有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的腦衰老大鼠前額葉SYP、PSD-95表達(dá)的影響

付燕張業(yè)廷袁瓊嘉羅笑

1西南民族大學(xué)體育學(xué)院（成都 610041）2成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院

有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的腦衰老大鼠前額葉SYP、PSD-95表達(dá)的影響

付燕1，2張業(yè)廷2袁瓊嘉2羅笑1

1西南民族大學(xué)體育學(xué)院（成都 610041）2成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院

目的：觀察有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)D-半乳糖（D-gal）誘導(dǎo)的腦衰老大鼠大腦前額葉突觸素（SYP）、突觸后致密區(qū)蛋白-95（PSD-95）表達(dá)的影響，探討有氧運(yùn)動(dòng)延緩腦衰老時(shí)學(xué)習(xí)記憶障礙的潛在機(jī)制。方法：將36只3月齡SD大鼠隨機(jī)分成生理鹽水對(duì)照組（C組）、D-gal組（D組）和D-gal加有氧運(yùn)動(dòng)組（DE組），每組12只。每日給予D、DE組大鼠1次腹腔注射D-gal（100 mg/kg/d），持續(xù)6周；DE組大鼠在D-gal注射期間進(jìn)行游泳訓(xùn)練（1 h/d，6 d/w）。然后利用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，并采用免疫熒光、Western Blot和Real Time-PCR技術(shù)分別檢測(cè)大鼠大腦前額葉SYP、PSD-95蛋白分子及其mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：（1）在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)定位航行訓(xùn)練過程中各大鼠的逃避潛伏期均逐漸下降，其中C和DE組訓(xùn)練第3天表現(xiàn)出最好成績(jī)，其后無顯著性改變，D組逃避潛伏期則在第5天后降到最低，在第2、3、4天，D組平均逃避潛伏期明顯長于C組和DE組（P<0.05），而在第1、5、6天，各組大鼠間無顯著性差異（P>0.05）；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，D組60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)明顯低于C和DE組（P<0.05），而且后兩組大鼠有更長時(shí)間停留在原平臺(tái)所在象限內(nèi)（P<0.05）。（2）與C組相比，D組大鼠前額葉SYP蛋白分子及其SYP mRNA表達(dá)水平均顯著性降低（P<0.01），DE組則顯著性高于D組（P<0.05）；D組大鼠前額葉PSD-95蛋白分子及其mRNA較C組顯著性下降（P<0.01，P<0.05）；DE組PSD-95 mRNA與D組無顯著性差異，但其表達(dá)水平有所上升，并且DE組PSD-95蛋白分子顯著性高于D組（P<0.05）。結(jié)論：有氧運(yùn)動(dòng)可在一定程度上抑制D-gal誘導(dǎo)的衰老過程中大鼠前額葉突觸蛋白SYP、PSD-95表達(dá)受損，減輕其下降程度，這可能是有氧運(yùn)動(dòng)延緩腦衰老學(xué)習(xí)記憶能力下降的分子機(jī)理之一。

有氧運(yùn)動(dòng)；腦衰老；學(xué)習(xí)與記憶能力；前額葉；突觸蛋白

研究表明，高齡是學(xué)習(xí)與記憶等認(rèn)知功能障礙和老年性癡呆等神經(jīng)退行性疾病的主要危險(xiǎn)因素[1-3]。因此，伴隨著老齡化社會(huì)到來，延緩衰老過程中的學(xué)習(xí)與記憶等認(rèn)知能力下降，預(yù)防老年性癡呆發(fā)生，維護(hù)終身腦健康成為大眾健康目標(biāo)之一。流行病學(xué)資料和實(shí)驗(yàn)研究均提示，長期規(guī)律地參加體育運(yùn)動(dòng)的老年人學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知能力明顯優(yōu)于久坐者，這說明合理的體育運(yùn)動(dòng)有助于這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)[4-6]，但其潛在機(jī)制尚不清楚。

