的，脂肪酸不同比例的合理攝入在一定程度上關(guān)系著人體的健康，因此研究不同食品中脂肪酸組分具有很高的營(yíng)養(yǎng)學(xué)價(jià)值，同時(shí)對(duì)各種樣品中的脂肪酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定也是趨勢(shì)。

目前根據(jù)豆類的營(yíng)養(yǎng)素種類可將它們分為2大類：一類為高蛋白質(zhì)、高脂肪豆類，另一類則以碳水化合物含量高為特征，本試驗(yàn)選擇9種常見膳食豆類進(jìn)行脂肪酸含量測(cè)定，較為系統(tǒng)地對(duì)多種豆類進(jìn)行脂肪酸含量的比較，通過主成分分析和系統(tǒng)聚類分析進(jìn)行研究。本測(cè)定方法與傳統(tǒng)方法相比較簡(jiǎn)便快捷，色譜分離完全，專屬性好，質(zhì)譜具有準(zhǔn)確的定性功能，可完全對(duì)脂肪酸組分進(jìn)行定性。本研究可為豆類樣品的脂肪酸含量檢測(cè)提供可靠的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)對(duì)象

鷹嘴豆、黃豆、青豆、花蕓豆、扁豆、豌豆、綠豆、黑豆、紅豆：市售。

1.1.2 主要試劑

脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、十一烷酸甘油三酯(純度≥99%，5.00 mg/mL)：美國(guó)Sigma公司。正己烷、甲醇：Fisher Scientific公司；氫氧化鉀：天津盛奧化學(xué)試劑廠。

1.1.3 主要儀器

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(配電子轟擊離子源)：Perkin Elmer公司；分析天平：OHAUS公司；旋渦混合器 ：IKA公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪酸甲酯化

準(zhǔn)確稱取不同豆類樣品的均勻粉末2.5 g 于試管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液2.0 mL，加入5.0 mL氫氧化鉀—甲醇溶液(2.0 mol/L)，漩渦混勻后，40 ℃水浴20 min進(jìn)行脂肪酸甲酯化，冷卻至室溫后分別加入5.0 mL正己烷進(jìn)行脂肪酸甲酯萃取，每個(gè)樣品分別漩渦30 s后靜置分層后，取上層有機(jī)相(正己烷)稀釋后用微孔濾膜(0.45 μm)過濾后裝進(jìn)樣瓶進(jìn)行氣相色譜—質(zhì)譜儀器分析。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件

色譜柱：FFAP(30 m×0.25 mm×0.5 μm)；載氣：氦氣(99.999%)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣：1.0 μL，分流比1:10；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫：初始溫度80 ℃，以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持15 min；離子化方式：電子轟擊(EI)；離子化能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度270 ℃；溶劑延遲：2 min；掃描范圍：50～450 amu；掃描方式：全離子掃描(SCAN)。

1.2.3 豆類樣品中脂肪酸組分定性分析

對(duì)混合脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行全離子掃描分析，輔助NIST2011譜圖庫檢索進(jìn)行脂肪酸甲酯化合物質(zhì)譜解析并確定各種脂肪酸甲酯的保留時(shí)間。通過保留時(shí)間及譜圖檢索匹配各種豆類脂肪酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 豆類樣品中脂肪酸組分定量分析

對(duì)測(cè)試樣品的色譜圖進(jìn)行解析，通過內(nèi)標(biāo)法公式[3]進(jìn)行計(jì)算：

式中：Xi為樣品中脂肪酸甲酯i的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；Fi為脂肪酸甲酯i的響應(yīng)因子；Ai為樣品中脂肪酸甲酯i的峰面積；Ac11為樣品加入內(nèi)標(biāo)物甲酯峰面積；Cc11為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度/mg/mL；Vc11為樣品加入內(nèi)標(biāo)物體積/mL；1.006 7為十一碳酸甘油三酯轉(zhuǎn)化為甲酯的轉(zhuǎn)換系數(shù)；m為樣品的質(zhì)量/mg；Csi為混標(biāo)中脂肪酸甲酯i的質(zhì)量濃度/mg/mL；Ac11為十一碳酸甲酯面積；Asi為脂肪酸甲酯i的峰面積。Cc11為混標(biāo)中十一烷酸甲酯的質(zhì)量濃度/mg/mL。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)樣品均稱取3份，每個(gè)樣品平行測(cè)定2次，取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，涉及相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析、聚類分析和方差分析方法使用SPSS 22.0軟件比較分析，置信區(qū)間為95%。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的確定

