髖骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中鈣結(jié)合蛋白(S100A12)的表達及意義

代鳳雷 孫強 張斌 金雯 陳榮國 錢建吉

1. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬六合醫(yī)院骨科，南京 211500 2. 南京市第一醫(yī)院骨科，南京 210006 3. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬六合醫(yī)院病理科，南京 211500 4. 南京市中醫(yī)院骨傷科，南京 210006

髖骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA) 是一種由多種因素引起的老年人的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，是最常見的關(guān)節(jié)炎類型之一。髖骨關(guān)節(jié)炎的病理機制尚不完全清楚，近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，致炎物質(zhì)及免疫因子與骨關(guān)節(jié)炎癥密切相關(guān)。在OA 的早期, 滑膜的增生和纖維化, 分泌炎癥介質(zhì)和軟骨降解酶, 可能是OA 發(fā)病的重要因素, 隨著OA 的進一步發(fā)展, 滑膜始終參與其病理過程。鈣結(jié)合蛋白(S100A12)在多種炎性反應(yīng)中如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，潰瘍性結(jié)腸炎和多種腫瘤等都有高的血清反應(yīng)[1-4]，是與多數(shù)炎癥疾病相關(guān)的蛋白。在本研究中，我們的目的是檢測鈣結(jié)合蛋白S100A12在髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的表達，并分析其與髖骨性關(guān)節(jié)炎嚴重程度的相關(guān)性，以評估它在OA的發(fā)病中的作用。

1 材料和方法

1.1 對象

2014年6月至2016年4月，我院聯(lián)合南京市第一醫(yī)院骨科收治的行關(guān)節(jié)置換的髖骨性關(guān)節(jié)炎患者為實驗組(OA組)， 共27例，男15例，女12例，平均年齡61歲；對照組為外傷所致股骨頸骨折患者35例，男21例，女14例，平均年齡59歲。股骨頸骨折均行關(guān)節(jié)置換手術(shù)，術(shù)前結(jié)合病史及影像學(xué)檢查排除骨性關(guān)節(jié)炎病變。兩組患者術(shù)前行髖關(guān)節(jié)X線及CT檢查，明確診斷。納入患者得到患者本人同意及醫(yī)院倫理委員會批準。參照美國風(fēng)濕病學(xué)會1995年提出的診斷標(biāo)準：①近1月反復(fù)髖關(guān)節(jié)疼痛；②血沉≤ 20 mm/h；③ X 線片示骨贅形成，髖臼緣增生；④ X 線片示髖關(guān)節(jié)間隙狹窄。滿足①+②+③條或①+③+④條者可診斷髖關(guān)節(jié)退行性骨關(guān)節(jié)炎。對OA組患者的髖關(guān)節(jié)X片分析，根據(jù)Kellgren-Lawrence(K-L)分期標(biāo)準，將27例OA組患者劃分： 3 級16 例，4 級11 例。排除標(biāo)準：其他原因?qū)е碌捏y關(guān)節(jié)病變?nèi)珙愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、感染等；治療前2 w內(nèi)使用過糖皮質(zhì)類固醇激素的患者；半年內(nèi)行關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射；合并嚴重的系統(tǒng)疾病以及神經(jīng)、精神障礙者。

1.2 方法

血清標(biāo)本的采集: 患者禁食12 h，取靜脈血，除送檢血常規(guī)、ASO、RF、CRP外，4℃下2000 g 離心10 min后取上清貯存于-80℃冰箱內(nèi)備用。手術(shù)標(biāo)本的采集：髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中暴露關(guān)節(jié)滑膜，按同一規(guī)格，同一部位，切取0.5 cm0.5 cm滑膜，生理鹽水反復(fù)沖洗標(biāo)本表面血跡后放入消毒凍存的EP管內(nèi)，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；免疫組化測定標(biāo)本立即放入4%多聚甲醛液固定, 經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋, 免疫組化備用。

ELISA 試劑盒為S100A12 Elisa 試劑盒及S100A12多克隆抗體由美國Abnove 公司提供，BCA 試劑盒、裂解液及二抗由南京碧云天生物技術(shù)研究所提供。

ELISA法測血清S100A12含量：S100A12濃度的定量測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，使用ELISA試劑盒并按試劑盒說明書執(zhí)行(S100A12/EN-RAGE ELISA Kit，Cat no: KOA091 V.04，美國Abnove 公司)。S100A12 蛋白標(biāo)準液用前24h內(nèi)配制；取0.1 mL的蛋白標(biāo)準工作液于孔板中；0.1 mL 樣品稀釋液于“0”孔中，做空白對照；取樣品上清50 μL 加入50μL 的樣品稀釋液于空的孔中；加蓋，37℃，90 min，孵育；孵育結(jié)束，去掉孔板上的液體；取0.1 mL 抗體工作液于每孔中，37℃，60 min，孵育；PBS 洗板3 次，去掉液體；取0.1 mL 稀釋后的ABC 工作液于每孔，37℃，30 min，孵育。PBS洗板5 次，去掉孔板上的液體；加入90 μL TMB顯色液，37℃，30 min，孵育；加100 μL TMB 終止液于每孔中，30 min內(nèi)酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)測定A450的OD值。根據(jù)標(biāo)準曲線計算出樣品的蛋白含量。實際S100A12 濃度應(yīng)為測試結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。

