黃芩素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬*

凌 云， 屠 玨， 蔡兆偉， 蔡月琴， 褚燕青， 陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 1動物實驗研究中心， 2比較醫(yī)學(xué)研究所， 浙江 杭州 310053)

黃芩素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬*

凌 云1, 2△， 屠 玨1, 2， 蔡兆偉1, 2， 蔡月琴1, 2， 褚燕青1， 陳民利1, 2

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)1動物實驗研究中心，2比較醫(yī)學(xué)研究所， 浙江 杭州 310053)

目的： 考察黃芩素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的自噬作用，并初步探討其機(jī)制。方法: 采用MTT實驗考察黃芩素對乳腺癌MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞活力的影響，確定給藥劑量。Western blot檢測黃芩素(25、50和100 μmol/L)及聯(lián)合自噬抑制劑3-MA作用下，MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞中自噬特征蛋白LC3-II和LC3-I的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染法觀察3-MA對黃芩素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞凋亡的影響，確認(rèn)黃芩素誘導(dǎo)自噬的作用。通過Western blot考察自噬信號通路相關(guān)蛋白p-mTOR、mTOR、p-AKT和AKT的蛋白水平，結(jié)合AKT-mTOR激活劑EGF明確AKT-mTOR通路在黃芩素誘導(dǎo)乳腺癌自噬中的作用。結(jié)果: 50 μmol/L及其以上劑量的黃芩素可顯著抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞的活力，其作用具有顯著的時效和量效性。Western blot結(jié)果表明，50和100 μmol/L黃芩素作用下MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞的LC3-II/LC3-I比例顯著增強(qiáng)，3-MA加入后又明顯降低。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，相比黃芩素單用組，聯(lián)合自噬抑制劑可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的壞死和凋亡。通路蛋白研究表明mTOR和AKT總量不變，其活化蛋白水平在黃芩素作用下顯著降低，而加入EGF后又再次增加。結(jié)論: 黃芩素可通過抑制AKT-mTOR通路誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞自噬。

黃芩素； 乳腺癌細(xì)胞； 自噬； AKT-mTOR信號通路

乳腺癌是一種在女性中發(fā)病率較高的癌癥，2015年公布的中國腫瘤臨床數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)生率占了所有女性腫瘤的15%，居于首位，且呈現(xiàn)逐年上升和年輕化的趨勢[1]。因此，針對乳腺癌的研究一直是抗腫瘤研究的重點(diǎn)。

黃芩素(baicalein)是從唇形科植物黃芩根部提取的一種黃酮類單體，其具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性。研究表明，黃芩素在包括乳腺癌、胃癌、肝癌和非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中均具有抗腫瘤活性[2-5]。其抗腫瘤作用主要包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、抑制其侵襲轉(zhuǎn)移等[2-6]。自噬是近年來開始被廣泛關(guān)注和研究的一種不同于凋亡的新的細(xì)胞降解途徑。目前已經(jīng)有不少黃酮類化合物誘導(dǎo)自噬抗腫瘤的作用機(jī)制被揭示[7-8]，然而黃芩素是否誘導(dǎo)乳腺癌自噬，目前少有報道。因此，本研究采用乳腺癌MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞作為工具，研究黃芩素與乳腺癌細(xì)胞自噬的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株和小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞株均購自中科院上海生物所細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑和藥物 黃芩素(含量98%)購自于上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，臨用前DMSO溶解配制0.1 mol/L母液待用。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640為Gibco產(chǎn)品；新生牛血清購自于杭州四季青生物工程公司；Annexin V/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；MTT粉末和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)購自Sigma；抗LC3抗體購自Cell Signaling，其它 I 抗均購自Santa Cruz；II 抗為LI-COR產(chǎn)品。表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)購買自PeproTech。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將貼壁的MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清和1×105U/L青、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5% CO2，相對濕度飽和)，每2～3 d傳代1次。

2.2 MTT檢測乳腺癌細(xì)胞活力 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，將MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞以1×108/L密度接種于96孔板中，每孔100 μL，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)。吸去培養(yǎng)基，分別加入6.25、12.5、25、50、100、200和400 μmol/L的黃芩素，每個濃度設(shè)置6～8個復(fù)孔，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中分別孵育24 h，48 h和72 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。每孔加入20 μL的MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡 將MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞分別以2×108/L密度接種于6孔板中，每孔1 mL。5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h至細(xì)胞密度約70%～80%。去除培養(yǎng)基，加入含25、50和100 μmol/L的黃芩素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，抑制劑組加入10 mmol/L 的3-MA繼續(xù)作用2 h，消化收集細(xì)胞，PBS清洗1次，加入0.5 mL的buffer重懸細(xì)胞，分別加入5 μL的Annexin V和碘化丙啶(propidium iodide，PI)兩種熒光染料避光孵育15 min，上機(jī)檢測。