目前脂肪酸的測(cè)定試驗(yàn)均需要進(jìn)行樣品的甲酯化反應(yīng)，常規(guī)的甲酯化方法有三氟化硼法、三甲基氫氧化硫法(TMSH)法、重氮甲烷、鹽酸-甲醇、硫酸-甲醇和氫氧化銨-甲醇等[4-5]，以上方法均有一定的局限性。本文采用氫氧化鉀—甲醇法進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，通過多次試驗(yàn)均證明效果較好[6-7]，該方法操作過程無危害、簡(jiǎn)單快速、重現(xiàn)性好。

2.2 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品色譜分析

將脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣，通過優(yōu)化最佳的色譜條件進(jìn)行分析，由氣-質(zhì)聯(lián)用儀工作站所得的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。各組分分離情況良好，內(nèi)標(biāo)物與其他組分也相互沒有干擾，已達(dá)到定性與定量測(cè)定分析的要求。

圖1 脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)總離子流色譜圖

2.3 色譜儀器重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一樣品重復(fù)測(cè)定3次，按試驗(yàn)步驟進(jìn)行分析，其中各脂肪酸含量變異系數(shù)(CV)值均低于3%，表明試驗(yàn)儀器穩(wěn)定性較好，測(cè)定數(shù)據(jù)符合要求。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.4 方法精密度試驗(yàn)

平行稱取5個(gè)鷹嘴豆樣品按方法進(jìn)行脂肪酸甲酯化試驗(yàn)，同時(shí)測(cè)定其含量并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，該值均低于8%，表明該方法精密度較高，符合試驗(yàn)測(cè)定的要求。

表2 豆類樣品脂肪酸相關(guān)參數(shù)(n=3)

注：“—”表示含量很低或未檢出，SFA為飽和脂肪酸，MUFA為單不飽和脂肪酸，PUFA為多不飽和脂肪酸，AI=[C12∶0+4×C14∶0+C16∶0]/Σ(MUFA+PUFA)為動(dòng)脈粥硬化指數(shù)，PS=PUFA/SFA。

2.5 豆類樣品中脂肪酸含量測(cè)定結(jié)果

本試驗(yàn)測(cè)定的9種豆類品種中均含有約10種脂肪酸成分，脂肪酸組分有近似也有差異，由內(nèi)標(biāo)法公式計(jì)算所得各種脂肪酸甲酯含量，以及按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[3]脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)換系數(shù)的計(jì)算結(jié)果和脂肪酸相關(guān)參數(shù)對(duì)比見表2?？梢姴煌诡悩悠返暮坑休^大的差別，每種樣品的總脂肪含量比較見圖2，脂肪酸種類圖比較見圖3，其中青豆的總脂肪含量最高約為

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。圖2 豆類樣品總脂肪含量比較

14 990 mg/100 g，而試驗(yàn)中紅豆脂肪含量最低為743 mg/100 g；鷹嘴豆的不飽和脂肪酸含量最高。

圖3 不同脂肪酸種類比較

2.6 測(cè)定脂肪酸組成指標(biāo)間的相關(guān)性分析

本試驗(yàn)測(cè)定的11項(xiàng)脂肪酸組成指標(biāo)間經(jīng)過軟件分析相關(guān)性結(jié)果見表3，通過分析各種脂肪酸組分及含量相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)除十五烷酸不具有相關(guān)性，其他脂肪酸組分都具有很好的極顯著相關(guān)性，為分析提供很好的數(shù)據(jù)支持。

表3 相關(guān)系數(shù)矩陣

注：*表示顯著相關(guān)(P<0.05)；**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)。

2.7 豆類樣品主成分分析

2.7.1 相關(guān)系數(shù)矩陣特征值和累積貢獻(xiàn)率分析

主成分分析可以將具有復(fù)雜關(guān)系的變量，通過降維來反映出相應(yīng)的內(nèi)在聯(lián)系，從而選擇少數(shù)具有主導(dǎo)作用的獨(dú)立變量。由表4可見，根據(jù)累積貢獻(xiàn)率達(dá)到85%以上，信息損失量在15%以下的原則，通過分析可以得出以下結(jié)論：在選擇前2個(gè)主成分分別解釋總變異的84.6%和13.6%，則累積貢獻(xiàn)率就可以達(dá)到98.2%，因此可以將前2個(gè)定義為第1主成分和第2主成分。

表4 相關(guān)系數(shù)矩陣特征值和累積貢獻(xiàn)率

2.7.2 主成分的特征向量

通過軟件進(jìn)行主成分分析可以得到主成分特征向量值和因子載荷圖，分別見表5和圖4，從數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出第1主成分包括肉豆蔻酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生酸、花生一烯酸、山崳酸；第2主成分包括十五烷酸。其中十七烷酸、花生酸、花生一烯酸、二十二烷酸雖然含量較小，卻是不同品種間的特征脂肪酸，可為不同品種豆類的鑒定提供參考。

