不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)大鼠血清與肝臟中hepcidin水平及相關(guān)調(diào)節(jié)因素的影響

沙繼斌張成崗

1山東體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)與健康學(xué)院（濟(jì)南 250102）2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所（北京 100850）

不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)大鼠血清與肝臟中hepcidin水平及相關(guān)調(diào)節(jié)因素的影響

沙繼斌1，2張成崗2

1山東體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)與健康學(xué)院（濟(jì)南 250102）2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所（北京 100850）

目的：比較耐力運(yùn)動(dòng)及力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血液及肝臟中鐵調(diào)素（hepcidin）表達(dá)的影響，并測(cè)定分析與之相關(guān)的鐵代謝指標(biāo)、低氧應(yīng)答因子、炎性因子、抗菌肽活性相關(guān)指標(biāo)的變化趨勢(shì)。方法：雌性SD大鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10）、耐力運(yùn)動(dòng)組（n=10）、力竭運(yùn)動(dòng)組（n=10），對(duì)照組不運(yùn)動(dòng)，耐力運(yùn)動(dòng)組和力竭運(yùn)動(dòng)組分別采用為期4周的中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練和力竭運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)，而后分別采集血樣，進(jìn)行血常規(guī)指標(biāo)及血清中鐵轉(zhuǎn)運(yùn)因子、低氧應(yīng)答因子、炎性因子及抗菌肽活性相關(guān)指標(biāo)測(cè)定；取肝臟標(biāo)本，固定、包埋、切片后，利用免疫組織化學(xué)染色分別測(cè)定不同組別動(dòng)物肝臟中hepcidin、低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）、核轉(zhuǎn)錄因子kappa b（NF-κB）含量。結(jié)果：與對(duì)照組相比，4周耐力性運(yùn)動(dòng)后大鼠血清中hepcidin水平降低（P<0.05），促紅細(xì)胞生成素（EPO）濃度升高（P<0.05），白細(xì)胞介素6（IL-6）濃度下降（P<0.01）。與對(duì)照組相比，4周力竭性運(yùn)動(dòng)后大鼠血清及肝臟中hepcidin水平升高（P<0.01），EPO濃度降低（P<0.01），同時(shí)伴有血清及肝臟中HIF-1α表達(dá)增加（P<0.01），血清轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF）、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（sTFR）水平降低（P<0.01），血清中白細(xì)胞介素1（IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、C反應(yīng)蛋白（CRP）水平顯著升高（P<0.01，P<0.001，P<0.001，P<0.001）；同時(shí)血清中與hepcidin抗菌肽活性相關(guān)的toll樣受體4（TLR4）、NF-κB水平均顯著升高（P<0.001）。結(jié)論：4周耐力性運(yùn)動(dòng)可下調(diào)大鼠血清中hepcidin水平；而4周力竭性運(yùn)動(dòng)可使大鼠血清及肝臟中hepcidin水平顯著上調(diào)，提示不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)hepcidin的影響存在明顯差異。

鐵調(diào)素；鐵代謝；低氧誘導(dǎo)因子；炎癥

青少年及女性運(yùn)動(dòng)員易出現(xiàn)因體內(nèi)貯存鐵耗竭所導(dǎo)致的功能性缺鐵或絕對(duì)性缺鐵，如得不到合理補(bǔ)充，將會(huì)發(fā)展成為缺鐵性貧血。因缺鐵導(dǎo)致的“運(yùn)動(dòng)性貧血”是限制耐力型運(yùn)動(dòng)員競(jìng)技能力的重要因素[1，2]。機(jī)體鐵元素的吸收、回收及轉(zhuǎn)運(yùn)主要由以下因子調(diào)控：①鐵貯存調(diào)節(jié)因子；②紅細(xì)胞生成調(diào)節(jié)因子；③炎性調(diào)節(jié)因子。目前研究證實(shí)，上述三類(lèi)因子可聚焦于同一個(gè)鐵代謝調(diào)節(jié)激素——hepcidin[3，4]。錢(qián)忠明、段相林等學(xué)者根據(jù)hepcidin對(duì)鐵代謝的負(fù)調(diào)節(jié)作用，將之定名為鐵調(diào)素[5-7]。hepcidin可通過(guò)對(duì)鐵的吸收、儲(chǔ)存和利用這三個(gè)重要環(huán)節(jié)的作用而調(diào)節(jié)鐵代謝，運(yùn)動(dòng)后血清hepcidin的水平直接受到運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度及運(yùn)動(dòng)方式等因素影響[8，9]。

