可樂定通過激活膽堿能抗炎通路抑制肺損傷小鼠炎性反應(yīng)

劉彥鋒， 劉 展

(1 南陽醫(yī)專一附院麻醉科， 2南陽市中心醫(yī)院麻醉科一部， 河南 南陽 473000)

可樂定通過激活膽堿能抗炎通路抑制肺損傷小鼠炎性反應(yīng)

劉彥鋒1△， 劉 展2

(1南陽醫(yī)專一附院麻醉科，2南陽市中心醫(yī)院麻醉科一部， 河南 南陽 473000)

目的： 探討可樂定對肺損傷小鼠炎性反應(yīng)的影響及其作用機(jī)制。方法: 以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的肺損傷小鼠為模型，靜脈注射可樂定，取左肺上葉組織，檢測肺濕干重比(W/D)和總肺含水量(TLW)，ELISA試劑盒檢測炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，RT-PCR和Western blot檢測α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達(dá)的變化；鼻內(nèi)吸入法將α7nAChR基因RNA干擾慢病毒載體導(dǎo)入肺損傷模型小鼠肺內(nèi)，或者靜脈注射HMGB1外源性蛋白，檢測炎性因子和HMGB1的變化。結(jié)果: 可樂定可減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷，并通過降低細(xì)胞因子IL-6、IL-10和TNF-α水平從而抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)；可樂定促進(jìn)α7nAChR表達(dá)從而激活膽堿能抗炎通路，并抑制HMGB1的表達(dá)。結(jié)論: 可樂定對肺損傷小鼠具有抗炎作用，這可能與激活膽堿能抗炎通路，抑制HMGB1的表達(dá)有關(guān)。

可樂定； 肺損傷； 炎性反應(yīng)； 膽堿能抗炎通路； α7煙堿型乙酰膽堿受體； 高遷移率族蛋白B1

可樂定(clonidine，CLO)是α2-腎上腺素受體激動劑，作為一種麻醉輔助用藥已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用[1-2]?？蓸范軌蛞种浦袠猩窠?jīng)，具有降低血壓、鎮(zhèn)痛等作用。此外，近年動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，可樂定可以減輕低氧大鼠創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)，表明可樂定具有抗炎作用。乙酰膽堿(acetyl choline，ACh)是一種分布廣泛的重要神經(jīng)遞質(zhì)。有研究表明可樂定通過抗膽堿能作用，抑制胃腸道的過量分泌及胃腸蠕動，從而促進(jìn)腸黏膜對液體和電解質(zhì)的吸收[3]。可樂定能夠可逆性抑制乙酰膽堿的合成與釋放以及乙酰膽堿受體[4]。

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)發(fā)病過程中，促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子的共同作用介導(dǎo)著炎癥的發(fā)生和發(fā)展。有研究報道，LPS可誘導(dǎo)ALI，并促進(jìn)炎性因子的分泌[5]。細(xì)胞膽堿能抗炎通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一種抗炎途徑[6-7]，主要通過α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR)發(fā)揮抗炎作用[8-9]，α7nAChR對大鼠缺血再灌注后肺組織中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生具有抑制作用[10-11]。高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box protein 1，HMGB1)是一個含有215個氨基酸殘基的單鏈多肽，近年來研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在關(guān)節(jié)炎、急性肺損傷、缺血再灌注損傷等急慢性疾病扮演了重要角色[12-13]。

本實驗在建立小鼠肺損傷模型的基礎(chǔ)上，通過檢測可樂定對炎性反應(yīng)以及α7nAChR和HMGB1表達(dá)的影響，明確其對肺損傷的作用，為可樂定的作用機(jī)制研究提供新思路。

材 料 和 方 法

1 材料

10～12周齡BALB/c清潔級小鼠，雌性，體質(zhì)量(23±2) g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。

可樂定、LPS和外源性HMGB1蛋白均購自Sigma；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)基購自杭州四季青；RT-PCR試劑盒及RT-PCR引物合成購自上海生工生物；抗體購自BioSystems；ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德。