現(xiàn)有研究證實(shí)，與年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)與記憶等認(rèn)知能力下降與神經(jīng)突觸可塑性受損密切相關(guān)[7-9]。突觸素（Synaptophysin，SYP）和突觸后致密區(qū)蛋白-95（Post?synaptic Density Protein-95，PSD-95）是分別分布于神經(jīng)突觸前膜和后膜的特異性蛋白分子，兩者在突觸結(jié)構(gòu)與功能可塑性變化中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)水平被認(rèn)為可以直接或間接反映突觸形態(tài)以及生物功能的改變[9-11]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，海馬、前額葉等與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的重要腦區(qū)SYP和PSD-95表達(dá)水平降低與年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力障礙密切相關(guān)[12-14]。運(yùn)動(dòng)對(duì)年老者學(xué)習(xí)記憶功能的有益影響是否與海馬、前額葉等腦組織內(nèi)SYP和PSD-95表達(dá)水平變化有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。

衰老的自由基理論認(rèn)為，機(jī)體自由基產(chǎn)生增加，氧化應(yīng)激水平增高、抗氧化機(jī)能降低是導(dǎo)致衰老、縮短壽命的主要因素[15]。D-半乳糖（D-galactose，D-gal）是一種在體內(nèi)自然產(chǎn)生的還原性糖，在正常濃度時(shí)可被完全代謝，但當(dāng)其高濃度時(shí)則會(huì)轉(zhuǎn)換為醛糖、過氧化氫和半乳糖氧化酶等，進(jìn)而加速超氧化物陰離子和氧自由基的生成，使體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇，破壞細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等，最終導(dǎo)致大分子及細(xì)胞功能受損[16]。研究發(fā)現(xiàn)，嚙齒類動(dòng)物長期系統(tǒng)性接觸D-gal可使其腦部氧化應(yīng)激水平提高而抗氧化能力降低，導(dǎo)致腦細(xì)胞生物膜發(fā)生過氧化反應(yīng)，進(jìn)而出現(xiàn)腦的退行性變化，類似于自然衰老時(shí)腦的改變[16，17]。因此，長期系統(tǒng)性注射D-gal被認(rèn)為是一種可模擬腦衰老模型的理想方法，常用于探索大腦衰老機(jī)制及抗衰老方法的研究中[17-20]。

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，D-gal誘導(dǎo)的腦衰老大鼠海馬組織SYP、PSD-95等突觸蛋白的表達(dá)水平降低，而有氧運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)D-半乳糖誘導(dǎo)的腦衰老過程中大鼠海馬SYP、PSD-95表達(dá)[21，22]。本研究繼續(xù)采用系統(tǒng)性注射D-gal方法誘導(dǎo)大鼠腦衰老模型，并在注射D-gal期間讓大鼠進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，旨在觀察有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)腦老化過程中大腦前額葉突觸蛋白SYP、PSD-95表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探索有氧運(yùn)動(dòng)延緩衰老過程中學(xué)習(xí)記憶能力下降的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為3月齡健康雄性SPF級(jí)SD大鼠36只（380～420 g），購于成都達(dá)碩生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK（川）2013-24。大鼠購回后飼養(yǎng)于成都體育學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房，室內(nèi)溫度25±1℃，相對(duì)濕度40%～60%，自然光照，給予國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料和冷開水，自由攝食和飲水。大鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，被隨機(jī)分為3組：生理鹽水對(duì)照組（C組）、D-gal組（D組）、D-gal+有氧運(yùn)動(dòng)組（DE組），每組12只。

1.2 DD--ggaall注射和運(yùn)動(dòng)方案

每日上午9～10點(diǎn)之間給予D組和DE組大鼠腹腔注射D-gal（Sigma，美國），100 mg/kg/d（用生理鹽水將D-gal稀釋成5%的濃度，注射容積劑量即為2 ml/kg/d），給予C組大鼠腹腔注射生理鹽水2 ml/kg/d，持續(xù)6周[19，23]。在D-gal注射期間，DE組大鼠每日晚上9點(diǎn)開始進(jìn)行無負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，第1周30 min/d，第2周至第6周，60 min/d，6 d/w。游泳運(yùn)動(dòng)在透明玻璃缸（150 cm×50 cm×80 cm）內(nèi)進(jìn)行，水深60 cm，水溫33±1℃。