表5 主成分的特征向量

圖4 主成分因子載荷圖

2.8 豆類樣品聚類分析探討

豆類樣品的品種不同，其脂肪酸組成和含量也有一定的差異，對(duì)此以脂肪酸含量作為變量對(duì)試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行聚類分析探討，基于軟件得出的聚類圖(圖5)將9種豆類樣品分為四大類，其中黃豆和青豆一類；花蕓豆、扁豆、豌豆、綠豆和紅豆歸為一大類；鷹嘴豆和黑豆各為獨(dú)立類。

圖5 不同豆類樣品的單聯(lián)樹狀聚類圖

3 討論

本研究主要以脂肪酸組分及含量作為特性指標(biāo)建立分析模型，在對(duì)試驗(yàn)的9種豆類進(jìn)行相應(yīng)的分析后可以發(fā)現(xiàn)豆類含有豐富的脂肪酸，并且脂肪酸組分含量及相對(duì)比例也有很大的區(qū)別，某些特征性脂肪酸雖然含量較低，但對(duì)人體健康具有一定的保健功效，比如肉豆蔻酸能減少前列腺增生發(fā)生的幾率[8]。不飽和脂肪酸對(duì)人體血脂和心血管疾病的影響已得到廣泛的研究[9]，富含不飽和脂肪酸的食品可有效降低血脂、預(yù)防心血管疾病的功效[10]，被推薦給該疾病的高危人群食用。亞麻酸具有降血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化和益智等保健功效，亦是多不飽和脂肪酸的母體，在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為DHA、DPA、EPA等人體所必須的脂肪酸[11]。這些特征性脂肪酸是評(píng)價(jià)脂肪酸甲酯的重要指標(biāo)，同時(shí)對(duì)不同豆類的品質(zhì)及鑒定有重要影響，本研究可對(duì)不同豆類品質(zhì)評(píng)價(jià)工作提供借鑒。

在脂肪酸與人類疾病相關(guān)研究中，飽和脂肪是導(dǎo)致心血管疾病高發(fā)的膳食品種，本試驗(yàn)結(jié)果在相關(guān)參數(shù)統(tǒng)計(jì)中引入動(dòng)脈粥硬化指數(shù)(Atherogenicity Index)比率[12]僅供參考，該值越低，表明該類膳食種類具有較好的抗動(dòng)脈粥硬化的作用，從本研究可以看出，青豆、黑豆、鷹嘴豆與黃豆均有較低的比率，作為保健食品在人類長(zhǎng)期飲食習(xí)慣及科學(xué)研究[13-15]結(jié)果均與本研究結(jié)果相符。

3 結(jié)論

通過氣質(zhì)聯(lián)用-內(nèi)標(biāo)法對(duì)豆類樣品的脂肪酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，各種豆類的脂肪酸種類和含量均具有顯著的差異；結(jié)合統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組脂肪酸成分具有很好的相關(guān)性，由于不同的豆類所含脂肪酸的差異，選取合適的主成分可以更加突出脂肪酸信息的特征性，對(duì)豆類進(jìn)行聚類-主成分分析，得到很好的聚類識(shí)別，可將其分為四大類。但由于植物種類的多樣性，脂肪酸成分和含量的不確定性，基于脂肪酸信息分析識(shí)別種類的研究還需要深入地研究。

[1]李曦, 陳明遠(yuǎn). 營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生[M]. 北京: 旅游與教育出版社, 2000: 50 Li Xi, Chen Mingyuan. Nutrition and food hygiene[M]. Beijing: Tourism and Education Press, 2005:50

[2]李鐸. 食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社. 2011: 197 Li Duo. Food nutrition[M]. Beijing: Chemical Industry Press. 2011: 197

[3]GB/T 22223-2008食品中總脂肪、飽和脂肪(酸)、不飽和脂肪(酸)的測(cè)定水解提取-氣相色譜法[S]. 2008 GB/T 22223-2008 Determination total fat saturated fat and unsaturated fat foods-hydrolyticextraction-gas chromatography[S]. 2008

[4]莊俊鈺, 馮志強(qiáng), 謝忠陽. 氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定深海魚油中的EPA和DHA[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2009, 25(11): 1363-1365 Zhuang Junyu, Feng Zhiqiang, Xie Zhongyang. Determination of EPA and DHA in deep sea fish oil by gas chromatography using internal standard method[J]. Modern Food Science and Technology, 2009, 25(11): 1363-1365

[5]吳偉都, 金世梅, 朱慧. 氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定奶粉及乳飲料中的DHA和EPA[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2005(1): 106-108 Wu Weidu, Jin Shimei, Zhu Hui. Determination of DHA and EPA in milk powder and milky products by internal standard method and gas chromatography[J]. China Food Additives, 2005(1): 106-108