除運(yùn)動(dòng)之外，機(jī)體內(nèi)hepcidin水平還受到炎癥、低氧等諸多因素影響。Nemeth等報(bào)道炎性細(xì)胞因子IL-6可上調(diào)hepcidin表達(dá)[10]；Kemma等觀(guān)察到健康個(gè)體在注射內(nèi)毒素（脂多糖，LPS）誘發(fā)急性炎癥反應(yīng)后，IL-6水平顯著上升，進(jìn)而使hepcidin水平上升至峰值[11]。Peys?sonnaux等發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管瘤腫瘤抑制蛋白/低氧誘導(dǎo)因子通路（vHL/HIF軸）是體內(nèi)調(diào)控hepcidin表達(dá)及鐵代謝平衡的重要因素[12]。

髓源性細(xì)胞在防御細(xì)菌入侵時(shí)，其hepcidin表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)，該反應(yīng)具備toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）依賴(lài)性，之后會(huì)因其對(duì)鐵代謝的負(fù)調(diào)節(jié)作用而誘發(fā)炎性貧血[13]。由此提示hepcidin的抗菌肽活性與鐵代謝負(fù)調(diào)節(jié)作用之間可能存在內(nèi)在聯(lián)系，其聯(lián)系的交匯點(diǎn)可能集中于低氧及炎癥應(yīng)答[14]。

本研究探討不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)大鼠血清及肝臟hep?cidin表達(dá)的影響，同時(shí)比較分析與之有密切關(guān)系的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)因子、低氧應(yīng)答因子、炎性因子及抗菌肽活性相關(guān)指標(biāo)的變化趨勢(shì)，進(jìn)一步探討hepcidin自身所具備的雙重生物學(xué)活性的可能內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

6周齡雌性SD大鼠30只，體重169.7±6.98 g，購(gòu)自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0015，隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10）、耐力運(yùn)動(dòng)組（n=10）、力竭運(yùn)動(dòng)組（n=10）。自由飲水，普通標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，對(duì)照組不運(yùn)動(dòng)，耐力運(yùn)動(dòng)組和力竭運(yùn)動(dòng)組分別按照如下方案進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

1.2 不同跑臺(tái)訓(xùn)練運(yùn)動(dòng)方案

耐力運(yùn)動(dòng)組依據(jù)陳文鶴等文獻(xiàn)[15]制定運(yùn)動(dòng)方案：跑臺(tái)坡度0°；初始速度為10 m/min，依次按照2.5 m/min速度遞增，每級(jí)持續(xù)5 min，遞增至15 m/min并維持運(yùn)動(dòng)負(fù)荷在此水平，總運(yùn)動(dòng)時(shí)間為60 min，每日定時(shí)訓(xùn)練，每周6次，持續(xù)4周。

力竭運(yùn)動(dòng)組依據(jù)Bedford[16]建立的大鼠遞增負(fù)荷力竭性運(yùn)動(dòng)模型制定運(yùn)動(dòng)方案：第1級(jí)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷：跑臺(tái)坡度0°，速度12 m/min（約相當(dāng)于64%最大攝氧量），持續(xù)運(yùn)動(dòng)15 min；第2級(jí)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷：跑臺(tái)坡度5°，速度15 m/min（約相當(dāng)于76%最大攝氧量），持續(xù)運(yùn)動(dòng)15 min；第3級(jí)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷：跑臺(tái)坡度5°，速度18 m/min（約相當(dāng)于85%最大攝氧量），維持此負(fù)荷直至動(dòng)物無(wú)法堅(jiān)持本級(jí)負(fù)荷，腹臥位貼于跑道上并滯留跑道后1/3處達(dá)3次以上，刺激驅(qū)趕無(wú)效，行為特征表現(xiàn)為：呼吸急深、幅度大、垂頭，刺激無(wú)反應(yīng)?？傔\(yùn)動(dòng)時(shí)間為120 min，每日定時(shí)進(jìn)行訓(xùn)練，每周6次，持續(xù)4周。