2 方法

2.1 小鼠α7nAChR小干擾RNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)小鼠α7nAChR基因序列(GenBank NM_04127)設(shè)計合成小分子干擾序列(siRNA)并設(shè)計與α7nAChR干擾無關(guān)的序列(si-mock)作為陰性對照，兩者經(jīng)BLAST比對與小鼠其它基因無明顯同源性。利用慢病毒載體試劑盒分別制備α7nAChRsiRNA(si-α7nAChR)和陰性對照慢病毒載體。

2.2 實驗分組及模型建立 將小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只：空白對照組，腹腔注射等量生理鹽水；LPS組，腹腔注射20 mg/kg LPS；LPS+CLO組，LPS注射15 min 前靜脈緩慢推注可樂定30 μg/kg；LPS+CLO+HMGB1組，LPS+CLO注射15 min 前注射外源性HMGB1蛋白10 mg/L；LPS+CLO+ si-mock組和LPS+CLO+si-α7nAChR組，分別將α7nAChR基因小干擾RNA或陰性對照慢病毒載體以鼻內(nèi)吸入法導(dǎo)入已注射可樂定的肺損傷模型小鼠肺內(nèi)，病毒載體滴度為1×1011TU/L， 5 μL。

2.3 肺濕干重比(wet weight/dry weight ratio,W/D)和總肺含水量(total lung water content,TLW)檢測 取左肺上葉組織，用生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，稱重為濕重(W)；在恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱70 ℃ 24 h烘干后稱重為干重(D)，兩者之比為W/D。TLW的計算公式如下：TLW=(W-D)/D。右肺置于-80 ℃冰箱中凍存，用于RT-PCR和Western blot法檢測。

2.4 ELISA檢測炎性細(xì)胞因子的含量 取小鼠肺泡灌洗液，根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書操作，分別測定IL-6、IL-10和TNF-α的含量。

2.5 RT-PCR檢測mRNA的表達(dá) Trizol提取總RNA，加入引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行DNA擴(kuò)增。α7nAChR的上游引物序列為5′-CATTGACGTTCGCTGGTTCC-3′，下游引物序列為5′-ATGGTGCTGGCGAAGTATTG-3′；HMGB1的上游引物序列為5′-ATGGGCAAAGGAGATCCTA-3′，下游引物序列為5′-ATTCATCATCATCATCTTCT-3′；β-actin的上游引物序列為5’-ACTGCCGCATCCTCTTCCTC-3’，下游引物序列為5’-AAGCATTTGCGGTGCACGA-3’。PCR反應(yīng)條件為： 94 ℃ 3 min； 94 ℃ 45 s， 58 ℃ 50 s， 72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)； 72 ℃ 7 min。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描成像。電泳圖像用Quanity One軟件進(jìn)行灰度分析。

2.6 Western blot分析 提取組織總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，再分別加入相應(yīng)的 I 抗稀釋液(兔抗小鼠α7nAChR和HMGB1多克隆抗體，1∶1 000)，4 ℃封閉過夜，洗膜后加入 II 抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，1∶500)孵育1 h，用ECL試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)，凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳條帶灰度掃描，以β-actin為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.5進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行組間比較和統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 可樂定對肺損傷的抗炎作用

腹腔注射LPS建立急性肺損傷小鼠模型，提取肺組織，檢測發(fā)現(xiàn)W/D和TLW均顯著提高(P<0.05)，表明肺組織受到嚴(yán)重?fù)p傷，IL-6、IL-10和TNF-α的含量增加，且差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；靜脈推注可樂定后發(fā)現(xiàn)，W/D和TLW下降，IL-6、IL-10和TNF-α的含量也顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖1。結(jié)果表明，可樂定具有減輕肺損傷，抑制炎性反應(yīng)的能力。

Figure 1.The anti-inflammatory effect of clonidine on lung injury. A: detection of W/D and TLW; B: ELISA was used to detect the content of inflammatory factors. CLO: clonidine. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖1 可樂定對肺損傷的抗炎作用

2 可樂定對肺損傷小鼠α7nAChR和HMGB1表達(dá)的影響

通過檢測肺損傷小鼠肺組織中α7nAChR和HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)肺損傷小鼠α7nAChR的表達(dá)受到抑制，而HMGB1則高表達(dá)(P<0.05)。靜脈注射可樂定后，α7nAChR的表達(dá)有所增加，即激活了膽堿能抗炎通路，而HMGB1表達(dá)減少。由此可以推測，可樂定在肺損傷中的作用可能與上調(diào)α7nAChR、抑制HMGB1的表達(dá)有關(guān)，見圖2。

Figure 2.The effect of clonidine on the expression of α7nAChR and HMGB1. The mRNA and protein levels of α7nAChR and HMGB1 were detected by RT-PCR (A) and Western blot (B), respectively. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsLPS group.