2.4 Western blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá) 將2×108/L的MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞接種于6孔板中(每孔1 mL)，待細(xì)胞生長至60%～70%，去除培養(yǎng)基，正常組給予正常培養(yǎng)基，給藥組分別給予黃芩素25、50和100 μmol/L，黃芩素加3-MA(10 mmol/L)以及黃芩素加EGF(1 μg/L)48 h，其中3-MA在收細(xì)胞前2 h加入，EGF在黃芩素作用48 h后給予，并繼續(xù)孵育6 h，消化收集細(xì)胞，800×g離心，5 min。去上清后加入事先配好的細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解30 min后，12 000 r/min離心15 min。將上清轉(zhuǎn)移到新管中加入loading buffer，混勻后沸水浴變性，-20 ℃保存。

將蛋白樣品加入配制好的SDS聚丙烯凝膠泳道中，電泳2～3 h后，取凝膠并將其切成固定大小，通過蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上后，將膜置于5%脫脂牛奶封閉2 h。PBS洗去封閉液，加入含一定濃度 I 抗的PBST緩沖液中4 ℃孵育過夜。第2天將膜用PBST洗 10 min×3次，避光室溫用含 II 抗的PBST緩沖液繼續(xù)孵育2 h，避光洗去 II 抗，采用Odyssey近紅外掃描儀，Odyssey軟件分析其表達(dá)。

2.5 Western blot檢測相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá) 將2×108/L的MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至60%～70%，去除培養(yǎng)基，正常組給予正常培養(yǎng)基，給藥組分別給予黃芩素50和100 μmol/L，黃芩素加EGF (1 μg/L)，共同孵育48 h。其中EGF在黃芩素作用48 h后給予，并繼續(xù)孵育6 h，收集細(xì)胞。蛋白提取及檢測步驟同2.4。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析。計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃芩素對乳腺癌細(xì)胞活力的抑制作用

濃度為6.25、12.5、25、50、100、200和400 μmol/L的黃芩素對乳腺癌MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞分別作用24 h、48 h和72 h，從圖1A中可知，隨著黃芩素濃度的提高和作用時間的延長，其對MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞的活力抑制逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)為劑量和時間的依賴性。同時，圖1B鏡下細(xì)胞觀察表明，50和100 μmol/L黃芩素作用48 h后壞死細(xì)胞增多，貼壁細(xì)胞內(nèi)空泡顯著增加。根據(jù)該結(jié)果，我們選擇25、50和100 μmol/L作為后續(xù)實驗的研究濃度。

Figure 1.Inhibitory effect of baicalein on breast cancer cells. A： inhibition rates of both MCF-7 and 4T1 cells treated with 6.25， 12.5， 25， 50， 100， 200 and 400 μmol/L baicalein for 24， 48 and 72 h detected by MTT assay. Mean±SD.n=6. B： morphological changes of both MCF-7 and 4T1 cells treated with 25, 50 and 100 μmol/L baicalein for 48 h (×200).

圖1 黃芩素對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。

2 黃芩素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬和凋亡的關(guān)系

基于黃芩素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，我們考察了黃芩素誘導(dǎo)2種乳腺癌細(xì)胞自噬和凋亡的關(guān)系。圖2是黃芩素作用下，MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)雙染的實驗結(jié)果。50和100 μmol/L黃芩素可顯著誘導(dǎo)2種細(xì)胞凋亡，但總體程度不高(10%～20%)。當(dāng)給予自噬抑制劑3-MA后，MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞的凋亡和壞死程度均顯著提高，提示部分原本誘導(dǎo)自噬的細(xì)胞可能通過凋亡和壞死的方式發(fā)生自我降解。

Figure 2.Effects of baicalein on apoptosis and necrosis of breast cancer cells. Mean±SD.n= 3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05,##P<0.01vs50 μmol/L baicalein group；△P<0.05vs100 μmol/L baicalein group.

