microRNA133b的單核苷酸多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性的初步探討

馬國(guó)祥 丁茜萍 鄧海華 楊振漢

?

microRNA133b的單核苷酸多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性的初步探討

馬國(guó)祥 丁茜萍 鄧海華 楊振漢

目的 探討microRNA133b的SNP單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)與腦卒中的相關(guān)性。方法 收集本院神經(jīng)內(nèi)科2012年9月～2016年9月1200例腦卒中患者的臨床資料，將其定義為觀察組，同時(shí)以1200例體檢健康者作為正常對(duì)照組，觀察2組血液中的microRNA133b的表達(dá)水平、microRNA133b的單核苷酸多態(tài)性以及各組中相關(guān)的臨床參數(shù)。結(jié)果 觀察組中腦卒中患者的飲酒史和高血壓病史的比例都顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；觀察組腦卒中患者血清總膽固醇(total cholesterol，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDLC)、空腹血糖、甘油三酯(triglyceride，TC)以及C反應(yīng)蛋白的水平都顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；觀察組腦卒中患者血清中高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDLC)水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；觀察組腦卒中患者的microRNA133b中SNP+112A/T基因在A位點(diǎn)的基因頻率顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；microRNA133b的水平與血清LDLC的水平呈顯著正相關(guān)(r=0.7，P<0.05)。結(jié)論 microRNA133b位點(diǎn)的單核苷酸位點(diǎn)基因多態(tài)性以及患者血清血脂代謝的紊亂可能都是腦卒中發(fā)生的重要影響因素，microRNA133b位點(diǎn)的單核苷酸位點(diǎn)基因多態(tài)性位點(diǎn)可能是腦卒患者潛在的分子標(biāo)記物。

腦卒中 microRNA133b 單核苷酸多態(tài)性 影響因素

腦卒中屬于神經(jīng)系統(tǒng)重要疾病之一，具有發(fā)病率及病死率較高的特點(diǎn)[1]。最新的數(shù)據(jù)顯示，在我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)腦卒中是排在首位的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病[2-3]。腦卒中嚴(yán)重威脅著患者的生命和健康，然而腦卒中的治療效果尚不理想，更重要的是人們對(duì)腦卒中的發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚。影響腦卒中發(fā)生的因素很多，既有環(huán)境因素，又有基因因素，其中與腦卒中發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因及其發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探討[4-5]。

據(jù)最新的數(shù)據(jù)顯示，腦卒中發(fā)病的影響因素很多，例如生活習(xí)慣、不合理的膳食、過(guò)量飲酒、肥胖、糖尿病、缺乏運(yùn)動(dòng)、高血壓病、高脂血癥、種族、性別、年齡和血管性因素等[6-8]。其中，高血壓病、不合理膳食和運(yùn)動(dòng)、飲酒和基因因素是腦卒中的最重要影響因素[9-10]。進(jìn)一步的研究提示，腦卒中患者血清總膽固醇(total cholesterol，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDLC)、空腹血糖、甘油三酯(triglyceride，TC)以及C反應(yīng)蛋白的水平是導(dǎo)致腦卒中最直接和重要因素[11-12]。因?yàn)檠^(guò)高容易導(dǎo)致腦血管堵塞甚至破裂，最終導(dǎo)致大腦組織的直接損傷和大腦局部缺血和壞死，所以，血脂是腦卒中發(fā)生的關(guān)鍵[13-15]。血管生成素和血管生成和修復(fù)相關(guān)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子直接參與了腦卒中的發(fā)生[16-18]。

microRNA是一類(lèi)非編碼的小RNA，其功能廣泛，例如microRNA參與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡[15-17]。最新的研究表明，microRNA133b與人們的脂類(lèi)代謝的調(diào)節(jié)和紊亂密切相關(guān)，microRNA133b血清水平代表人類(lèi)的血脂狀況[11]。然而，microRNA133b是否直接或間接的與心血管疾病的發(fā)生或發(fā)展有關(guān)尚不清楚，心臟病患者血清microRNA133b表達(dá)水平上調(diào)[12]，這暗示microRNA133b也可能參與了腦卒中[13]。