圖2 可樂定對α7nAChR和HMGB1表達(dá)的影響

3 α7nAChR和HMGB1對炎性因子分泌的影響

上述結(jié)果顯示可樂定的抗炎作用可能與α7nAChR和HMGB1的表達(dá)有關(guān)。向已注射可樂定的肺損傷小鼠肺內(nèi)導(dǎo)入si-α7nAChR慢病毒載體抑制α7nAChR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)炎性因子的分泌明顯增加(P<0.05)。注射外源性的HMGB1蛋白，結(jié)果相似，炎性因子的含量也增加(P<0.05)，說明α7nAChR和HMGB1均參與了LPS誘導(dǎo)的肺損傷炎性反應(yīng)，α7nAChR抑制IL-6、IL-10和TNF-α的生成，而HMGB1可促進(jìn)炎性因子的釋放，見圖3。

4 可樂定通過α7nAChR調(diào)控HMGB1的表達(dá)

我們猜測α7nAChR與HMGB1之間可能存在調(diào)控關(guān)系，通過RNA干擾的方法下調(diào)α7nAChR的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入si-α7nAChR后，α7nAChR的蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，提示si-α7nAChR能夠有效沉默α7nAChR的表達(dá)。進(jìn)而檢測si-α7nAChR對HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果如圖4所示，si-α7nAChR明顯上調(diào)HMGB1的mRNA及蛋白表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。由此可以推測可樂定是通過α7nAChR負(fù)調(diào)控HMGB1的表達(dá)。

Figure 3.The effects of α7nAChR and HMGB1 on the production of cytokines. The levels of IL-6, IL-10 and TNF-α were determined by ELISA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLPS+CLO group；#P<0.05vsLPS+CLO+si-mock group.

圖3 α7nAChR和HMGB1對炎癥因子分泌的影響

Figure 4.Down-regulation ofα7nAChRon the expression of HMGB1. The silencing efficiency of si-α7nAChR was determined by Western blot (A). The mRNA and protein levels of HMGB1 were detected by RT-PCR (B) and Western blot (C), respectively. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLPS group;#P<0.05vsLPS+CLO+si-mock group.

圖4 沉默α7nAChR對HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

討 論

ALI的本質(zhì)可能是一種肺內(nèi)過度性、失控性的炎癥反應(yīng)，內(nèi)毒素及其誘發(fā)的炎癥介質(zhì)的過度釋放是導(dǎo)致ALI的重要原因。致炎細(xì)胞因子是引起機(jī)體失控性炎癥反應(yīng)和組織損害的關(guān)鍵介質(zhì)。越來越多的證據(jù)表明過度產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β等已成為影響ALI/ARDS起病和發(fā)展的關(guān)鍵因素[14]。

可樂定是一種α2-腎上腺素受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜作用[15-16]，可以單獨(dú)使用也可與其它麻醉聯(lián)合用藥。研究表明，可樂定可以減輕低氧大鼠創(chuàng)傷后的炎性反應(yīng)[17]。右美托咪定也是一種α2-腎上腺素受體激動劑，右美托咪定可以抑制炎性反應(yīng)從而減輕膿毒血癥引起的ALI，具有明顯的肺保護(hù)作用，因此我們大膽猜測可樂定在ALI是否也有類似的抗炎作用。本文以LPS誘導(dǎo)的肺損傷BALB/c小鼠為研究模型，靜脈注射可樂定后發(fā)現(xiàn)，肺組織中炎性因子IL-6、IL-10和TNF-α的含量明顯降低，且肺濕干重比和總肺含水量也顯著下降，表明可樂定可抑制炎癥反應(yīng)，對肺損傷具有緩解作用。