1.3 Moorrrriiss水迷宮實(shí)驗(yàn)

在持續(xù)6周的腹腔注射D-gal/生理鹽水及運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案結(jié)束后，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力。直徑150 cm×高度60 cm的圓形水迷宮水池被兩根通過圓心的假想垂線平分為4個(gè)象限（分別標(biāo)注為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），在象限Ⅳ中裝有一個(gè)位置固定、直徑9 cm圓形平臺(tái)。池中水深沒過平臺(tái)1.5 cm，池水被無毒墨汁調(diào)為黑色。安裝于水迷宮上方正中的攝像機(jī)同步記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。所獲視頻數(shù)據(jù)用水迷宮視頻分析系統(tǒng)處理。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)共持續(xù)7天：前6天進(jìn)行定位航行訓(xùn)練，最后1天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)期間，水池周圍參照物位置保持不變。

1.3.1 定位航行訓(xùn)練

歷時(shí)6天的定位航行訓(xùn)練主要用來評(píng)估大鼠空間學(xué)習(xí)能力。在定位航行訓(xùn)練期間，在排除受本身游泳速度影響的情況下，大鼠的平均逃避潛伏期（從每個(gè)象限入水至爬上平臺(tái)的時(shí)間）下降越快，則說明其能越快記住潛藏于水面下平臺(tái)的位置，即空間學(xué)習(xí)記憶能力越好。每天按編號(hào)順序?qū)⒏鞔笫竺娉乇?、頭朝下依次從象限Ⅰ至象限Ⅳ的邊緣中點(diǎn)放入水迷宮池中，水迷宮視頻分析系統(tǒng)追蹤記錄大鼠的游泳速度以及逃避潛伏期[19]。如果超過120 s未尋到站臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將大鼠引至平臺(tái)，并讓其在平臺(tái)上停留20 s，此時(shí)將逃避潛伏期記錄為120 s。

1.3.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

空間探索實(shí)驗(yàn)可更直接地評(píng)估大鼠空間記憶能力。大鼠在60 s內(nèi)在原平臺(tái)所在象限內(nèi)停留的時(shí)間越長，穿越原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)越多，則反映大鼠的記憶保持能力越好[24]。在定位航行訓(xùn)練結(jié)束后第2天，將置于象限Ⅳ中的平臺(tái)拆除，采用定位航行訓(xùn)練中的順序與方式將大鼠從水迷宮池子的第Ⅱ象限邊緣中點(diǎn)放入水中，讓大鼠尋找記憶中的平臺(tái)位置。水迷宮視頻分析系統(tǒng)追蹤記錄大鼠在60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)以及在象限Ⅳ（原平臺(tái)所在象限）中的游泳時(shí)間。

1.4 組織樣本處理和指標(biāo)檢測(cè)

腦組織樣本采集在水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后進(jìn)行。將各大鼠斷頭處死，迅速從頭顱中取出腦。將每組6只大鼠的全腦浸入4%多聚甲醛中，用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)；另外6個(gè)腦置于冰上，快速分離出兩側(cè)前額葉，儲(chǔ)存在－80℃冰箱中，用于免疫印跡（Western Blot）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time-PCR）分析。免疫熒光以及Western Blot實(shí)驗(yàn)在成都體育學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成；Real Time-PCR實(shí)驗(yàn)在四川大學(xué)華西科技園完成。窗體頂端

1.4.1 腦切片和免疫熒光實(shí)驗(yàn)

取固定于4%多聚甲醛的腦組織常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜取前額葉區(qū)域進(jìn)行冠狀位連續(xù)切片，片厚50 μm。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟至水后放入3%H2O2-甲醇液中室溫孵育10 min；0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH6.0）微波抗原修復(fù)；10%BSA（正常羊血清）37℃封閉30 min后按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行SYP、PSD-95免疫熒光染色。分別用鼠抗SYP抗體工作液（1:200，AbCam）和鼠抗PSD-95抗體工作液（1︰200，AbCam）4℃孵育過夜；再分別用Cy3或FITC標(biāo)記的熒光山羊抗鼠IgG二抗工作液（1︰1000，北京中杉）避光孵育，37℃，30 min；甘油磷酸緩沖液封片（以上各步驟間用0.01 mol/L PBS緩沖液充分漂洗）。陰性對(duì)照組用0.01 mol/LPBS代替一抗，其余步驟同上。隨后，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察并采集圖像，每例隨機(jī)取5張切片，每張切片在400×光鏡下選取5個(gè)不重疊視野。將所獲得圖像導(dǎo)入計(jì)算機(jī)，用Image pro-plus 6.0軟件分別分析SYP、PSD-95平均熒光強(qiáng)度值（Mean Fluorescence Intensity，MFI）。