因此，本研究收集本院神經(jīng)內(nèi)科2012年9月～2016年9月1200例腦卒中患者的臨床資料，將其定義為觀察組，同時(shí)以1200例體檢健康者作為正常對(duì)照組，將探討腦卒中發(fā)生發(fā)展的臨床因素、microRNA133b在患者血液中的表達(dá)水平、是否存在microRNA133b的SNP(單核苷酸多態(tài)性)以及microRNA133b與腦卒中的相關(guān)性，以期為腦卒中及相關(guān)疾病的診斷、預(yù)防、治療和預(yù)后提供一些的理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集本院神經(jīng)內(nèi)科2012年9月～2016年9月1200例腦卒中患者的臨床資料，將其定義為觀察組，同時(shí)以1200例體檢健康者作為正常對(duì)照組。本研究得到本院倫理委員會(huì)的審核和批準(zhǔn)。所有的腦卒中患者及其健康志愿者均簽署了知情同意書(shū)。

按照文獻(xiàn)報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)[12]，對(duì)腦卒中患者進(jìn)行嚴(yán)格的入選或排除。觀察組1200例腦卒中患者都經(jīng)過(guò)醫(yī)學(xué)影像學(xué)、臨床病理學(xué)和分子生物學(xué)的檢測(cè)和確診。所有腦卒中患者的年齡都>60歲。觀察組1200例腦卒中患者無(wú)腦血管疾病史，也沒(méi)有家族史。腦卒中研究對(duì)象的病例資料完整。

1.2 血液樣本的收集和處理

抽取腦卒中患者和正常對(duì)照組患者的靜脈血，對(duì)血液樣品進(jìn)行檸檬酸抗凝預(yù)處理，所有血液樣本經(jīng)低速離心，150 r/min×10 min，收集血清樣品，保存于-90 ℃冷凍室備用。

1.3 血液樣品的RT-PCR檢測(cè)

按照文獻(xiàn)報(bào)道的的方法提取血液樣本的基因組RNA，進(jìn)行常規(guī)反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；再以cDNA為PCR的模板，進(jìn)行常規(guī)的PCR反應(yīng)。具體流程和體系見(jiàn)表1；PCR反應(yīng)體系和具體條件見(jiàn)表2。

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)體系和條件

1.4 臨床基本血液參數(shù)的檢測(cè)

使用上海生物工程責(zé)任有限公司生產(chǎn)的血液全自動(dòng)檢測(cè)儀分析腦卒中患者以及正常對(duì)照組的臨床一般血液指標(biāo)和參數(shù)，檢測(cè)指標(biāo)有血清總膽固醇(total cholesterol，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDLC)、空腹血糖、甘油三酯(triglyceride，TC)以及C反應(yīng)蛋白的水平。

1.5 microRNA133b基因表達(dá)水平的檢測(cè)、序列分析和SNP(單核苷酸多態(tài)性)分析

按照常規(guī)的方法使用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量，并對(duì)獲得的PCR擴(kuò)增的基因片段進(jìn)行深度測(cè)序。在pubmed中查找microRNA133b的基因序列，對(duì)測(cè)序和microRNA133b的基因序列比對(duì)，分析microRNA133b基因的多態(tài)性。

計(jì)算腦卒中患者和正常對(duì)照組血清中microRNA133b基因在SNP+112A/T位點(diǎn)的基因型分布情況和等位基因頻率。microRNA133b基因在SNP+112A/T位點(diǎn)的等位基因的頻率=一種類(lèi)型microRNA133b基因的個(gè)數(shù)/(該類(lèi)型microRNA133b基因的個(gè)數(shù)+microRNA133b等位基因的個(gè)數(shù)) 。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件，所有數(shù)據(jù)和變量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用單因素方差分析組內(nèi)因子的差異，而不同組間的分析采用成對(duì)的t檢驗(yàn)，腦卒中的相關(guān)因素分析采用Logistic回歸方析及直線(xiàn)相關(guān)性分析。當(dāng)P<0.05判斷差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 觀察組腦卒中患者和正常對(duì)照組一般資料的比較