1.3 血液常規(guī)指標(biāo)測(cè)定

4周不同強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練干預(yù)結(jié)束后第2天，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉動(dòng)物，心內(nèi)取血，將1 ml全血置于EDTA抗凝采血管中，輕輕顛倒混勻，而后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行血液常規(guī)指標(biāo)測(cè)定，包括紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）、血小板（PLT）計(jì)數(shù)及血紅蛋白（HGB）含量測(cè)定。

1.4 EELLIISSAA測(cè)定血清中鐵轉(zhuǎn)運(yùn)因子、低氧應(yīng)答因子、炎性因子及抗菌肽活性相關(guān)指標(biāo)

心內(nèi)取血，3000 g離心收集血清，采用ELISA試劑盒（R&D Systems，USA）分別測(cè)定血清中hepcidin，鐵轉(zhuǎn)運(yùn)因子包括轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（soluble transferring receptor，sTFR），低氧應(yīng)答因子包括低氧誘導(dǎo)因子1 alpha（hypoxia induced factor 1，HIF-1α）、紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）及炎性因子包括白細(xì)胞介素1（interleukin 1，IL-1）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子alpha（tumor necrosis factor，TNF-α）、C反應(yīng)蛋白（C reaction pro?tein，CRP），抗菌肽活性相關(guān)指標(biāo)包括toll樣受體4（TLR4）、核因子kappa b（nuclear factor kappa b，NF-κB）水平變化，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)利用Bio-Rad酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。

1.5 免疫組化法檢測(cè)大鼠肝臟中hepcciiddiinn、HHIIFF-- 11 α、NNFF-- κ BB表達(dá)

將大鼠肝臟置于5%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片；二甲苯脫蠟后梯度酒精水化；3%H2O2水溶液室溫避光孵育10 min，而后在檸檬酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)；10%正常羊血清37℃孵育30分鐘后，分別于切片上加50 μL稀釋的HIF-1α、NF-κB、hepcidin抗體（購(gòu)自abcam，濃度分別為：1︰200、1︰400、1︰200），37℃孵育1小時(shí)；其中加HIF-1α、hepcidin孵育的在切片上加30 μL生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG工作液、加NF-κB孵育的在切片上加30 μL生物素標(biāo)記羊抗兔IgG工作液（上述兩種二抗均購(gòu)自中杉金橋），37℃孵育60 min；在切片上加30 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min；DAB避光顯色，脫水，透明，封片。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 耐力運(yùn)動(dòng)及力竭性運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

4周不同方式運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后，與對(duì)照組相比，耐力運(yùn)動(dòng)組及力竭運(yùn)動(dòng)組RBC、WBC、PLT、HGB數(shù)目均未見(jiàn)有明顯改變。具體見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血液常規(guī)指標(biāo)

2.2 耐力運(yùn)動(dòng)及力竭性運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血清hepcciiddiinn及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)因子表達(dá)的影響

4周不同方式運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后，與對(duì)照組相比，耐力運(yùn)動(dòng)組hepcidin水平顯著降低（P<0.05），而力竭運(yùn)動(dòng)組hepcidin水平則顯著升高（P<0.01）；與對(duì)照組相比，耐力運(yùn)動(dòng)組轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（sTFR）水平未見(jiàn)有顯著改變；而力竭運(yùn)動(dòng)組轉(zhuǎn)鐵蛋白TF、sTFR水平均顯著降低（P<0.01）。具體見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清hepcidin表達(dá)及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)因子比較

2.3 耐力運(yùn)動(dòng)及力竭性運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血清低氧應(yīng)答指標(biāo)的影響

4周不同方式運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后，與對(duì)照組相比，耐力運(yùn)動(dòng)組HIF-1α水平降低，EPO水平顯著升高（P<0.05）；力竭運(yùn)動(dòng)組HIF-1α水平顯著升高（P<0.01），EPO水平顯著降低（P<0.01）；具體見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清低氧應(yīng)答指標(biāo)比較

