骨碎補活性單體成分調(diào)控骨質(zhì)疏松癥相關(guān)信號通路的研究進展

招文華 沈耿楊 任輝 丘婷 張志達 唐晶晶 陳康 梁德 姚珍松 楊志東 江曉兵*

1. 廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種嚴重危害人類健康的代謝性骨病，具有高發(fā)病率、高致殘率的特點[1]。目前，針對OP的治療趨向多樣化，但仍以西藥治療為主，如降鈣素、雙膦酸鹽、氟化物等。然而，這些西藥大多數(shù)都具有一定副作用，如降鈣素可引起惡心、嘔吐、面部潮紅、手部麻刺感及低血鈣造成的四肢搐搦等不良反應(yīng)，當應(yīng)用動物來源的降鈣素時，還可引起過敏反應(yīng)，而雙膦酸鹽除了可引起惡心、嘔吐、腹痛、肌肉骨骼痛等不良反應(yīng)外，還有可能引起頜骨壞死、食管癌和腎功能衰竭等嚴重不良反應(yīng)。因而，尋求高效、安全、價格低廉的抗骨質(zhì)疏松新藥仍迫在眉睫。長期以來，臨床運用中藥治療OP顯示出獨特優(yōu)勢，能明顯緩解患者癥狀，提高骨密度，改善生活質(zhì)量[2]。近年來，骨碎補在促進骨折愈合、防治骨質(zhì)疏松等方面的藥理作用逐漸引起了國內(nèi)外學者的關(guān)注，同時大量實驗研究顯示，骨碎補能有效抑制骨吸收與促進骨形成[3,4]。而OP的發(fā)生，實質(zhì)就是骨吸收和骨形成過程中的動態(tài)平衡被打破，引起骨組織生理代謝發(fā)生變化，繼而使得骨組織結(jié)構(gòu)和力學特征發(fā)生改變的過程。目前的研究顯示，Wnt/β-catenin、骨保護素/細胞核因子kB受體活化因子配體/細胞核因子kB受體活化因子(OPG/RANKL/RANK)、組織蛋白酶K(CTSK)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等分子信號通路在骨吸收和骨形成中起著重要的調(diào)控作用?；谝陨闲盘柾?，近年來研究者進行了大量有關(guān)骨碎補活性單體成分防治OP的研究，并取得可喜成果，本文將綜述骨碎補活性單體成分調(diào)控OP相關(guān)信號通路的研究進展。

1 骨碎補抗OP的活性單體成分研究

研究表明，從骨碎補中分離得到的化學成分類型主要包括黃酮、三萜、酚酸及其苷類等[5]，酚酸類也稱苯丙素類。其中，關(guān)于骨碎補抗OP活性的研究主要集中于總黃酮。骨碎補中的黃酮類化合物主要有二氫黃酮、黃烷-3-醇(又稱兒茶素類)、黃酮、黃酮醇、色原酮、查爾酮、橙酮類及其衍生物等。近年來，從骨碎補的乙醇提取物中已經(jīng)分離得到40種黃酮類化合物。在對骨碎補總黃酮的單體成分進一步研究發(fā)現(xiàn)，其活性成分是以柚皮苷為主的二氫黃酮類化合物，而柚皮苷的藥理作用主要是活血祛瘀、接骨療傷和增強心肌細胞機能[6]，但柚皮苷并非是骨碎補唯一的有效成分。目前，骨碎補總黃酮這一混合物中被證明具有抗OP作用的活性單體成分包括柚皮苷、柚皮素及新北美圣草苷。

1.1 柚皮苷

近年來，柚皮苷的研究是一個熱點，其抗OP的活性獲得了比較充分的肯定。Li 等[7]報道，柚皮苷可有效促進BMSCs的增殖和成骨分化，促進骨鈣素(BGP)的表達，增強骨密度、增大骨體積及骨小梁密度從而有效逆轉(zhuǎn)OP。徐展望等[8]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可促進體外培養(yǎng)BMSCs的Runx-2和 Osterix的表達，增強OP大鼠的骨強度，增大骨小梁面積。劉偉等[9]報道，1×10-5mol/L的柚皮苷可明顯促進兔BMSCs的增殖并向OB分化，翟遠坤等[10]發(fā)現(xiàn)此濃度的柚皮苷可顯著促進大鼠乳鼠OB的增殖分化，并且該促進效果會被雌激素通路阻斷劑ICI 182.780所抑制，表明柚皮苷屬于植物雌激素，通過雌激素信號通路發(fā)揮其促骨形成活性，可以用于OP的防治。另外，李風波等[11]報道，柚皮苷可抑制OC分化、增殖和骨吸收功能，推測其機制可能是通過抑制OC分化過程中特異性基因表達實現(xiàn)的；他們的另一項研究[12]表明，柚皮苷可提高OP骨折大鼠的骨密度、骨體積、相對骨體積比、平均骨小梁厚度，改善骨代謝，從而增強OP骨折愈合后的力學強度。

