擠壓芝麻粕釀造醬油的制曲參數(shù)對中性蛋白酶活力的影響

曹燕飛，成曉苑，王一冉，李宏軍

(山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

擠壓芝麻粕釀造醬油的制曲參數(shù)對中性蛋白酶活力的影響

曹燕飛，成曉苑，王一冉，李宏軍*

(山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

以芝麻粕及面粉膨化物為原料進(jìn)行制曲，選擇制曲溫度、制曲時(shí)間、輔料比例、潤水比例4個(gè)因素為制曲工藝參數(shù)，以中性蛋白酶活力為考察指標(biāo)，通過四因素五水平二次旋轉(zhuǎn)正交組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用SAS 9.1軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析，可以得到最佳制曲參數(shù)：制曲溫度為33 ℃，制曲時(shí)間為42 h，輔料比例為28%，潤水比例為95%。在此參數(shù)下，膨化物種曲的中性蛋白酶為8132 U/g干基。

制曲；擠壓；芝麻粕；中性蛋白酶活力

長期以來，釀造醬油一般是以大豆或豆粕等為蛋白質(zhì)原料，以面粉、麩皮為輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵，制作出富含多種氨基酸、糖類、醇類、酯類、酚類等香味物質(zhì)的調(diào)味品[1]。目前國內(nèi)已經(jīng)開始對豆粕、花生粕醬油進(jìn)行研究，而對芝麻粕醬油的研究甚少。芝麻粕是生產(chǎn)芝麻油后的副產(chǎn)物，一般為深褐色[2]，其蛋白質(zhì)含量為 42.5%～47.9%，鈣和磷的含量也比豆餅、棉籽餅高3～5倍[3]。芝麻餅粕中還含有豐富的必需氨基酸、木酚素、維生素B以及部分礦物質(zhì)等[4]。

采用低溫?cái)D壓膨化技術(shù)來對芝麻粕原料進(jìn)行預(yù)處理，可以使原料的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，一般為蜂窩狀或片狀[5]。這樣的結(jié)構(gòu)利于細(xì)菌菌絲朝著原料內(nèi)部生長, 使淀粉鏈和肽鏈主動(dòng)吸附酶, 增大蛋白酶和淀粉酶含量，有利于酶與原料充分發(fā)生相互作用[6,7]，故曲中蛋白酶和淀粉酶含量比常規(guī)法高[8]，從而簡化了制曲工藝，縮短了發(fā)酵周期，提高了醬油的質(zhì)量[9]。制曲是釀造醬油過程的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，能夠?yàn)槊浊箘?chuàng)造優(yōu)良的生長環(huán)境[10]，促進(jìn)曲霉生長發(fā)育，并產(chǎn)生后期發(fā)酵過程所需要的各種酶[11]。其中，蛋白酶活力是考察制曲好壞的主要指標(biāo)，根據(jù)曲子的蛋白酶活力將原料利用率間接估算出，以及衡量醬油質(zhì)量等級[12]。

本文利用擠壓膨化技術(shù)對芝麻粕、面粉混合物進(jìn)行預(yù)處理，以此膨化物為原料進(jìn)行制曲試驗(yàn)，采用SAS 9.1軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究制曲溫度、制曲時(shí)間、輔料比例、潤水比例的制曲工藝參數(shù)對膨化物中性蛋白酶活力的影響規(guī)律，通過嶺回歸尋優(yōu)獲得最佳的制曲工藝參數(shù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

芝麻粕 淄博十里香食品有限公司；面粉、麩皮 淄博市面粉廠；滬釀3.042米曲霉 山東巧媳婦食品集團(tuán)有限公司。

部分式單螺桿擠壓機(jī) 山東理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)室；UV-1700型紫外分光光度計(jì)、AUY-220型電子分析天平 日本島津公司。

1.2 擠壓膨化芝麻粕和面粉等混合物

將面粉比例為26%、物料含水量為21%，與芝麻粕混勻之后進(jìn)行膨化處理。擠壓參數(shù)為：模孔孔徑6 mm，螺桿轉(zhuǎn)速210 r/min，擠壓溫度90 ℃。適當(dāng)?shù)卣{(diào)整切刀轉(zhuǎn)速，使擠出物被切成1～3 mm的薄片，及時(shí)放到已滅菌的容器中，冷卻后使用。