膽堿能抗炎通路主要通過刺激α7nAChR對炎癥反應(yīng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[18]。其在脾臟、肝臟和胃腸道等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)通過釋放乙酰膽堿抑制細(xì)胞因子的合成，控制炎癥反應(yīng)[19]。α7nAChR是煙堿型乙酰膽堿受體的一個重要亞型，分布廣泛且功能多樣，參與功能調(diào)節(jié)及功能障礙相關(guān)疾病的病理生理過程。有研究表明，右美托咪定對膿毒癥大鼠有明顯的抗炎作用，可能是通過激活膽堿能抗炎通路而產(chǎn)生的，α7nAChR激動劑PNU-282987對大鼠腸缺血再灌注后肺組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生具有抑制作用[20]。HMGB1是一個高度保守的蛋白，廣泛分布于幾乎所有類型細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。Wang等[21]首次報道HMGB1作為新的潛在的炎癥介質(zhì)參與了膿毒癥的發(fā)病過程，是內(nèi)毒素致死效應(yīng)的重要炎癥介質(zhì)；HMGB1可促進(jìn)炎性因子IL-1β和TNF-α的釋放[22]，還有研究表明，右美托咪定通過抑制HMGB1的表達(dá)，從而抑制TLR4介導(dǎo)的一系列炎癥反應(yīng)。本研究通過檢測肺損傷小鼠肺組織中α7nAChR和HMGB1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，肺損傷導(dǎo)致α7nAChR被減弱而HMGB1過表達(dá)，可樂定可促進(jìn)α7nAChR的表達(dá)水平，即激活膽堿能抗炎通路，HMGB1的表達(dá)明顯下調(diào)。進(jìn)一步探究可樂定的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，抑制α7nAChR或過表達(dá)HMGB1都會加重炎癥因子的生成，且α7nAChR可負(fù)向調(diào)控HMGB1的表達(dá)。

綜上所述，可樂定可減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠肺損傷，抑制炎性反應(yīng)，從而抑制肺損傷，其機(jī)制可能與激活膽堿能抗炎通路、促進(jìn)α7nAChR而下調(diào)HMGB1的表達(dá)有關(guān)。本研究為可樂定的作用機(jī)制提供了新的依據(jù)和思路，對其在肺損傷中的肺保護(hù)作用還需要進(jìn)一步的研究探討。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲, 羅 森)

Clonidine inhibits inflammatory response in lung injury mice through cholinergic anti-inflammatory pathway

LIU Yan-feng1, LIU Zhan2

(1DepartmentofAnesthesia,TheFirstAffiliatedHospitalofNanyangMedicalCollege,2TheFirstDepartmentofAnesthesia,NanyangCentralHospital,Nanyang473000,China.E-mail:liuzhan2016@qq.com)

AIM: To explore the influence of clonidine on inflammatory response in lung injury mice and its possible mechanism. METHODS: Clonidine solution was intravenously injected into the mice with lung injury induced by LPS. The left upper lobe of the lung was collected to detect lung wet/dry weight ratio (W/D) and total lung water content (TLW). The concentrations of IL-6, IL-1β and TNF-α were measured by ELISA. The expression of α7 nicotinic acetylcholine receptor (α7nAChR) and high-mobility group box protein 1 (HMGB1) at mRNA and protein levels was determined by RT-PCR and Western blot. After importingα7nAChRsiRNA lentiviral vector or injecting exogenous HMGB1 protein, the inflammatory cytokines were detected. RESULTS: Clonidine attenuated lung injury and inhibited inflammatory reaction. Clonidine promoted the activation of cholinergic anti-inflammatory pathway by promoting α7nAChR expression. Clonidine inhibited HMGB1 expression, which promoted the secretion of IL-6, IL-1β and TNF-α. HMGB1 was negatively regulated by α7nAChR.CONCLUSION: Clonidine functions as an anti-inflammatory reagent to the lung injury mice. The mechanism may be related to activating the cholinergic anti-inflammatory pathway and inhibiting the expression of HMGB1.

Clonidine; Lung injury; Inflammatory reaction; Cholinergic anti-inflammatory pathway; α7 nicotinic acetylcholine receptor; High-mobility group box protein 1

1000- 4718(2017)07- 1283- 05

2016- 11- 18

2017- 02- 20

R614； R363.2； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.021

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 13733128296; E-mail: liuzhan2016@qq.com