ELISA法測滑膜組織S100A12含量：將滑膜組織標(biāo)本自然解凍后，切成細小的碎片，置于離心管中，向每個離心管中加入200 μL的預(yù)配置的裂解液，冰上裂解1h，組織勻漿離心(10000 g，4℃，15 min)，取上清。BCA法測定總蛋白的含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明。反應(yīng)結(jié)束半小時內(nèi)酶標(biāo)儀測定A562的OD值。根據(jù)標(biāo)準曲線計算出樣品的蛋白濃度。ELISA測滑膜組織S100A12含量，步驟按試劑盒說明嚴格執(zhí)行；加終止液后30 min內(nèi)酶標(biāo)儀測定A450的OD值，根據(jù)標(biāo)準曲線計算出樣品的蛋白含量。計算每一總蛋白濃度中S100A12含量，單位為ng/mg總蛋白。

免疫組化標(biāo)本的采集及染色：蠟塊3 μm連續(xù)切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法 (streptavidin-perosidase，SP) 法進行免疫組化染色。常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化。3% H2O2清除內(nèi)源性過氧化物酶，置于pH6.0的檸檬酸鈉修復(fù)液，微波加熱修復(fù)；10%正常山羊血清封閉，室溫20 min，甩去多余液體；加入一抗，4℃過夜，用PBS緩沖液代替抗體作空白對照；生物素標(biāo)記的二抗孵育；加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素原液(1∶300)，孵育30 min。DAB顯色30 min。常規(guī)蘇木素復(fù)染，梯度酒精、二甲苯脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察，拍照(×400)。結(jié)果判定標(biāo)準：陽性細胞指細胞質(zhì)或細胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片在顯微鏡下隨機選擇5個高倍視野，染色程度進行半定量分析，采用Image Pro Plus 6.0(IPP)軟件對片進行灰度分析，計算陽性反應(yīng)的平均光密度值(mean optic density，MOD)，MOD=積分光密度/面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

OA組患者年齡(61.9±6.34)歲和對照組(59.6±14.7)歲之間無顯著的年齡差異(P=0.18)，兩組之間性別差異不顯著(P=0.80)。見表1。

獨立樣本T檢驗，OA組的血清中S100A12水平(94.20±49.85)ng/mL顯著高于對照組含量(25.32±16.87)ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)?；そM織OA組與對照組S100A12含量分別為(3.73±1.97)ng/mg總蛋白和(1.67±1.21)ng/mg總蛋白(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

OA組K-L分級4級患者的血清中S100A12水平(104.81±46.68)ng/mL顯著高于3級血清含量(86.85±52.46)ng/mL，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。4級患者滑膜組織含量(4.62±1.95)ng/mg總蛋白顯著高于3級患者水平(3.13±1.82)ng/mg總蛋白(P<0.01)。4級患者滑膜組織MOD (0.23±0.06)高于3級患者MOD(0.20±0.06)，但無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.30)。

免疫組化分析S100A12表達水平，陽性反應(yīng)在微血管內(nèi)中性粒細胞胞漿中，以及部分滑膜細胞的胞漿內(nèi)。兩組S100A12 均表達，OA組平均光密度MOD(0.21±0.06)較對照組MOD(0.13±0.05)有顯著性差異(P<0.01)。免疫組化圖片見圖1，2。

使用Pearson 相關(guān)分析滑膜組織含量與血清含量無顯著相關(guān)性(r=0.378，P=0.083)；滑膜組織含量與免疫組化MOD顯著正相關(guān)性(r=0.43，P=0.048)，但相關(guān)關(guān)系不密切。血清含量與免疫組化MOD無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表1 OA組與對照組一般情況比較±s)Table 1 Comparison of general data between OA and ±s)