圖2 黃芩素對乳腺癌細(xì)胞凋亡和壞死的影響

3 黃芩素對乳腺癌細(xì)胞中LC3表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步確認(rèn)黃芩素對乳腺癌細(xì)胞自噬的影響，我們通過Western blot檢測LC3的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，50和100 μmol/L黃芩素作用下，LC3-II的蛋白水平顯著增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也明顯增大(P<0.01)。而加入抑制劑3-MA后，與黃芩素單用組相比，聯(lián)合自噬抑制劑組的自噬程度顯著降低(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.Effects of baicalein on the expression of LC3 protein in breast cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vs50 μmol/L baicalein group；△△P<0.01vs100 μmol/L baicalein group.

圖3 黃芩素對乳腺癌細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的影響

4 黃芩素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬的相關(guān)通路蛋白的表達(dá)

從圖4可見，MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞在50和100 μmol/L黃芩素作用下，p-mTOR和p-AKT的蛋白水平顯著降低(P<0.01)。為了進(jìn)一步確認(rèn)黃芩素誘導(dǎo)乳腺癌自噬與AKT-mTOR信號通路的關(guān)系，我們采用AKT-mTOR信號通路激活劑EGF[9]，結(jié)果表明，50 μmol/L黃芩素組中，EGF加入后細(xì)胞內(nèi)p-mTOR和p-AKT再次被活化(P<0.01)，同時LC3-II/LC3-I比值相比50 μmol/L黃芩素組有明顯降低(P<0.01)。而黃芩素對mTOR和AKT的總蛋白水平無明顯影響。

討 論

自噬是一種保守的細(xì)胞自我降解方式，是通過溶酶體吞噬自身胞質(zhì)或細(xì)胞器達(dá)到細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)和能量再利用的過程?；A(chǔ)水平的自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)所必需的，參與發(fā)育、免疫和抗衰老等多種生理過程。當(dāng)外界因素，如缺氧、饑餓、藥物作用等條件下，細(xì)胞內(nèi)自噬調(diào)控基因會啟動，將待降解胞質(zhì)或受損的細(xì)胞器包裝形成自噬體，并且通過與溶酶體融合，將其降解利用，客觀上保護(hù)細(xì)胞的存活。然而，當(dāng)外界環(huán)境進(jìn)一步惡化，細(xì)胞將啟動程序性死亡過程。因此，自噬對細(xì)胞的調(diào)控具有雙重性，是不同于凋亡的一種新的調(diào)控機(jī)制[10]。

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的酵母自噬相關(guān)基因atg8的同源體，在正常細(xì)胞中低表達(dá)。LC3有2種活化的亞型： LC3-I和LC3-II。當(dāng)發(fā)生自噬時，細(xì)胞內(nèi)LC3前體(pro-LC3)通過轉(zhuǎn)化為LC3-I并進(jìn)一步水解為LC3-II被招募至自噬體膜上，因此檢測LC3-II的含量可反映細(xì)胞內(nèi)自噬的水平，LC3-II/LC3-I比值升高被認(rèn)為是自噬體形成的標(biāo)志[11]。我們發(fā)現(xiàn)，在黃芩素作用下乳腺癌MCF-7和4T1細(xì)胞內(nèi)LC3-II/LC3-I比值均顯著增加，表明黃芩素作用后MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞內(nèi)自噬體顯著增加。3-MA是一種常用的自噬抑制劑，可選擇性抑制自噬相關(guān)蛋白Vps34和PI3Kγ[12]，阻斷PI3Kγ參與介導(dǎo)的自噬途徑。我們發(fā)現(xiàn)3-MA作用下，3-MA聯(lián)合黃芩素組較單用黃芩素組，其細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平的LC3-II/LC3-I比值顯著降低，而流式凋亡和壞死增加，表明黃芩素可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞自噬，同時提示，其作用途徑有PI3Kγ參與。

目前在中藥中，許多黃酮類提取物和單體均已被證明能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬進(jìn)而死亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[7-8]，黃芩素作為一種黃酮類中藥單體，其誘導(dǎo)自噬作用近年來已經(jīng)得到體內(nèi)外實驗證實。有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠體內(nèi)，黃芩素通過血紅素加氧酶1誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞自噬，降低肝臟缺血和再灌注損傷[13]。在肝癌細(xì)胞中，分別有研究表明，黃芩素可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和AKT/mTOR通路，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[14-15]。Aryal等[16]發(fā)現(xiàn)，黃芩素可通過 AMPK/ULK1/mTOR通路誘導(dǎo)前列腺癌自噬。此外，在卵巢癌中，黃芩素可通過抑制ERK和AKT誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬[17]。因此，黃芩素在多種細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬作用是較為明確的，并且可能與AKT和mTOR相關(guān)。

Figure 4.Effects of baicalein on the protein levels of p-mTOR, mTOR, p-AKT and AKT in breast cancer cells. A: MCF-7 cells； B: 4T1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vs50 μmol/L baicalein group；△△P<0.01vs100 μmol/L baicalein group.