2.4 耐力運(yùn)動(dòng)及力竭性運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血清炎性因子表達(dá)的影響

4周不同方式運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，與對(duì)照組相比，耐力運(yùn)動(dòng)組IL-6濃度顯著降低（P<0.01），提示有氧運(yùn)動(dòng)具備一定抗炎作用；力竭運(yùn)動(dòng)組上述炎性因子水平則均有顯著升高（P<0.01，P<0.001，P<0.001，P<0.001），提示力竭性運(yùn)動(dòng)可使動(dòng)物體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇。具體見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清炎性細(xì)胞因子比較

2.5 耐力運(yùn)動(dòng)及力竭性運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血清中hepcciiddiinn抗菌肽活性相關(guān)指標(biāo)的影響

4周不同方式運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后，與對(duì)照組相比：耐力運(yùn)動(dòng)組NF-κB水平顯著降低（P<0.01），與其hepcidin變化趨勢(shì)一致；力竭運(yùn)動(dòng)組NF-κB及TLR4水平均顯著升高（P<0.001），與其hepcidin變化趨勢(shì)一致。具體見(jiàn)表5。

2.6 耐力運(yùn)動(dòng)及力竭性運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠肝臟中hepcciiddiinn、HHIIFF-- 11 α、NNFF-- κ BB表達(dá)的影響

4周不同方式運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后，與對(duì)照組相比，耐力運(yùn)動(dòng)組動(dòng)物肝臟hepcidin、HIF-1α、NF-κB表達(dá)量均有升高，無(wú)顯著性差異；力竭運(yùn)動(dòng)組動(dòng)物肝臟hepcidin、HIF-1α、NF-κB表達(dá)量均有顯著上升（P<0.01，P<0.01，P<0.001），提示力竭性運(yùn)動(dòng)可使動(dòng)物肝臟蛋白表達(dá)發(fā)生更為顯著變化。結(jié)果見(jiàn)圖1，表6。

表5 各組大鼠血清hepcidin抗菌肽活性相關(guān)指標(biāo)比較

表6 各組大鼠肝臟hepcidin、HIF-1α、NF-κB表達(dá)水平比較

圖1 各組大鼠肝臟免疫組化染色

3 討論

自1959年Yoshimura首次提出大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致“運(yùn)動(dòng)性貧血”以來(lái)，研究者逐漸認(rèn)識(shí)到大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的細(xì)胞缺鐵是貧血的重要誘因[3，17]。在Nicolas報(bào)告hepcidin的鐵代謝調(diào)節(jié)功能之后[18]，研究者開(kāi)始關(guān)注不同方式、不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體鐵代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)的作用及其與肝臟hepcidin表達(dá)之間的關(guān)系[17，19-21]。

3.1 不同方式運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)大鼠血清hepcciiddiinn及血常規(guī)指標(biāo)的影響

此前Roecker等[22]對(duì)14名參加柏林馬拉松比賽的女性運(yùn)動(dòng)員尿液中hepcidin濃度進(jìn)行了觀(guān)察，Troadec等[23]對(duì)14名進(jìn)行亞最大強(qiáng)度自行車(chē)運(yùn)動(dòng)志愿者h(yuǎn)epci?din表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證分析，Marc等[24]比較了7天負(fù)重訓(xùn)練（跑步）與無(wú)負(fù)重訓(xùn)練（騎自行車(chē)）對(duì)尿液中hepcidin的影響，上述人體試驗(yàn)結(jié)果表明不同訓(xùn)練方式、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度等因素對(duì)機(jī)體血液及尿液中hepcidin濃度的影響并不一致。劉玉倩等[25]觀(guān)察到適度運(yùn)動(dòng)使大鼠肝臟hep?cidin mRNA水平下降，血紅蛋白含量升高，而劇烈運(yùn)動(dòng)則未見(jiàn)有顯著影響。本文觀(guān)察到耐力運(yùn)動(dòng)可使大鼠血清hepcidin水平顯著降低，與其肝臟中hepcidin變化趨勢(shì)不一致。而力竭性運(yùn)動(dòng)則可使大鼠血清hepcidin水平及其肝臟hepcidin表達(dá)同步顯著上調(diào)。這種結(jié)果上的差異可能與所選擇動(dòng)物運(yùn)動(dòng)模型及運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度密切相關(guān)。