圖1 OA組滑膜免疫組化Fig.1 Immunohistochemical results in OA group

圖2 對照組免疫組化Fig.2 Immunohistochemical results in control group

3 討論

S100A12是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種促炎因子，參與機體的免疫防御和炎癥反應(yīng)，在炎癥發(fā)應(yīng)中起關(guān)鍵作用，具有調(diào)節(jié)細胞生長分化、生長抑制、并誘導(dǎo)細胞凋亡等[5]。促炎因子S100A12鈣結(jié)合蛋白家族中的一員，與鈣離子的親和力較高，在其他炎癥介質(zhì)刺激后，發(fā)生蛋白構(gòu)象的改變，由此暴露靶蛋白結(jié)合位點，能夠與特異性的蛋白或肽類結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)功能。這些鈣結(jié)合蛋白控制一些關(guān)鍵細胞通路，如細胞骨架，細胞的遷移與粘附，主動氧化防御，參與傷口的愈合，炎性細胞的激活、化學(xué)趨化和抗微生物作用，代謝性及腫瘤性疾病的病理生理過程[6,7]。

髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是一種老年患者常見病，髖關(guān)節(jié)是人體主要的負重關(guān)節(jié)，容易勞損，多見于體重肥胖的老年人。該病起病緩慢，病程長，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙，行走困難，嚴重影響了老年人的生活質(zhì)量。髖骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險因素眾多，包括年齡、負重改變及外傷等。然而，其發(fā)病機制仍然不明確。

滑膜組織是指位于關(guān)節(jié)腔、滑液鞘及滑液囊腔最內(nèi)面的內(nèi)襯膜狀結(jié)構(gòu)，其主要作用被認為是產(chǎn)生滑液, 降低關(guān)節(jié)、肌腱、肌肉活動過程中的摩擦阻力。雖然并非所有的OA 發(fā)病都與滑膜炎有關(guān)，但慢性滑膜炎的產(chǎn)生，可能是促進OA 進行性發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對滑膜組織病理的深入研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)滑膜分泌的炎性介質(zhì)如金屬蛋白酶(MMP)、腫瘤壞死因子-A(TNF-A)、白細胞介素-1(IL- 1)、細胞間黏附分子-1(ICAM- 1)等可能參與了OA 的整個病變過程[8-9]。

本實驗研究顯示，髖關(guān)節(jié)OA患者血清及滑膜組織中的S100A12含量顯著高于對照組，說明S100A12對髖關(guān)節(jié)OA患者發(fā)病有重要影響。關(guān)節(jié)外組織及血液中分泌的S100A12進入血液循環(huán)系統(tǒng)，到達OA患者的關(guān)節(jié)周圍組織如滑膜，促進滑膜炎的產(chǎn)生；血液的中性粒細胞分泌的S100A12并未完全通過滑膜進入關(guān)節(jié)液，可能在轉(zhuǎn)運過程中受到滑膜屏障的限制。免疫組織化學(xué)檢測顯示，S100A12陽性染色不僅存在于滑膜組織細胞中，也存在于OA患者滑膜的微血管中，說明S100A12可以由關(guān)節(jié)外組織分泌經(jīng)血液循環(huán)，通過滑膜屏障作用于關(guān)節(jié)軟骨，也可以在滑膜組織自身分泌，近距離更直接的發(fā)揮作用。

通過血液滑膜組織S100A12表達量的比較，S100A12經(jīng)血液系統(tǒng)作用于關(guān)節(jié)比滑膜組織自分泌更有意義。進一步說明骨性關(guān)節(jié)炎是一種系統(tǒng)性疾病，其發(fā)生發(fā)展是關(guān)節(jié)自身損害與全身各系統(tǒng)病變相互作用的結(jié)果。

本實驗存在一定缺陷，實驗組髖OA患者較少，因為是臨床試驗，缺少健康對照組；髖骨性關(guān)節(jié)炎OA患者多為老年人，基礎(chǔ)病較多，對納入試驗的患者，不能將關(guān)節(jié)外病變完全排除，系統(tǒng)性疾病對檢測結(jié)果應(yīng)有一定的影響；缺少對患者骨性關(guān)節(jié)炎的嚴重程度評級，不能完全說明S10012含量的變化對病情嚴重程度的相關(guān)性；缺少治療前后的檢測對比。

綜上所述，滑膜組織的S100A12的檢測對OA的診斷的靈敏度高于血清檢測。由于在多種疾病進程中S100A12被發(fā)現(xiàn)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩腸炎、銀屑病、胰腺炎、腫瘤、肺炎，以及某些自身免疫性疾病，所以血清檢測S100A12對OA的診斷缺少特異性[10,11]。因此通過滑膜檢測S100A12，可將關(guān)節(jié)外病變對S100A12含量變化的影響降低，進而提高靈敏度；S100A12含量的檢測對早期診斷OA，評估OA的進展有益[12,13]。S100A12在OA患者的滑膜中表達；并且S100A12的表達與患者骨關(guān)節(jié)炎嚴重程度成正相關(guān)； S100A12的檢測有助于骨性關(guān)節(jié)炎的早期診斷，提示病變嚴重程度，為臨床治療提供參考。