1.3 膨化物制曲

以米曲霉為種子，制作三角瓶種曲備用。接種到擠壓膨化物料中混勻后放到30～34 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17 h進(jìn)行第1次翻曲，23 h后第2次翻曲，2.5～3天后得到成曲。

1.4 試驗(yàn)方法

以膨化物為原料得到的成曲用福林酶法測得中性蛋白酶活力[13]。試驗(yàn)選擇制曲溫度、制曲時(shí)間、輔料比例、潤水比例為試驗(yàn)因素，以中性蛋白酶為考察指標(biāo)，采用四因素五水平二次正交組合設(shè)計(jì)來對試驗(yàn)進(jìn)行安排，制曲試驗(yàn)因素水平編碼表見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平編碼表

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)安排與結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)因素水平編碼表，應(yīng)用SAS 9.1軟件對考察指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析來探究低溫?cái)D壓芝麻粕釀造醬油的制曲條件對指標(biāo)的影響，從而對試驗(yàn)進(jìn)行安排，試驗(yàn)安排與數(shù)據(jù)見表2。

表2 試驗(yàn)安排與結(jié)果

續(xù) 表

注：X1為制曲溫度(℃)；X2為制曲時(shí)間(h)；X3為輔料比例(%)；X4為潤水比例(%)；Y為中性蛋白酶活力(U/g干基)。

2.2 中性蛋白酶活力的響應(yīng)面分析及結(jié)果

利用SAS 9.1.3軟件對表2中醬油的中性蛋白酶活力數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)、回歸模型方差分析以及響應(yīng)面，見表3、表4、圖1～圖4。

表3 中性蛋白酶活力的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表

由表3可知，模型的常數(shù)項(xiàng)(Pr<0.0001)極顯著；一次項(xiàng)X1(Pr=0.0045<0.01)，X3(Pr=0.0028<0.01)極顯著，X3(Pr=0.0306<0.05)較顯著；二次項(xiàng)X12(Pr<0.0001)，X22(Pr<0.0001)，X32(Pr<0.0001)和X42(Pr<0.0001)極顯著；交互項(xiàng)X2X1(Pr=0.0008<0.01)、X3X2(Pr=0.0001<0.01)和X4X2(Pr=0.0011<0.01)極顯著；剩下的項(xiàng)數(shù)都不顯著。

表4 中性蛋白酶活力的方差分析表

續(xù) 表

由表4可知，此模型的決定系數(shù)R2為0.9858，線性(Pr<0.0001)、二次項(xiàng)(Pr<0.0001)、交互項(xiàng)(Pr<0.0001)和總回歸(Pr<0.0001)均極顯著。失擬(Pr=0.2842>0.05)不顯著。由此可以說明中性蛋白酶活力的數(shù)據(jù)與模擬相吻合。

輔料比例28%、制曲時(shí)間41 h時(shí)，制曲溫度和潤水比例對中性蛋白酶活力影響的響應(yīng)面，見圖1。

圖1 潤水比例和制曲溫度的響應(yīng)面分析

由圖1可知，當(dāng)制曲溫度恒定時(shí)，隨潤水比的增加中性蛋白酶活力升高，潤水比在90%左右時(shí)達(dá)到最大值，適當(dāng)?shù)臐櫵饶軌蛱峁┻m合霉菌生長的最適水分活度及含水量。當(dāng)潤水比一定時(shí)，中性蛋白酶活力在取值范圍內(nèi)有最大值，即溫度在33 ℃左右時(shí)酶活力最大，繼續(xù)升溫，蛋白酶活力會隨著制曲溫度的增加出現(xiàn)下降的趨勢。高溫導(dǎo)致米曲霉生長緩慢，產(chǎn)生少量的孢子和菌絲，酶的含量也會隨之減少[14]。實(shí)際生產(chǎn)中，制曲溫度控制在30～35 ℃，盡可能不超過40 ℃，否則會出現(xiàn)燒曲現(xiàn)象[15]。