1.4.2 Western BBlloott實(shí)驗(yàn)

取大鼠右側(cè)前額葉組織加入預(yù)冷的含有PMSF的RIPA裂解液（1 ml RIPA裂解液：10 μl PMSF溶液）中勻漿，4℃離心（12000 rpm×5 min）后取上清液；采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京中杉）檢測(cè)上清液中總蛋白濃度；取含定量蛋白的上清液用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行垂直電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（PVDF）膜上；將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1 h后分別用鼠抗SYP一抗工作液（1︰500，AbCam）和鼠抗PSD-95（1︰1000，AbCam）孵育，4℃過夜；TBST液充分洗滌后用辣根酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗工作液（1︰2000，北京中杉）室溫孵育2 h；TBST液充分洗滌后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，獲得樣品BDNF印跡圖像。β-actin（Sigma，USA）作為內(nèi)參。使用Quantity One凝膠成像系統(tǒng)對(duì)免疫印跡條帶進(jìn)行光密度分析，分別以SYP和PSD-95印跡條帶光密度值與β-actin印跡條帶光密度值的比值作為其蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 Real Time--PPCCRR 實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)中方法提取前額葉總RNA，用紫外線分光光度計(jì)（Thermo Scientific NanoDrop 2000）測(cè)定RNA純度與濃度，并用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性；然后依照iScriptTMcDNA Synthesis Kit試劑盒（BIO-RAD USA）說明書，以前額葉mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA；再使用SsoAdvancedTMSYBR?Green Supermix試劑盒（BIO-RAD USA），以cDNA為模板在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad CFX96TMReal-Time Systerm）上進(jìn)行Real Time-PCR反應(yīng)[19，23]；分析產(chǎn)物熔解曲線并驗(yàn)證目標(biāo)基因SYP、PSD-95和內(nèi)參基因β-ac?tin的擴(kuò)增效率是否接近100%；然后將目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的Ct值采用公式2-??Ct進(jìn)行誤差校正，獲得SYP mRNA和PSD-95 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)由Bio-Rad CFX Manager System自動(dòng)采集分析。本實(shí)驗(yàn)所用引物由TaKaRa寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)，引物堿基序列見表1。

表1 Real Time-PCR反應(yīng)所用引物參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組的相關(guān)指標(biāo)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。其中對(duì)來自定位航行訓(xùn)練的數(shù)據(jù)用雙因素方差分析進(jìn)行處理，其余數(shù)據(jù)則采用單因素方差分析進(jìn)行組間對(duì)比分析。P<0.05為組間差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力

2.1.1 Moorrrriiss水迷宮定位航行訓(xùn)練結(jié)果

在歷時(shí)6天的水迷宮定位航行訓(xùn)練過程中，隨著定位航行訓(xùn)練次數(shù)增加，各組大鼠平均逃避潛伏期時(shí)間逐漸縮短，其中C組、DE組第3天后趨于穩(wěn)定，D組則在第5天后趨于穩(wěn)定（表2）。對(duì)各組大鼠平均逃避潛伏期的分析顯示，在水迷宮訓(xùn)練的第2、3、4天，D組明顯長于C組和DE組（P<0.05或P<0.01），而在第1、5、6天，各組大鼠間無顯著性差異（P>0.05）。在6天的訓(xùn)練期間，各組大鼠的游泳速度無顯著性差異（P>0.05）。

表2 Morris水迷宮定位航行訓(xùn)練平均逃避潛伏期

2.1.2 Moorrrriiss水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中，D組大鼠在60 s內(nèi)穿越原有平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)比C組大鼠顯著性減少（P<0.05，圖1a）；而DE組則較D組明顯增加（P<0.05，圖1a）。另外，與D組大鼠相比，C組、DE組在60秒內(nèi)有更長時(shí)間停留在象限Ⅳ（原平臺(tái)所在象限）內(nèi)（P<0.05，圖1b）。

圖1 Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 大鼠前額葉SSYYPP、PPSSDD--9955蛋白表達(dá)