hepcidin濃度改變與血液常規(guī)指標(biāo)改變二者之間并不同步，有時(shí)血常規(guī)指標(biāo)改變可能由于其發(fā)生改變時(shí)程上的滯后性而觀(guān)察不到。McClung等對(duì)進(jìn)行7天冬季軍事訓(xùn)練的受試者血紅蛋白、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)因子及hepci?din的影響進(jìn)行了觀(guān)察[26]，Auersperger等比較了14名跑步運(yùn)動(dòng)員在為期8周的訓(xùn)練前后及調(diào)整恢復(fù)10天后血液中hepcidin及紅細(xì)胞及血紅蛋白含量的改變[27]，這兩項(xiàng)人體試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)血常規(guī)指標(biāo)改變存在滯后或不夠敏感。本實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)不同運(yùn)動(dòng)方式均可改變大鼠血液及肝臟中hepcidin的表達(dá)，但兩組動(dòng)物的大鼠血液常規(guī)指標(biāo)雖有小幅波動(dòng)，均未見(jiàn)有顯著改變。其原因可能在于無(wú)論耐力性運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致hepcidin表達(dá)下調(diào)所誘發(fā)的機(jī)體鐵代謝促進(jìn)效應(yīng)，還是力竭性運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致hepcidin表達(dá)上調(diào)所誘發(fā)機(jī)體鐵代謝抑制作用，二者均需要較長(zhǎng)時(shí)程才可能會(huì)影響到血液常規(guī)指標(biāo)的改變。上述結(jié)果提示：運(yùn)動(dòng)對(duì)hepcidin水平的影響與所采取的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)量、運(yùn)動(dòng)方式密切相關(guān)，且存在一定差異。

3.2 不同方式運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)大鼠血清hepcciiddiinn及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)因子的影響

鐵是包括氧運(yùn)輸在內(nèi)的多個(gè)生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程的必需微量元素，鐵的供應(yīng)受到hepcidin的精確調(diào)控。hep?cidin在肝內(nèi)合成，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)鐵吸收及鐵代謝平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。在機(jī)體鐵超載時(shí)，其含量上調(diào)；而在低氧、貧血等因素使血中鐵濃度降低時(shí)，肝臟分泌的hepcidin隨之減少，最終使血液中鐵濃度逐漸恢復(fù)正常[4，28，29]。

本文觀(guān)察到耐力運(yùn)動(dòng)可使大鼠血清hepcidin水平顯著降低，但對(duì)TF、sTFR未見(jiàn)有顯著影響；力竭性運(yùn)動(dòng)可使大鼠血清hepcidin水平顯著上升，使TF、sTFR水平顯著降低，其肝臟中hepcidin表達(dá)也有顯著上調(diào)。這與劉玉倩等對(duì)不同強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠十二指腸二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DMT1）、FP1蛋白及肝臟hepcidin mRNA表達(dá)比較分析的結(jié)果不一致[30]。其原因可能在于下肢需承重的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練模型的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷大于下肢無(wú)承重的游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練模型，而力竭性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠肝臟的運(yùn)動(dòng)應(yīng)激效應(yīng)又強(qiáng)于耐力性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)所致。盡管不同實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不盡一致，但仍可證實(shí)hepci?din確系機(jī)體鐵代謝的有效負(fù)調(diào)節(jié)因子。

3.3 不同方式運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)大鼠血清hepcciiddiinn及低氧應(yīng)答指標(biāo)的影響

通過(guò)氧運(yùn)輸、紅細(xì)胞生成及鐵代謝等過(guò)程，使得機(jī)體低氧應(yīng)答與鐵的利用密切聯(lián)系在一起。缺氧可使HIF-1α表達(dá)增加，促紅細(xì)胞生成素表達(dá)上調(diào)，紅細(xì)胞生成增多，由此使得紅細(xì)胞系統(tǒng)組織可獲得更多的鐵，而使hepcidin表達(dá)下調(diào)[12，29，31]。