如表3所示，觀察組腦卒中患者的高血壓病史和飲酒史的比例都顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，但是2組在性別、年齡、糖尿病史、病程和體質(zhì)指數(shù)等指標(biāo)方面無(wú)明顯差異。

表3 觀察組腦卒中患者和正常對(duì)照組一般資料的比較

2.2 觀察組和正常對(duì)照組血液學(xué)參數(shù)的比較

觀察組腦卒中患者血清總膽固醇(total cholesterol，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDLC)空腹血糖、甘油三酯(triglyceride，TC)以及C反應(yīng)蛋白的水平都顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；觀察組腦卒中患者血清中高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDLC)水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)(表4)。

表4 觀察組和正常對(duì)照組血液學(xué)參數(shù)的比較

2.3 觀察組和正常對(duì)照組SNP+112A/T基因型頻率和等位基因頻率數(shù)據(jù)的分析

觀察組腦卒中患者的microRNA133b中SNP+112A/T基因在A位點(diǎn)的基因頻率顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；microRNA133b的水平與血清LDLC的水平呈顯著正相關(guān)(r=0.7，P<0.05)(表5)。

表5 觀察組和正常對(duì)照組SNP+112A/T基因型頻率和等位基因頻率數(shù)據(jù)的分析結(jié)果

2.4 觀察組腦卒中患者發(fā)病影響因素的Logistic回歸分析

表6顯示，高膽固醇、高甘油三酯、飲酒和112A/A基因型是影響腦卒中的重要影響因素。

表6 觀察組腦卒中患者發(fā)病影響因素的Logistic回歸分析

2.5 microRNA133b的水平與血清LDLC水平的關(guān)系

直線(xiàn)性相關(guān)分析顯示，microRNA133b的水平與血清LDLC水平呈顯著正相關(guān)(r=0.7，P<0.05)(圖1～2)

3 討 論

腦卒中嚴(yán)重威脅患者的生命和健康，因此對(duì)腦卒中發(fā)生發(fā)展影響因素的分析既有理論意義，又有實(shí)用價(jià)值[1-3]。以往的研究提示，microRNA可能與機(jī)體的病理學(xué)狀態(tài)密切相關(guān)[14]。本研究探討了microRNA133b在患者血液中的表達(dá)水平、是否存在microRNA133b的SNP(單核苷酸多態(tài)性)以及microRNA133b與腦卒中的相關(guān)性，以期為腦卒中及相關(guān)疾病的診斷、預(yù)防、治療和預(yù)后提供一些理論基礎(chǔ)。