2.2.1 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

在免疫熒光顯微鏡下觀察，SYP陽性反應(yīng)物呈紅色，PSD-95陽性反應(yīng)物呈綠色，兩者在前額葉均呈顆粒狀或點(diǎn)狀分布（圖2a）。與C組相比，D組大鼠前額葉SYP和PSD-95免疫熒光陽性反應(yīng)點(diǎn)分布較為稀疏；而DE組SYP和PSD-95免疫熒光陽性反應(yīng)點(diǎn)則較D組排列更加密集（圖2a）。進(jìn)一步對(duì)免疫熒光反應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，與C組相比，D組SYP（P<0.01；圖2b）和PSD-95（P<0.01；圖2c）的平均熒光強(qiáng)度值均顯著性降低；DE組SYP和PSD-95的平均熒光強(qiáng)度值雖然也低于C組，但與D組相比，則顯著性增高（P<0.05；圖2b、2c）。

圖2 大鼠前額葉SYP、PSD-95表達(dá)免疫熒光染色結(jié)果

2.2.2 Western BBlloott檢測(cè)結(jié)果

來自Western Blot分析的數(shù)據(jù)支持免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。如圖3所示，D組大鼠前額葉SYP蛋白和PSD-95蛋白表達(dá)水平均顯著性低于C組（P<0.01）；而與D組相比，DE組大鼠海馬SYP蛋白和PSD-95蛋白表達(dá)水平則顯著性增高（P<0.05）。

圖3 大鼠前額葉SYP、PSD-95表達(dá)的Western Blot檢測(cè)結(jié)果

2.3 大鼠前額葉SYP mmRRNNAA、PPSSDD--9955 mmRRNNAA表達(dá)

前額葉SYP mRNA、PSD-95 mRNA的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如圖4所示，D組大鼠前額葉組織SYP mRNA、PSD-95 mRNA表達(dá)水平均顯著性低于C組（P<0.05），DE組SYP mRNA則較D組顯著性增加（P<0.05）這與蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果相似；而DE組與D組PSD-95 mRNA無顯著性差異（P>0.05），不過數(shù)據(jù)顯示，DE組表達(dá)水平較D組有所增加。

圖4 大鼠前額葉SYP mRNA、PSD-95 mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

學(xué)習(xí)記憶能力作為腦的高級(jí)神經(jīng)功能，多個(gè)腦區(qū)如海馬、額葉等均在其中發(fā)揮著重要作用[25]。但以往關(guān)于腦衰老學(xué)習(xí)記憶功能的神經(jīng)機(jī)制研究更多地集中在海馬，對(duì)額葉的研究非常少。額葉位于中央溝前方，包括初級(jí)運(yùn)動(dòng)區(qū)、前運(yùn)動(dòng)區(qū)和前額葉三個(gè)區(qū)域。其中前額葉被認(rèn)為是在動(dòng)物演化史上發(fā)展最晚、進(jìn)化最高級(jí)的大腦區(qū)域，它與頂葉、枕葉、顳葉、杏仁核、紋狀體等大腦皮質(zhì)和皮層下腦區(qū)以及間腦、中腦和邊緣系統(tǒng)都有著密切的聯(lián)系，承擔(dān)著所有感知覺的整合作用，參與學(xué)習(xí)記憶編碼全過程[26-28]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，損害前額葉皮層的神經(jīng)元可以導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降，說明前額葉皮層對(duì)學(xué)習(xí)與記憶過程中是不可缺少的[26，29]。如Dharshan等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前額葉皮層受損時(shí)，猴子不能完成操作的記憶任務(wù)[29]；Browning等報(bào)道，當(dāng)切斷獼猴前額葉和顳葉之間的聯(lián)系后會(huì)導(dǎo)致其在如視－動(dòng)條件反射性學(xué)習(xí)、目標(biāo)定位情境學(xué)習(xí)等一系列復(fù)雜的學(xué)習(xí)任務(wù)中出現(xiàn)嚴(yán)重障礙[26]。而另有研究已經(jīng)證實(shí)，前額葉皮層是最易受衰老過程影響的腦區(qū)之一，而且年老者學(xué)習(xí)與記憶功能的下降與其前額葉皮層衰老密切相關(guān)[30，31]。