柚皮苷除了存在于骨碎補中，還廣泛存在于柚子、葡萄柚、酸橙及其變種的果皮中，我國是柚子生產(chǎn)大國，因而大部分的柚皮苷來源于柚子，但有研究發(fā)現(xiàn)，來源于骨碎補的柚皮苷的抗OP活性強于來源于柚子的柚皮苷，筆者認為今后有必要對兩種來源不同的柚皮苷作進一步的研究，如它們的化學結(jié)構(gòu)及活性等。

1.2 柚皮素

柚皮素是從骨碎補中分離得到的二氫黃酮類化合物，近年來研究表明其具有較明顯的抗OP作用。宋雙紅等[13]研究報道，柚皮素可對抗卵巢切除引起的大鼠體重增加，抑制骨轉(zhuǎn)換指標血清BGP和尿液脫氧吡啶啉(DPD)含量的升高，降低骨轉(zhuǎn)換率，保持骨密度，改善骨應(yīng)力和彈性模量等內(nèi)在特性指標，同時顯著改善骨小梁微結(jié)構(gòu)。翟遠坤等[14]通過比較研究柚皮苷及其代謝物柚皮素對體外培養(yǎng)乳鼠顱骨OB分化成熟的影響發(fā)現(xiàn)，柚皮苷和柚皮素均能明顯提高乳鼠顱骨OB的堿性磷酸酶活性，刺激BGP、BMP-2、骨橋蛋白和I型膠原的分泌，增加鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量，并促進成骨相關(guān)基因mRNA表達，并發(fā)現(xiàn)柚皮素的活性明顯高于柚皮苷，推測是柚皮苷經(jīng)代謝后，其代謝產(chǎn)物柚皮素的促骨形成活性得到增強，這在抗OP新藥的開發(fā)及劑型設(shè)計方面有一定的指導意義。

1.3 新北美圣草苷

新北美圣草苷是骨碎補中分離出的另一個主要的活性成分。實驗表明，新北美圣草苷比柚皮苷在促進成骨樣細胞MC3T3-E1的增殖和分化方面有更強的作用，且能夠更有效的增加堿性磷酸酶的活性。通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)柚皮苷和新北美圣草苷都可以上調(diào)成骨分化過程中Runx2、COLI和BGP這3個標志性基因的表達，但在新北美圣草苷作用下Runx2、COLI和BGP的表達量分別比在柚皮苷作用下的表達量上調(diào)了56%、37%和14%。此外新北圣草苷可以一定程度上逆轉(zhuǎn)PD98059對細胞分化的抑制作用，可見新北圣草苷可能是骨碎補中另一個更有效的抗OP治療的活性成分[15]。然而，針對新北美圣草苷與柚皮苷的對比研究，目前僅停留在細胞水平，缺乏動物實驗支持，因而對該化合物開展分離純化和活性研究的前景廣闊。

目前，盡管骨碎補總黃酮的有效單體成分對BMSCs、OB、OC以及動物模型的作用得到深入探討，但在相關(guān)分子信號通路上的研究仍較欠缺。

2 骨碎補調(diào)控分子信號通路抗OP的作用機制

研究發(fā)現(xiàn)，在骨吸收和骨形成過程中存在受多種調(diào)節(jié)因子調(diào)控的信號通路[16，17]。骨碎補通過抑制骨吸收信號通路中的調(diào)控蛋白，或促進骨形成信號通路中調(diào)控蛋白的合成和釋放，改善OP中骨代謝不平衡的病理過程，從而對OP起到防治作用。目前發(fā)現(xiàn)骨碎補調(diào)控骨吸收的信號通路主要包括OPG/RANKL/RANK通路、CTSK通路，調(diào)控骨形成主要有Wnt/β-catenin通路和BMP通路。