圖1 microRNA133b的水平與血清LDLC水平的關(guān)系

圖2 觀察組和正常對(duì)照組中microRNA133b的表達(dá)水平 與對(duì)照組比較,*P<0.05

本研究結(jié)果顯示，(1)觀察組中腦卒中患者的飲酒史和高血壓病史的比例都顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。這與以往的研究結(jié)果一致[28]；(2)觀察組腦卒中患者血清總膽固醇(total cholesterol，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDLC)、空腹血糖，甘油三酯(triglyceride，TC)以及C反應(yīng)蛋白的水平都顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；觀察組腦卒中患者血清中高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDLC)水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；(3)觀察組腦卒中患者的microRNA133b中SNP+112A/T基因在A位點(diǎn)的基因頻率顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；(4)microRNA133b的水平與血清LDLC的水平呈顯著正相關(guān)(r=0.7，P<0.05)，這提示microRNA133b可能是潛在的腦卒中患者發(fā)生和發(fā)展的特異性分子標(biāo)記物。這些結(jié)果與以往的研究結(jié)論一致[17，20]，即腦卒中患者血脂、血糖紊亂是該疾病發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，同時(shí)也是腦卒中引起的結(jié)果。本研究microRNA133b的水平與血清LDLC的水平呈顯著正相關(guān)(r=0.7，P<0.05)，這是目前報(bào)道中未發(fā)現(xiàn)的結(jié)果，也是一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)，即microRNA水平可能與腦卒中呈正相關(guān)。總之，microRNA133b位點(diǎn)的單核苷酸位點(diǎn)基因多態(tài)性以及患者血清血脂代謝的紊亂可能都是腦卒患者發(fā)生疾病的重要影響因素，microRNA133b位點(diǎn)的單核苷酸位點(diǎn)基因多態(tài)性位點(diǎn)可能是腦卒患者潛在的分子標(biāo)記物。

本研究的不足與缺點(diǎn)：(1)雖然本研究包含了1200例腦卒中患者，但是對(duì)于臨床發(fā)病機(jī)理的研究來(lái)說(shuō)，研究對(duì)象仍然較少，本研究的結(jié)果仍需增加腦卒中病例數(shù)以便進(jìn)一步論證；(2)本研究缺少microRNA133b在腦卒中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)理；(3)本研究缺少腦卒中大鼠等動(dòng)物模型的進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] Pei L,Meng S,Yu W,et al.Inhibition of MicroRNA-383 ameliorates injury after focal cerebral ischemia via targeting PPARγ[J].Cell Physiol Biochem,2016,39(4):1339-1346.

[2] Kim J,Choi GH,Ko KH,et al.Association of the single nucleotide polymorphisms in microRNAs 130b,200b,and 494 with ischemic stroke susceptibility and Post-Stroke mortality[J].PLoS One,2016,11(9):e0162519.

[3] Zhang N,Zhong J,Han S,et al.MicroRNA-378 alleviates cerebral ischemic injury by negatively regulating apoptosis executioner caspase-3[J].Int J Mol Sci,2016,17(9):1427.

[4] Stary CM,Sun XY,Ouyang YB,et al.miR-29a differentially regulates cell survival in astrocytes from cornu ammonis 1 and dentate gyrus by targeting VDAC1[J].Mitochondrion,2016,30:248-254.

[5] Liu WS,Chen XS,Zhang Y.Effects of microRNA-21 and microRNA-24 inhibitors on neuronal apoptosis in ischemic stroke[J].Am J Transl Res,2016,8(7):3179-3187.

[6] Miao W,Bao TH,Han JH,et al.Neuroprotection induced by post-conditioning following ischemia/reperfusion in mice is associated with altered microRNA expression[J].Mol Med Rep,2016,14(3):2582-2588.

[7] Zhou X,Su S,Li S,et al.MicroRNA-146a down-regulation correlates with neuroprotection and targets pro-apoptotic genes in cerebral ischemic injury in vitro[J].Brain Res,2016,1648:136-143.

[8] Lopez MS,Dempsey RJ,Vemuganti R.Resveratrol preconditioning induces cerebral ischemic tolerance but has minimal effect on cerebral microRNA profiles[J].Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism,2016,36(9):1644-1650.

[9] Choi GH,Ko KH,Kim JO,et al.Association of miR-34a, miR-130a, miR-150 and miR-155 polymorphisms with the risk of ischemic stroke[J].Int J Mol Med,2016,38(1):345-356.

[10]Yi H,Huang Y,Yang F,et al.MicroRNA-182 aggravates cerebral ischemia injury by targeting inhibitory member of the ASPP family(iASPP) [J]. Arch Biochem Biophys,2016,P861(16):30141-30142.

[11]Sarkar S,Jun S,Rellick S,et al.Expression of microRNA-34a in alzheimer's disease brain targets genes linked to synaptic plasticity, energy metabolism, and resting state network activity[J].Brain Res,2016,1646(1646):139-151.