輔料比例28%，潤水比例為90%的條件下，制曲溫度和制曲時(shí)間對中性蛋白酶活力影響的響應(yīng)面，見圖2。

圖2 制曲溫度和制曲時(shí)間的響應(yīng)面分析

由圖2可知，制曲溫度低于31 ℃或高于35 ℃時(shí)都會影響中性蛋白酶活力，溫度在33 ℃時(shí)，適合產(chǎn)酶微生物的生長，酶活性最高。制曲時(shí)間達(dá)到41 h時(shí)，中性蛋白酶活力最大，長時(shí)間制曲導(dǎo)致蛋白酶失活[16]。

制曲溫度33 ℃、制曲時(shí)間41 h的條件下，輔料比例和潤水比例對中性蛋白酶活力影響的響應(yīng)面，見圖3。

圖3 輔料比例和潤水比例的響應(yīng)面分析

由圖3可知，當(dāng)輔料比例一定時(shí)，孢子生長隨著潤水比例的增加而逐漸活躍，酶活力增強(qiáng)，潤水比例為90%時(shí)，中性蛋白酶活力最高，潤水比例繼續(xù)增加時(shí)，擠壓物料形成糊狀，就會抑制孢子和菌絲的生長，酶活力減弱同時(shí)開始出現(xiàn)雜菌，使原料中營養(yǎng)物質(zhì)被分解，影響成曲的品質(zhì)[17]。米曲霉為好氧微生物，高含水量的環(huán)境會抑制其生長，曲中雜菌大量繁殖產(chǎn)酸導(dǎo)致米曲霉不能夠形成優(yōu)勢菌群，影響制曲效果。當(dāng)潤水比例不變時(shí)，中性蛋白酶活力隨著輔料比例的增大出現(xiàn)先升高后下降的趨勢。

制曲溫度33 ℃，潤水比例90%的條件下，制曲時(shí)間和輔料比例對中性蛋白酶活力影響的響應(yīng)面，見圖4。

圖4 輔料比例和制曲時(shí)間的響應(yīng)曲面分析

由圖4可知，當(dāng)輔料比固定時(shí)，制曲時(shí)間過短或過長，都會使酶的活力下降，制曲時(shí)間在41 h左右，酶的活力最強(qiáng)。當(dāng)制曲時(shí)間不變時(shí)，中性蛋白酶活力隨著輔料比例的升高而增加，在輔料比例為28%左右時(shí)中性蛋白酶活力達(dá)到最大值，輔料比例超過30%時(shí)，蛋白酶活力顯著下降。這是因?yàn)檩o料比例低時(shí)，由于空隙小使得種曲內(nèi)溶氧不夠充分，導(dǎo)致米曲霉生長遲緩；麩皮比例太高時(shí)，米曲霉生長因缺少氮源而受到抑制[18]。

2.3 嶺回歸尋找最優(yōu)工藝范圍

表5 中性蛋白酶活力的嶺回歸尋優(yōu)分析結(jié)果

由表5可知，以中性蛋白酶活力為考察指標(biāo)，經(jīng)過嶺回歸選優(yōu)得到最佳制曲工藝參數(shù)范圍：制曲溫度32～33 ℃，輔料比例23%～28%，潤水比例92%～98%，制曲時(shí)間41～44 h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)安排及結(jié)果

在最佳的制曲工藝參數(shù)范圍內(nèi)做驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)以蒸煮法處理的芝麻粕和面粉混合物為原料制曲來做對照試驗(yàn)，結(jié)果見表6。

表6 中性蛋白酶驗(yàn)證與對照試驗(yàn)的安排

注：X1為制曲溫度(℃)；X2為制曲時(shí)間(h)；X3為輔料比例(%)；X4為潤水比例(%)；Y為中性蛋白酶活力(U/g干基)。

由表6可知，試驗(yàn)組數(shù)據(jù)均在較好范圍內(nèi)，所以最終確定制曲參數(shù)為：制曲溫度33 ℃，制曲時(shí)間42 h，輔料比例28%，潤水量95%，以擠壓處理得到的膨化物進(jìn)行制曲測得的中性蛋白酶活力在8000 U/g干基左右，最高可達(dá)到8132 U/g干基。以蒸煮法處理原料進(jìn)行制曲測得的中性蛋白酶活力最高為7838 U/g干基。與對照組相比，試驗(yàn)組提高了294 U/g干基。

3 結(jié)論

利用擠壓膨化技術(shù)對芝麻粕、面粉混合物進(jìn)行處理，以此膨化物為原料進(jìn)行制曲；以中性蛋白酶活力為考察指標(biāo)，通過“四因素五水平”二次旋轉(zhuǎn)正交組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用SAS 9.1軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析，可以得到最佳制曲參數(shù)：制曲溫度33 ℃，制曲時(shí)間42 h，輔料比例28%，潤水比例95%。在此參數(shù)下，膨化物種曲的中性蛋白酶活力為8132 U/g干基。

[1]包啟安.醬油釀造科學(xué)與釀造技術(shù)[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2011.