圖4 黃芩素對乳腺癌細(xì)胞中p-mTOR、mTOR、p-AKT和AKT蛋白水平的影響

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的調(diào)控自噬的上游相關(guān)信號通路有多條，包括mTOR、PI3K/AKT、ROS和NF-κB信號通路等。其中被廣泛認(rèn)可的最主要的一條是mTOR信號通路，其作用核心蛋白mTOR的活化是決定自噬體形成和成熟的關(guān)鍵蛋白[18]。mTOR是目前自噬調(diào)控最主要的信號通路蛋白之一，而AKT是其上游重要的調(diào)控分子，因此，我們考察了這2個蛋白及其活化形式的變化，發(fā)現(xiàn)黃芩素可顯著抑制MCF-7和4T1細(xì)胞內(nèi)mTOR的活化。PI3K/AKT信號通路是mTOR上游與細(xì)胞增殖，存活和凋亡相關(guān)的信號通路，是調(diào)控自噬相關(guān)mTOR的主要上游信號通路之一[19-20]。我們發(fā)現(xiàn)黃芩素能夠抑制AKT的活化而對總的AKT影響不大。因此，我們推測PI3K/AKT信號通路可能介導(dǎo)了黃芩素對mTOR表達(dá)的抑制。進(jìn)一步的，我們通過生長因子EGF重新激活A(yù)KT/mTOR通路，LC3-II/LC3-I比值顯著降低。

綜上所述，本實驗通過自噬標(biāo)志物和自噬抑制劑，研究黃芩素對乳腺癌MCF-7細(xì)胞和4T1細(xì)胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)一定劑量的黃芩素可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬，并且該作用可能通過抑制細(xì)胞存活的PI3K/AKT通路，進(jìn)而影響mTOR通路的活化發(fā)揮作用。該實驗結(jié)果為黃芩素在乳腺癌方面的臨床應(yīng)用提供了一定的實驗基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Baicalein induces autophagy in breast cancer cells

LING Yun1, 2, TU Jue1, 2, CAI Zhao-wei1, 2, CAI Yue-qin1, 2, CHU Yan-qing1, CHEN Min-li1, 2

(1AnimalExperimentalResearchCenter,2InstituteofComparativeMedicine，ZhejiangChineseMedicineUniversity,Hangzhou310053,China.E-mail: 18465129@qq.com)

AIM: To investigate the autophagy of breast cancer cells induced by baicalein and to explore its mechanism. METHODS: The effects of baicalein on the viability of MCF-7 cells and 4T1 cells were investigated by MTT assay, and the dosage of the drug was determined. The expression levels of microtubule-associated protein 1 light chain 3-II (LC3-II) and LC3-I in the MCF-7 cells and 4T1 cells treated with baicalein at doses of 25, 50 and 100 μmol/L, or combined with autophagy inhibitor 3-methyladenine (3-MA) were determined by Western blot. In order to confirm the role of baicalein in autophagy, the effect of 3-MA on the apoptosis of both MCF-7 cells and 4T1 cells induced by baicalein was analyzed by flow cytometry. The protein levels of p-mTOR, mTOR, p-AKT and AKT were examined by Western blot and the role of AKT-mTOR pathway in the induction of autophagy in breast cancer induced by baicalein was determined by the combination of activators. RESULTS: Baicalein at 50 μmol/L and above doses significantly inhibited the viability of breast cancer cells in a dose- and time-dependent manner. The expression of LC3-II/LC3-I in both MCF-7 cells and 4T1 cells was significantly enhanced after the action of baicalein, and the ratio of LC3-II/LC3-I was significantly decreased after 3-MA addition. The results of flow cytometry showed that, compared with baicalein group, the combination of baicalein and 3-MA promoted the levels of necrosis and apoptosis. Moreover, the protein levels of p-mTOR and p-AKT were significantly decreased and were rescued by EGF， while their total protein levels were not changed.CONCLUSION: Baicalein induces autophagy through AKT-mTOR pathway both in MCF-7 cells and 4T1 cells.

Baicalein; Breast cancer; Autophagy; ATK-mTOR signal pathway

1000- 4718(2017)07- 1171- 06

2016- 10- 18

2017- 05- 09

浙江省自然科學(xué)基金(No. LQ13H280004)；浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級科技創(chuàng)新團(tuán)隊(No. XTD201301)

R979.19； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.003

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