習(xí)慣認(rèn)為EPO變化趨勢(shì)應(yīng)與HIF-1α變化趨勢(shì)一致，而hepcidin變化趨勢(shì)應(yīng)與HIF-1α變化趨勢(shì)相反，即當(dāng)機(jī)體處于缺氧狀態(tài)時(shí)，可顯著降低hepcidin的表達(dá)[29，32]。本文觀(guān)察到耐力運(yùn)動(dòng)組血清中促紅細(xì)胞生成素（EPO）水平顯著升高，與其血清中hepcidin的變化趨勢(shì)一致；但觀(guān)察到其血清中HIF-1α呈下降趨勢(shì)，這與報(bào)道較多的HIF-1α變化趨勢(shì)與EPO變化趨勢(shì)結(jié)果不一致。力竭運(yùn)動(dòng)組血清及肝臟中HIF-1α水平均顯著升高，但其血清中EPO水平顯著下降，而且HIF-1α變化趨勢(shì)與血清及肝臟中hepcidin表達(dá)的變化趨勢(shì)也與已知研究結(jié)果存在較明顯差異。本實(shí)驗(yàn)中之所以觀(guān)察到了hepcidin與HIF-1α變化趨勢(shì)相矛盾的原因，可能在于不同運(yùn)動(dòng)方式影響所致。即耐力性運(yùn)動(dòng)具有抗炎作用，可下調(diào)hepcidin表達(dá)，由此抵消了因運(yùn)動(dòng)使機(jī)體氧供應(yīng)改善后HIF-1α下降所引發(fā)的hepcidin表達(dá)上調(diào)，最終表現(xiàn)為hepcidin表達(dá)量降低。而力竭性運(yùn)動(dòng)則使機(jī)體炎癥反應(yīng)加劇，上調(diào)hepcidin表達(dá)，也由此抵消了因力竭運(yùn)動(dòng)使機(jī)體缺氧所誘發(fā)的HIF-1α穩(wěn)化上調(diào)，進(jìn)而引發(fā)的hepcidin表達(dá)下調(diào)，最終表現(xiàn)為hepcidin表達(dá)量增多。事實(shí)上HIF-1α對(duì)機(jī)體的炎癥反應(yīng)也存在密切的調(diào)節(jié)作用[31]，上述結(jié)果提示低氧誘導(dǎo)因子在機(jī)體因缺鐵后所發(fā)生的一系列代償反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，其中力竭性運(yùn)動(dòng)的影響更為深刻。

而對(duì)于4周不同方式運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)大鼠血清中HIF-1α與EPO的變化趨勢(shì)與之前所報(bào)道實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的原因，尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證分析。

3.4 不同方式運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)大鼠血清hepcciiddiinn及炎性因子指標(biāo)的影響

機(jī)體炎癥狀態(tài)下hepcidin表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)，可影響到小腸細(xì)胞鐵吸收及脾臟巨噬細(xì)胞鐵回收，使吸收效率下降，回收減少，造成血漿中鐵濃度下降[33-35]。目前有關(guān)炎性因子對(duì)hepcidin影響的研究報(bào)道中，IL-6得到最多關(guān)注，Nemeth等報(bào)道的第一個(gè)可上調(diào)hepcidin表達(dá)的炎性細(xì)胞因子就是IL-6[10]。

本文較系統(tǒng)的觀(guān)察了4周不同方式運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)大鼠血清炎性因子濃度的影響。與對(duì)照組相比，耐力運(yùn)動(dòng)組IL-6水平顯著降低（P<0.01），提示耐力性運(yùn)動(dòng)具有一定的抗炎作用，而且IL-6對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激應(yīng)答表現(xiàn)的較為敏感。而力竭運(yùn)動(dòng)組的上述炎性因子水平均有顯著上升，提示力竭運(yùn)動(dòng)可使動(dòng)物體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇，而炎性因子水平升高會(huì)顯著激活hepcidin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終誘發(fā)運(yùn)動(dòng)性貧血的發(fā)生。本文中所觀(guān)察到炎性因子改變對(duì)hepcidin變化趨勢(shì)的影響，與前述不同運(yùn)動(dòng)干預(yù)所誘發(fā)的低氧應(yīng)答對(duì)hepcidin變化趨勢(shì)的影響，可能存在一定的交叉或相互調(diào)節(jié)作用，而這種作用可能通過(guò)HIF-1α來(lái)實(shí)現(xiàn)。