[2]徐文俊,張崟,姬懿珊,等.芝麻粕利用的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2014(6):64-67.

[3]王長生.淺談芝麻餅粕資源及詞料營養(yǎng)價(jià)值[J].飼料工業(yè),1995,16(4):35-36.

[5]范文海,馬亮,張貴陽,等.擠壓膨化的新技術(shù)與應(yīng)用[J].飼料工業(yè),2009(5):1-3.

[6]徐沖,王靜,曹維強(qiáng).擠壓膨化技術(shù)在醬油生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國調(diào)味品,2005(5):4-6.

[7]何國慶,吳長青.擠壓膨化技術(shù)在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用[M].杭州:浙江大學(xué)出版社,1999.

[8]楊一兵,李雄輝.膨化豆粕在低鹽固態(tài)醬油生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].江蘇調(diào)味副食品,1998(1):9-11.

[9]王丹兵,張桂.擠壓與膨化技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用與發(fā)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2006(1):64-65.

[10]楊列俊.淺談醬油制曲工藝[J].中國調(diào)味品,1996(3):16-20.

[11]C Chancharoonpong,P C Hsieh,S C Sheu.Enzyme production and growth ofAspergillusoryzaeS.on soybean koji fermentation[J].Apcbee Procedia,2012,2(6):57-61.

[12]T Suganuma,F K Kitahara.Some distinguishable properties between acid-stable and neutral types of amylases from acid-producing koji[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2007,104(5):353-362.

[13]周涌,張嵐,李杰,等.木瓜蛋白酶水解蛙劈制備活性肽的工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(15):8564-8566.

[14]潘平平,邱琳,鄧開野.曲霉型豆豉多菌種制曲工藝優(yōu)化的研究[J].中國調(diào)味品,2016,41(3):26-31.

[15]毋瑾超,胡錫鋼,陳全震.醬油發(fā)酵中制曲條件對制曲效果的影響[J].糧油食品科技,2004,12(2):7-8.

[16]Y Ishigami，H Ishikawa，R Ueda,et al.Studies on the changes in microflora and its metabolisms during koji-making process in soy sauce brewing[J].Journal of Fermentation Technology,1965,43(3):165-173.

[17]蔣繼豐,冮潔,吳耘紅,等.膨化黑米在醬油及醬生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技,2003,24(5):56-58.

[18]馬成業(yè),鄭慧,李媛,等.擠壓豆粕制曲工藝參數(shù)對蛋白酶活力的影響[J].中國調(diào)味品,2015,40(4):1-5.

Effect of Koji-making Parameters on Neutral Protease Activity in Soy Sauce Production with Extruded Sesame Meal

CAO Yan-fei, CHENG Xiao-yuan, WANG Yi-ran, LI Hong-jun*

(School of Agricultural Engineering and Food Science, Shandong University of Technology, Zibo 255049，China)

Soy sauce koji is produced by extruded mixture of sesame meal and wheat flour as raw materials. koji-making temperature, koji-making time, bran proportion and moisture proportion are the four technological parameters, and use neutral protease activity as index for investigation.Quadratic orthogonal rotating combination design of four factors and five levels is adopted to optimize the parameters of koji making and the data is obtained by SAS 9.1.The optimal conditions are as follows: temperature is 33 ℃, koji-making time is 42 h, bran proportion is 28% and moisture proportion is 95%,under such conditions,the neutral protease activity is 8132 U/g dry basis.

koji making；extrusion；sesame meal；neutral protease activity

2017-02-08 *通訊作者

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013GSF12108)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471676)

曹燕飛(1993-)，女，山東威海人，碩士，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品高值化加工； 李宏軍(1968-)，男，遼寧鐵嶺人，教授，博士，研究方向:食品科學(xué)。

TS264.21

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.005

1000-9973(2017)07-0020-05