神經(jīng)突觸是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)信息傳輸?shù)年P(guān)鍵部位，包含突觸前膜、突觸間隙以及突觸后膜三部分。神經(jīng)突觸的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能在神經(jīng)細(xì)胞持續(xù)活動(dòng)的影響下能發(fā)生短暫或持久性特異性改變，這被稱為“突觸可塑性”[7，25]。突觸可塑性在學(xué)習(xí)與記憶過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其主要表現(xiàn)形式長時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentia?tion，LTP）與長時(shí)程抑制（long-term depression，LTD）被公認(rèn)為是學(xué)習(xí)與記憶活動(dòng)的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)[7，25]。盡管衰老時(shí)學(xué)習(xí)記憶功能下降的具體原因尚不清楚，但現(xiàn)有研究揭示，在老化過程中突觸可塑性會(huì)逐漸降低[7-10]，這被認(rèn)為可能是年老者學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能下降的直接原因。

SYP是一種分子量為38kD的鈣結(jié)合酸性糖蛋白，特異性地分布于所有突觸前終末的突觸前囊泡膜上，在囊泡的入塢、轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放與循環(huán)以及軸突生長、突觸發(fā)生等生理過程中發(fā)揮重要作用[9，10]。PSD-95則主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸能突觸的突觸后致密區(qū)，不僅參與突觸的形成，維持其正常結(jié)構(gòu)，還可通過不同結(jié)構(gòu)域與N-甲基-天門冬氨酸受體、使君子酸受體等谷氨酸受體及其相關(guān)的蛋白分子發(fā)生相互作用，介導(dǎo)與整合N-甲基-天門冬氨酸受體和使君子酸受體信號(hào)傳遞的復(fù)雜過程，進(jìn)而在LTP或LTD誘導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[32-34]。

Keleshian等報(bào)道老年人前額葉SYP表達(dá)水平顯著性低于中年人[35]。Haley GE等通過對(duì)恒河猴觀察發(fā)現(xiàn)，前額葉SYP水平會(huì)隨著老化而逐漸降低[36]。Shima?da等則通過對(duì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，腦衰老時(shí)其前額葉突觸后PSD-95表達(dá)明顯下降[13]。本研究中D-gal誘導(dǎo)的腦衰老大鼠與此相似。我們通過熒光免疫以及West?ern Blot技術(shù)檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)，長期注射D-gal誘導(dǎo)出的腦衰老大鼠前額葉中SYP、PSD-95蛋白表達(dá)水平比注射生理鹽水的青年大鼠明顯下降。SYP與PSD-95蛋白表達(dá)水平的降低意味著前額葉神經(jīng)突觸前、后結(jié)構(gòu)均發(fā)生了退行性變化，突觸數(shù)量減少，突觸囊泡運(yùn)輸能力以及谷氨酸能突觸后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合功能受損，這將阻礙神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)信息的傳遞，削弱信息處理和儲(chǔ)存能力，使突觸可塑性障礙，影響LTP或LTD形成，最終使學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能受損。

大量人類研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明長期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可以改善衰老者的學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知能力[4-6]。本研究獲得的數(shù)據(jù)同樣支持這一結(jié)論。我們?cè)诔掷m(xù)6周大鼠腹腔注射D-gal誘導(dǎo)腦衰老過程中給予有氧游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)，在隨后的Morris水迷宮測(cè)試中顯示，與D-gal誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶受損的腦衰老大鼠（D組）相比，D-gal注射過程中進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)的大鼠（DE組）能更快地尋找到隱藏的平臺(tái)，并記住平臺(tái)所在的位置，表現(xiàn)出更強(qiáng)的空間學(xué)習(xí)能力和記憶提取能力，說明有氧游泳運(yùn)動(dòng)有助于延緩D-gal所誘導(dǎo)的腦衰老過程中學(xué)習(xí)與記憶能力的下降。既然衰老者認(rèn)知功能與前額葉突觸蛋白SYP和PSD-95的表達(dá)變化密切相關(guān)，我們推測(cè)，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)D-gal誘導(dǎo)的腦衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善效應(yīng)可能與其能促進(jìn)前額葉腦組織內(nèi)SYP和PSD-95表達(dá)有關(guān)。為驗(yàn)證此推測(cè)，我們利用免疫熒光染色和Western Blot技術(shù)對(duì)大鼠前額葉SYP和PSD-95表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)與分析。所得數(shù)據(jù)顯示，在誘導(dǎo)腦衰老的過程中同時(shí)給予有氧游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)的大鼠前額葉SYP和PSD-95蛋白表達(dá)水平顯著性高于衰老模型組的大鼠，證明衰老過程中進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)能夠一定程度上防止衰老引起的前額葉神經(jīng)突觸前成分和突觸后成分的退行性變化，突觸可塑性增強(qiáng)。結(jié)合Real Time-PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示的運(yùn)動(dòng)組的大鼠前額葉SYP mRNA和PSD-95 mRNA水平同樣顯著性高于衰老模型組大鼠的結(jié)果，說明有氧運(yùn)動(dòng)能夠通過促進(jìn)衰老過程中的大鼠前額葉SYP和PSD-95基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，使前額葉SYP和PSD-95表達(dá)水平上升，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性變化，延緩腦衰老過程中學(xué)習(xí)記憶能力下降。