[12]Lopez-Ramirez MA,Reijerkerk A,De Vries HE,et al.Regulation of brain endothelial barrier function by microRNAs in health and neuroinflammation[J].FASEB Journal,2016,30(8):2662-2672.

[13]Taj SH,Kho W,Riou A,et al.MiRNA-124 induces neuroprotection and functional improvement after focal cerebral ischemia[J].Biomaterials,2016,91:151-165.

[14]Yf D,Chen ZZ,Zhao Z,et al.Potential role of microRNA-7 in the anti-neuroinflammation effects of nicorandil in astrocytes induced by oxygen-glucose deprivation[J].J Neuroinflammation,2016,13(1):60.

[15]Fang Z,He QW,Li Q,et al.MicroRNA-150 regulates blood-brain barrier permeability via Tie-2 after permanent middle cerebral artery occlusion in rats[J].FASEB Journal,2016,30(6):2097-2107.

[16]Zhang J,Yuan L,Zhang X,et al.Altered long non-coding RNA transcriptomic profiles in brain microvascular endothelium after cerebral ischemia[J].Exp Neurol,2016,277:162-170.

[17]Liu DZ,Jickling GC,Ander BP,et al.Elevating microRNA-122 in blood improves outcomes after temporary middle cerebral artery occlusion in rats[J].Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism,2016,36(8):1374-1383.

[18]Bernstock JD,Lee YJ,Peruzzotti-Jametti LA,et al.A novel quantitative high-throughput screen identifies drugs that both activate SUMO conjugation via the inhibition of microRNAs 182 and 183 and facilitate neuroprotection in a model of Oxygen and glucose deprivation[J].Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism,2016,36(2):426-441.

[19]Kim J,Yoon H,Horie T,et al.microRNA-33 regulates ApoE lipidation and amyloid-beta metabolism in the brain[J].Journal of Neuroscience,2015,35(44):14717-14726.

(2016-10-09收稿)

A preliminary study on the correlation between single nucleotide polymorphism of microRNA133b and stroke

Ma Guoxiang, Ding Qianping, Deng Haihua, et al.

Department Of Medicine, Fuyong People's Hospita of Shenzhen Baoan District, Shenzhen 518103

Objective To investigate the correlation between single nucleotide polymorphism(SNP) of microRNA133b and stroke.Methods The clinical data of 1200 patients with stroke(the observation group) were collected in our hospital from September 2016 to September 2012 . At the same time, 1200 healthy persons were taken as the normal control group. The microRNA133b expression level of the blood, clinical parameters related to microRNA133b and single nucleotide polymorphism were detected in two groups.Results The ratio of drinking and hypertension were significantly higher in the observation group than those in the normal control group (P<0.05). The total cholesterol (TG), low density lipoprotein cholesterol cholesterol(LDLC), fasting blood glucose, triglyceride (TC) and C reactive protein level were significantly higher in the observation group than those in the normal control group (P<0.05). The density lipoprotein cholesterol (HDLC) level was significantly higher in the observation group than that in the normal control group (P<0.05). The frequency of SNP+112A/T gene in A was significantly higher in the observation group than that in the normal control group (P<0.05), the frequency of the SNP+112A/T gene was significantly higher than that in the normal control group (P<0.05). There was a significantly positive correlation between the microRNA133b level and the serum LDLC level.Conclusion The microRNA133b single nucleotide polymorphism loci and serum lipid metabolism disorder were the important influencing factors in stroke, single nucleotide polymorphism loci of microRNA133b locus might be the potential molecular marker of stroke patients.

Stroke MicroRNA133b Single nucleotide polymorphism Influencing factor

518103 廣東省深圳市寶安區(qū)福永人民醫(yī)院內(nèi)科

R743.3

A

1007-0478(2017)03-0185-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.004