這與澳大利亞Peeling等針對(duì)不同個(gè)體運(yùn)動(dòng)后hep?cidin的應(yīng)答進(jìn)行了一系列研究結(jié)果基本一致。Peeling的研究結(jié)果提示IL-6濃度改變與血清中hepcidin水平之間存在密切同步改變，運(yùn)動(dòng)可通過(guò)改變血清IL-6水平直接影響血清hepcidin水平，進(jìn)而影響機(jī)體鐵代謝[36，37]。而B(niǎo)anzet等采用可抑制IL-6表達(dá)的環(huán)孢菌素處理動(dòng)物后發(fā)現(xiàn)，用環(huán)孢菌素干預(yù)過(guò)的動(dòng)物在同等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后血漿IL-6濃度低約50%，同時(shí)IL-6α受體表達(dá)顯著減少，其hepcidin mRNA峰值顯著降低[38]，提示血漿IL-6水平改變確實(shí)是運(yùn)動(dòng)所誘發(fā)hepcidin基因表達(dá)增加的重要誘因，即IL-6可激活hepcidin的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

3.5 不同方式運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)大鼠血清hepcciiddiinn抗菌肽活性指標(biāo)的影響

hepcidin是一個(gè)在不同物種間結(jié)構(gòu)高度保守的肝源性抗菌肽，屬防御素（defensin）家族，其序列中的8個(gè)Cys殘基間共可形成4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵連接在一起，在調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物鐵代謝平衡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。之前運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)領(lǐng)域與其相關(guān)的研究多著眼于其鐵代謝負(fù)調(diào)節(jié)因子的作用，對(duì)其抗菌肽活性缺乏關(guān)注。

本文觀(guān)察到耐力運(yùn)動(dòng)組NF-κB水平顯著下降，與其HIF-1α變化趨勢(shì)一致；力竭運(yùn)動(dòng)組NF-κB及TLR4水平均顯著上升，與其HIF-1α變化趨勢(shì)一致。在此前的研究中，研究者已發(fā)現(xiàn)HIF-α可激活NF-κB，而NF-κB也可調(diào)節(jié)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄，NF-κB是HIF-1a必不可缺的轉(zhuǎn)錄激活因子[14]。

哺乳動(dòng)物的TLR是重要的模式識(shí)別受體，可以精確識(shí)別病原體相關(guān)PAMPs。TLR4是首先發(fā)現(xiàn)也是研究最多的TLR受體，其重要特征是識(shí)別革蘭陰性菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）[13，14]。不同運(yùn)動(dòng)方式干預(yù)后血清hepcidin、HIF-1α、NF-κB、TLR4變化趨勢(shì)基本一致，提示低氧可通過(guò)上調(diào)模式識(shí)別受體TLR4的表達(dá)，從而促進(jìn)NF-κB濃度提升，繼而可激活作為肝源性抗菌肽的hepcidin的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。

此前已初步探究過(guò)HIF-1α不僅僅是細(xì)胞能量平衡穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞對(duì)低氧適應(yīng)的主要調(diào)節(jié)者。HIF-1α同樣可以激活細(xì)胞抗病原微生物的活性，有效支持巨噬細(xì)胞及上皮化細(xì)胞的固有免疫應(yīng)答[13]。已知抗菌肽是機(jī)體固有免疫應(yīng)答的重要組成部分，作為肝源性抗菌肽的hepcidin自然也不例外。而與此同時(shí)，不同的運(yùn)動(dòng)干預(yù)方式同樣可通過(guò)影響機(jī)體對(duì)低氧刺激做出適應(yīng)性應(yīng)答的核心調(diào)節(jié)因子HIF-1α以調(diào)節(jié)機(jī)體氧代謝，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝。由此提示，hepcidin的鐵代謝負(fù)調(diào)節(jié)因子作用與其肝源性抗菌肽活性均受到HIF-1α的調(diào)節(jié)，或者說(shuō)是通過(guò)HIF-1α的調(diào)節(jié)作用將其二者有機(jī)的聯(lián)系起來(lái)。HIF-1α在此過(guò)程中很可能既是機(jī)體鐵代謝的感受器，同時(shí)也是機(jī)體鐵代謝的重要調(diào)節(jié)因子。在hepcidin功能調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，同時(shí)與其它調(diào)節(jié)因素如炎癥反應(yīng)之間存在相互交叉作用。