4 結(jié)論

在衰老過程中大腦前額葉突觸蛋白SYP和PSD-95表達(dá)水平會(huì)出現(xiàn)下降，導(dǎo)致突觸可塑性受損，而有氧運(yùn)動(dòng)可在一定程度上減輕其下降程度，進(jìn)而延緩衰老過程中突觸可塑性的退化，改善學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能。

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Effects of Aerobic Exercises on the Expression of SYP and PSD-95 in Prefrontal Lobe of Rats with Brain Aging Induced by D-galactose

Fu Yan1，2，Zhang Yeting2，Yuan Qiongjia2，Luo Xiao1
1 Department of Physical Education，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China 2 Department of Sports Medicine and Health，Chengdu Sport University，Chengdu 610041，China Corresponding Authour:Yuan Qiongjia，Email:Yqj1225@163.com

ObjectiveTo observe the effect of aerobic exercises on the expression of synaptophysin（SYP）and postsynaptic density protein-95（PSD-95）in the prefrontal lobe of brain-aging rats induced by D-galactose（D-gal）and to explore the underlying mechanism of aerobic exercises relieving learn?ing and memory deficits in the brain-aging process.MethodsThirty-six 3-month-old male Sprage-Daw?ley rats were randomly divided into a saline control group（C），a D-gal control group（D），and a D-gal and aerobic exercises group（DE），each of 12.The rats in both group D and DE were injected D-gal（100 mg/kg body weight）abdominally every day for 6 consecutive weeks，while those in group Cwere injected the same amount of saline.Meanwhile，the rats in group DE had performed aerobic swim?ming for 1 hour daily，while the other two groups did not do any exercises.Then，the Morris Water Maze（MWM）test was performed to estimate the learning and memory abilities.The immunofluores?cence technology，Western blotting and real-time PCR were used to determine the expression levels of SYP，PSD-95，SYP mRNA and PSD-95 mRNA in the prefrontal lobe.ResultsIn the process of naviga?tion training，all animals’escape latencies shortened gradually，indicating that each rat was able to learn to locate the submerged platform.The rats in group C and DE showed best performance on day 3 and no significant improvement was observed thereafter，whereas those in group D improved at a slow?er pace，and reached maximal performance on day 5.On the 2nd，3rdand 4thdays of the navigation train?ing，the average escape latency of group D was significantly longer than that of group C and group DE（P<0.05），while on the 1st，5thand 6thdays，there was no significant difference among the 3 groups.In the probe trial，rats in group D spent significantly less time in the target quadrant compared with both group C and DE（P<0.05），and rats in group C and DE crossed where the platform was fixed sig?nificanlty more often than group D（P<0.05）.The expression levels of SYP and SYP mRNA in the prefrontal lobe of rats in group D were significantly lower than group C（P<0.01），and group DE（P<0.05）.Compared with group C，the expression levels of PSD-95 and PSD mRNA in the prefrontal lobe of rats in group D declined significantly（P<0.01）.There was no significant difference in PSD-95 ex?pression between group D and DE，but the level of PSD-95 protein molecule of group DE was signifi?cantly higher than that of group D（P<0.05）.ConclusionsThe aerobic exercises can ameliorate the def?icits of SYP and PSD-95 expression in the frontal cortex of aging rats induced by D-gal to some ex?tent，and improve their learning and memory abilities.

aerobic exercise，brain aging，learning and memory，prefrontal lobe，synaptic proteins

2016.12.28

國家自然科學(xué)基金（31371202）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2017NZYQN22）

第1作者：付燕，Email：fuyan1010@163.com；

袁瓊嘉，Email：Yqj1225@163.com