[6]錢宗耀, 曹曉倩, 王成. 氣質(zhì)聯(lián)用法分析魚油膠囊中脂肪酸組成[J]. 糧油食品科技, 2014, 22(6): 44-45 Qian Zongyao, Cao Xiaoqian, Wang Cheng. Analysis of fatty acids composition from fish oil capsules by gas chromatography mass spectrometry[J]. Science and Technology of Cereals Oils and Foods, 2014, 22(6): 44-45

[7]錢宗耀, 鄭偉華, 華震宇, 等. 氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析玫瑰花中脂肪酸組成[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014, 42(2): 241-242 Qian Zongyao, Zheng Weihua, Hua Zhenyu, et al. Determination of the fatty acids composition from flower of rosa rugosa thunb by gas chromatography mass spectrometry[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2014, 42(2): 241-242

[8]Veeresh Babu S V, Veeresh B, Patil A A, et al. Lauric acid and myristic acid prevent testosterone induced prostatic hyperplasia in rats[J]. European Journal of Pharmacology, 2001, 626(2): 262-265

[9]Connor W E. Importance of n-3 fatty acids in health and disease[J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 2000, 71(suppl): 171-175

[10]Ramsden C E, Hibbeln J R, Majchrak S F, et al. N-6 fatty acid-specific and mixed polyunsaturate dietary interventions have different effects on CHD risk: a meta-analysis of randomised controlled trials[J]. British Journal of Nutrition, 2010, 104: 1586-1600

[11]Brenna J T, Salem J N, Sinclair A J, et al. α-Linolenic acid supplementation and conversion to n-3 long chain polyunsaturated fatty acids in humans[J]. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acid, 2009, 80(2):85-91 [12]Hedayat H, Maryam M, Masoud R, et al. Effect of different cooking methods on minerals, vitamins and nutritonal quality indices of kutum roach(Rutilusfrisiikutum)[J]. Food Chemistry, 2014, 148: 86-91

[13]王玉芹, 陳娜, 阿吉艾克拜爾, 等. 維藥鷹嘴豆及活性部位降血糖作用研究[J]. 中成藥, 2007, 29(12):1832-1834 Wang Yuqin, Chen Na, Agee Akbar, et al. Study the hypoglycemic effect of chickpea and active sites of Uygur medicine[J]. Chinese Traditional Patent Medicine, 2007, 29(12): 1832-1834

[14]馬正偉, 張喜忠. 復(fù)合膳食纖維對(duì)高膽固醇血癥大鼠膽固醇代謝的長(zhǎng)期作用[J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2002,10(5):400-404 Ma Zhengwei, Zhang Xizhong. Long-term effect of dietary fiber complex on cholesterol metabolism in hypercholesterolemic rats[J]. Chinese Journal of Arteriosclerosis, 2002, 10(5): 400-404

[15]劉憶梅, 陳朝暉. 大豆蛋白肽降血脂功能性的研究[J]. 大豆通報(bào), 2004(3): 22 Liu Yimei, Chen Chaohui. Study on the functional properties of soybean protein peptide[J]. Soybean Bulletin, 2004(3): 22.

Determination of Fatty Acids and Factor Analysis from Beans by Gas Chromatography Mass Spectrometry Using Internal Standard Method

Qian Zongyao Liu Hejiang Zhang Weiwei Paerhati

(Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research, Xinjiang Academy of Agricultural Science; Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products (Urumqi), Ministry of Agriculture,Ulumuqi 830091)

To study on the fatty acid composition in 9 kinds of beans samples including chickpea ,soybean, green pea, colored kidney bean, dolichos lablab, pea, mung bean, black bean, red bean, using the compound C11∶0 methyl ester for internal standard, the technology of gas separation of fatty acid methyl ester composition and composition analysis of NIST helper tools to retrieve chromatography-mass spectrometry. The results showed that both fatty acid components and contents were difference between 9 kinds of beans samples of this experiment. It could be seen that green beans had the highest total fat content in those samples, and chickpeas had the highest content of unsaturated fatty acids. Through software analysis, the correlation between the components of each group was very significant except C15∶0, The first principal components obtained by factor analysis could account for 98% of all variations. The single linkage dendrograms based on principal component values divided the 9 kinds of beans into 4 clusters. This method was simple and fast, the analytic time was short and the result was accurate, which could provide reference for the similar products fatty acid content determination.

beans,fatty acids,GC-MS,internal standard method,factor analysis,cluster analysis

新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助(KY2015082)

2015-07-09

錢宗耀，男，1982年出生，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

帕爾哈提，男，1961年出生，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，土壤重金屬污染物研究

TS201

A

1003-0174(2017)02-0130-06