2.1 OPG/RANKL/RANK信號通路

OPG/RANKL/RANK 信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)在OC分化過程中起重要作用的信號傳導通路[18]。OPG又稱OC抑制因子，是腫瘤壞死因子受體超家族中的一員，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能直接負向調(diào)控OC的調(diào)控因子。骨組織中的OPG主要由OB譜系的各種細胞產(chǎn)生，并隨細胞的分化成熟而增加。RANKL是OPG的配體，主要由骨組織中的OB和基質(zhì)細胞分泌，在骨和骨髓中呈現(xiàn)高水平的表達。RANKL主要與OC表面的特異性受體RANK結(jié)合，進而刺激OC分化、活化和成熟，同時抑制OC凋亡。而OPG能與RANKL競爭性結(jié)合RANK，從而阻斷由RANKL引起的OC前體分化、存活和融合，抑制成熟OC活化及骨吸收活性，最終導致OC凋亡[19-20]。因而，OPG的主要作用是抑制骨吸收，RANKL的主要作用是促進骨吸收，通過促進OPG的表達或者抑制RANKL的表達都可以抑制骨吸收，最終達到防治OP的目的。

趙曉燕等[21]報道，骨碎補水提液能上調(diào)OPG mRNA水平的表達。朱振標等[22]通過觀察骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠RANKL/OPG表達的影響發(fā)現(xiàn)，骨碎補總黃酮可增加去卵巢大鼠骨密度，抑制骨組織RANKL mRNA表達，促進OPG mRNA表達，最終造成骨組織RANKL含量減少，OPG含量增加，RANKL/OPG比值減小而使成骨增加。劉康等[23]用不同劑量骨碎補總黃酮對OP大鼠進行干預，發(fā)現(xiàn)不同劑量骨碎補總黃酮均影響OPG/RANKL/RANK軸系統(tǒng)，且隨骨碎補總黃酮劑量的增加效果越明顯，可能是通過調(diào)控OPG/RANKL/RANK軸系統(tǒng)使OPG表達增加、RANK和RANKL的表達下降來實現(xiàn)的。吳連國等[24]報道，骨碎補總黃酮可提高OP大鼠骨礦含量、降低血清RANKL水平，但不能提高血清雌二醇水平。Ang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可抑制OC形成和骨吸收，此過程是通過抑制RANKL表達，并且活化核因子κB(NF-κB)及磷酸化ERK實現(xiàn)的。

2.2 CTSK信號通路

圖1 骨碎補有效成分調(diào)控OPG/RANKL/RANK信號通路Fig.1 Effective constituent of rhizoma drynariae regulating the OPG/RANKL/RANK signaling pathway

圖2 骨碎補有效成分調(diào)控CTSK信號通路Fig.2 Effective constituent of rhizoma drynariae regulating the CTSK signaling pathway

CTSK是一種在OC中表達豐富的半胱氨酸蛋白酶，它是番木瓜蛋白酶家族中的一種蛋白水解酶，主要參與Ⅰ型膠原、骨橋蛋白、骨連接蛋白等骨基質(zhì)的降解。CTSK主要通過調(diào)節(jié)骨膠原纖維降解來促進骨吸收，其主要作用靶點位于Ⅰ/Ⅱ型膠原纖維膠質(zhì)的N端三股螺旋處[26]。因而部分學者認為通過抑制CTSK對骨組織的作用，可以達到延緩骨基質(zhì)降解、改善OP的目的。

研究[27]表明，骨碎補提取物能抑制OC骨吸收，具體表現(xiàn)在骨吸收陷窩數(shù)和面積均呈劑量依賴性地減少，其對OC的作用可能是通過抑制細胞內(nèi)CTSK的表達而起的，抑制作用與濃度呈依賴性關(guān)系。近來的一項研究[28]也認為CTSK在骨吸收中扮演著重要的角色，是骨質(zhì)疏松癥防治的潛在靶點，而骨碎補總黃酮能夠降低CTSK的表達。而史曉林等[29]通過觀察骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型CTSK的血清濃度和左脛骨干骺端基因表達的影響發(fā)現(xiàn)，骨碎補總黃酮能夠抑制去卵巢大鼠血清CTSK濃度、降低左脛骨干骺端CTSK mRNA表達量，倪力剛等[30]也得到一致結(jié)果。Jeong等[31]用OC/OB共培養(yǎng)物來考察骨碎補的有效成分在骨吸收中的作用，在實驗中分別用磷脂酰肌醇3(PI3)激酶抑制藥渥曼青霉素(wT)和蛋白抑制藥、蛋白激酶抑制藥(calphostin C)為對照考察骨碎補有效成分對OC介導CTSK在OC中的成熟與轉(zhuǎn)運作用，發(fā)現(xiàn)骨碎補與wT作用類似，在骨吸收過程中抑制CTSK前體的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運與表達。