4 總結(jié)

本研究觀(guān)察比較了不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)大鼠血清與肝臟hepcidin表達(dá)的影響，探討了與之相關(guān)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)因子、低氧應(yīng)答因子、炎性因子及抗菌肽活性相關(guān)指標(biāo)的變化趨勢(shì)。發(fā)現(xiàn)耐力運(yùn)動(dòng)具有一定抗炎作用，可通過(guò)下調(diào)hepcidin表達(dá)以改善鐵代謝；力竭性運(yùn)動(dòng)則使機(jī)體炎癥反應(yīng)加劇，其中IL-6的影響最為顯著；使hepcidin表達(dá)顯著上調(diào)，鐵代謝發(fā)生障礙。

對(duì)hepcidin的抗菌肽活性相關(guān)指標(biāo)測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)炎癥反應(yīng)加劇刺激hepcidin表達(dá)顯著上調(diào)時(shí)，已知與抗菌肽表達(dá)增加的一系列因子如HIF-1α、NF-κB、TLR4水平均顯著上升。提示其所兼?zhèn)涞蔫F代謝負(fù)調(diào)節(jié)因子活性變化趨勢(shì)與肝源性抗菌肽活性變化趨勢(shì)完全一致，二者之間存在內(nèi)在聯(lián)系。

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The Effects of Different Treadmill Exercises on Serum-and Liver-Hepcidin and its Modulators in Rats

Sha Jibin1，2，Zhang Chenggang2
1 School of Sports and Health Science，Shandong Sports University，Jinan 250102，China 2 Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 100850，China Corresponding Author:Zhang Chenggang，Email:zcgweb@126.com

ObjectivesTo compare the different effects of endurance and exhaustive exercises on hepcidin in the blood and liver，and determine the changes of related indexes about iron metabolism and hypoxia response，and of inflammatory and antimicrobial activity factors.MethodsThiry female Sprague Dawley rats were randomly divided into a control group（n=10），an endurance exercise group（n=10）and an exhaustive exercise group（n=10）.Then 4 weeks of endurance and exhaustive tread?mill training were given to different exercise groups respectively.Blood samples were collected，the rou?tine indexes of the whole blood，and the serum indexes about iron metabolism，hypoxia response，inflam?matory and antimicrobial activity factors were measured.Meanwhile，liver samples were fixed，embeddedand sliced，and the expression of hepcidin，hypoxia-inducible factor（HIF）-1α and nuclear factor of kappa b（NF-κB）of different groups were measured using the immunochemistry staining.ResultsCompared with the control group，after 4-week endurance exercises，there was significant increase in the concentration of erythropoietin（EPO），but significant differences in the level of serum hepcidin and interleukin 6（IL-6）.However，after 4 weeks of exhaustive exercise，significant increase was ob?served in the level of hepcidin and the expression of HIF-1α in the serum and liver，as well as the serum interleukin 1（IL-1），IL-6，tumor necrosis factor-α and C reactive protein，but significant de?crease was found in the concentration of serum EPO and the level of serum TF and sTFR compared to the control group.Moreover，there was significant increase in the level of toll-like receptor 4 and NF-κB，which is correlated with the antimicrobial peptide activity of hepcidin compared between the ex?haustive and control group.ConclusionsFour-week endurance exercise down-regulates the level of se?rum hepcidin，while 4-week exhaustive exercise increases the hepcidin level in the serum and liver sig?nificantly.Therefore，different exercises can result in totally different effect on the hepcidin level.

hepcidin，iron metabolism，hypoxia inducible factor，inflammation

2016.10.29

山東省自然科學(xué)基金（ZR2014JL024）；山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目（J13LE04）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目子課題（2012CB518206）

第1作者：沙繼斌，Email：mengxiaosha@hotmail.com；

張成崗，Email：zcgweb@126.com