2.3 Wnt/β-catenin 信號通路

Wnt 信號通路參與人體內(nèi)多種器官和組織的生長、發(fā)育和分化調(diào)控，其在OP方面的研究目前已受到廣泛的關(guān)注。目前已知的Wnt 細胞內(nèi)信號通路傳導途徑有多條，其中 Wnt/β-catenin 通路最為經(jīng)典，在骨吸收和骨形成過程中起重要作用[32]。Wnt/β-catenin通路作用機制為：Wnt蛋白與細胞膜受體卷曲蛋白(Fz)和輔助受體脂蛋白受體相關(guān)蛋白 5/6(LRP5/6)結(jié)合，活化Fz受體，通過骨架蛋白(Dv)和酪蛋白激酶1(CK1)傳遞信號，活化由軸蛋白(axin)、結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白(APC)和糖原合成酶激酶3(GSK3)組成的復合物，激活細胞內(nèi)信號通路[33]。無Wnt信號刺激時，GSK 3 磷酸化β-catenin，β-catenin 通過泛素/蛋白酶體途徑降解。而當有 Wnt 信號刺激時，蛋白復合物解離不發(fā)生磷酸化，catenin 在胞漿中積聚并轉(zhuǎn)位入核，與轉(zhuǎn)錄因子T細胞因子/淋巴細胞增強因子(TCF/LEF)結(jié)合啟動靶基因如 c-myc、cyclin D1的轉(zhuǎn)錄，促進細胞的增殖或活化，該過程對成骨非常關(guān)鍵[34]。

郭英等[35]探討骨碎補總黃酮對BMSC成骨分化過程中對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)因子mRNA表達的影響發(fā)現(xiàn)，骨碎補總黃酮在分化早期促進β-catenin、淋巴增強因子1(LEF-1)、細胞周期蛋白D (cycline D) mRNA的表達，在晚期抑制其表達，認為在骨碎補總黃酮誘導BMSC成骨分化過程中，Wnt/β-catenin信號通路可能主要參與早期分化。Ma等[36]報道，柚皮苷可對抗切除坐骨神經(jīng)所誘發(fā)的廢用性骨質(zhì)疏松，促進OB分化并抑制OC的分化，在活化 Wnt/β-catenin 信號通路的同時也增加Sema3A的表達。Lv等[37]也發(fā)現(xiàn)柚皮苷可通過活化Wnt/β-catenin 信號通路，增加骨膜蛋白的表達并抑制殼硬蛋白的表達從而阻止廢用性骨質(zhì)疏松的進程。Wang等[38]報道柚皮苷可對抗去卵巢性骨質(zhì)疏松，增強骨強度，增加β-catenin的mRNA及蛋白的表達，并活化LEF、TCF轉(zhuǎn)錄因子。

圖3 骨碎補有效成分調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路Fig.3 Effective constituent of rhizoma drynariae regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway

2.4 BMP信號通路

BMPs屬于轉(zhuǎn)移生長因子TGF-β超家族中的一員，其主要生物學作用是誘導未分化的間充質(zhì)細胞增殖及發(fā)生成骨分化，最終促進軟骨和新生骨的形成。BMP信號通路主要是通過BMPs與其活化素激酶受體相結(jié)合，激活細胞內(nèi)下游通路如Smad和MAPK等信號通路，從而發(fā)生一系列磷酸化或聚合酶鏈反應(yīng)[39]。BMP作為調(diào)節(jié)OB生長最重要的系列生長因子之一，對骨形態(tài)的發(fā)生具有決定性作用。目前的研究[40]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP 具有很強的促進OB分化和誘導體外成骨的能力，在誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞發(fā)生成骨分化的同時還可抑制其向脂肪細胞和肌肉細胞轉(zhuǎn)化。因此，通過促進骨組織中BMPs的表達來增加骨量可以達到改善OP的目的。其中BMP-2 是誘導成骨活性最強的BMPs之一，主要對未分化間充質(zhì)細胞和骨系細胞起到募集和分化作用[41]。

張迪華等[42]通過摘除性成熟SD大鼠雙側(cè)卵巢，模擬絕經(jīng)后期大鼠，給予強骨膠囊(主要含骨碎補總黃酮)進行干預，觀察在雌激素撤退的情況下，BGP和BMP-2在骨組織中的表達情況，研究發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠口服強骨膠囊能促進BMP-2和BGP的表達。董?；鄣萚43]研究發(fā)現(xiàn)，在骨愈合過程中，骨碎補對TGF-β1mRNA、BMP-2 mRNA基因表達具有有益的調(diào)節(jié)作用,說明成骨可能與骨碎補上調(diào)BMP信號通路中TGF-β1mRNA、BMP-2 mRNA基因表達有關(guān)。而Yang 等[44]也發(fā)現(xiàn)，骨碎補水提液能有效的促進SD大鼠MSCs增殖和骨向分化，并且在MSCs骨向分化過程中，骨碎補水提液可上調(diào)TGF-β1、BMP-2的表達量。Wu等[45]報道，柚皮苷具有預防卵巢切除小鼠骨量丟失的潛能和作用，其作用機制是柚皮苷在OB中通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路，轉(zhuǎn)錄因子c-Fos/c-Jun和活化蛋白-1旁路誘導BMP-2表達。

上述提到，BMP信號通路的下游存在Smad信號通路和MAPK信號通路兩條重要的通路，其對成骨的作用非常關(guān)鍵。朱慧鋒等[46]通過手術(shù)切SD大鼠的雙側(cè)卵巢，建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，研究骨碎補總黃酮對骨質(zhì)疏松大鼠Smad1、Smad5 mRNA 表達的影響，發(fā)現(xiàn)骨碎補總黃酮能夠上調(diào)骨髓微環(huán)境中Smad1、Smad5 mRNA的表達水平，并以中劑量組最明顯。汪甜等[47]研究表明，柚皮苷具有顯著促進MSCs 骨向分化的能力，主要是通過激活MAPK信號通路中ERK通路、JNK 通路，以及上調(diào) BMP-2的表達來促進 MSCs 骨向分化的，其中柚皮苷上調(diào)BMP-2的表達受MAPK通路中p38通路的影響較大。

圖4 骨碎補有效成分調(diào)控BMP信號通路Fig.4 Effective constituent of rhizoma drynariae regulating the BMP signaling pathway

3 結(jié)語

尋找OP相關(guān)分子信號通路上的作用靶點并進行相關(guān)的靶向治療，是有效防治OP的重要途徑。在OP的臨床治療中，中藥發(fā)揮整體調(diào)節(jié)和綜合治療的優(yōu)勢，能明顯改善患者骨密度[48]。近些年來，骨碎補在防治OP方面取得了較為確切的臨床療效，而大量文獻也報道骨碎補能促進骨形成與抑制骨吸收，同時發(fā)現(xiàn)相關(guān)信號通路在骨碎補有效成分抗OP過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。因此，深入探討骨碎補活性單體成分的多通路分子生物學機制，對指導骨碎補抗OP治療具有重要意義。

但目前骨碎補作用于骨代謝分子信號通路的研究尚處于起步階段，就其研究廣度而言，除了上述所報道的分子信號通路以外，還包括PTH通路、NF-κB通路、雌激素通路、谷氨酸通路等[49]；就其研究深度而言，大部分分子機制研究僅限于單一通路，而骨代謝受到多條信號通路的調(diào)節(jié)，這些通路之間交叉重疊、相互聯(lián)系，共同構(gòu)成了一個影響骨穩(wěn)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)信號調(diào)控系統(tǒng)。另外，由于傳統(tǒng)分子生物學技術(shù)對單個或數(shù)個分子信號基因或蛋白檢測的局限，以及基因芯片等高通量篩選技術(shù)的應(yīng)用難度，導致研究效率不高，因而難以全面詮釋骨碎補多靶點、多途徑、多層次的作用機制，這些問題有待研究者們進一步的努力探索和解決，而通路間的相互交聯(lián)(crosstalk)也將成為今后的研究重點之一。

其次，由于目前在研究分子信號通路的相關(guān)調(diào)控蛋白時，使用的干預藥物主要是骨碎補總黃酮，骨碎補總黃酮作為一種混合物，難以明確其多個單體成分與信號通路調(diào)控靶點之間的關(guān)系，因此有效單體成分的分離、鑒定及相關(guān)體內(nèi)、體外研究仍需廣泛開展。