五環(huán)三萜類化合物促進(jìn)骨形成研究

吉璐宏 趙庭波

仙桃市第一人民醫(yī)院骨外二科，湖北 仙桃 433000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)被破壞為特征的全身性骨骼代謝障礙性疾病，并容易發(fā)生脆性骨折[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)60歲以上的人群其骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率高達(dá)59%[2]，隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加快，骨質(zhì)疏松患者將會(huì)越來(lái)越多[3]，這使得骨質(zhì)疏松已成為一個(gè)社會(huì)性的健康問(wèn)題。

在正常的情況下，骨組織和其他組織一樣有著穩(wěn)定的代謝平衡，骨吸收與骨形成的速度大致相等，處于一個(gè)平衡狀態(tài)。然而，隨著年齡的增加造成生理性退化，使得這種平衡被打破，骨的吸收速度大于骨的形成，從而導(dǎo)致了骨質(zhì)疏松[4]。因此，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收和促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成是治療骨質(zhì)疏松的兩種有效方法[5]。目前臨床上卻是以抗骨吸收類藥物為主，如雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等，雖然這些抗骨吸收類藥物能夠有效地防止骨骼進(jìn)一步流失，但對(duì)增加骨的形成作用卻甚微。令人遺憾的是，具有促進(jìn)骨形成作用的藥物卻只有甲狀旁腺激素(PTH-1)，而該藥物卻會(huì)增加患者患骨肉瘤發(fā)病率的風(fēng)險(xiǎn)[6]。因此，開(kāi)發(fā)出新型、高效、低毒的促骨形成類藥物對(duì)治療骨質(zhì)疏松有著重要意義。研究表明腸源性的血清素能夠抑制成骨細(xì)胞的分化、減少骨形成，而色氨酸羥化酶-1(TPH-1)是腸源性的血清素合成的限速酶，因此可以通過(guò)抑制TPH-1來(lái)調(diào)節(jié)血清素的合成能夠促進(jìn)骨形成，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的[7-9]。

五環(huán)三萜類化合物是一類在自然界中廣泛存在的天然產(chǎn)物，具有多種藥理活性如抗癌[10-11]、抗炎[12-13]、降血糖[14]等，且毒性低、不良反應(yīng)少，具有良好的臨床開(kāi)發(fā)潛力。最近研究表明五環(huán)三萜類化合物齊墩果酸(OA，圖1)也具有較好的抗骨質(zhì)疏松的活性[15-16]，因此本研究繼續(xù)探討五環(huán)三萜其他類型化合物熊果酸(UA)、18β-甘草次酸(GA)、商陸酸(EA)、3-乙酰氧基-11-羰基-β-乳香酸(AKBA)、積雪草酸(AA)、雷公藤酮(TO)、白樺酸(BA)的促骨形成活性，以期得到抗骨質(zhì)疏松活性更強(qiáng)、毒性更低的五環(huán)三萜類先導(dǎo)化合物。結(jié)果表明，測(cè)試的五環(huán)三萜類化合物對(duì)腸源血清素均有抑制作用，其中18β-甘草次酸展現(xiàn)出了最強(qiáng)的活性，并能顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。

圖1 五環(huán)三萜類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of pentacyclic triterpenes

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1試劑和細(xì)胞：五環(huán)三萜類化合物均購(gòu)自北京百靈威科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；色氨酸羥化酶-1 (TPH-1)ELISA試劑盒購(gòu)自Cusabio公司；5-羥色胺 (5-HT)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海上海生物科技有限公司；二甲基亞砜等其他試劑均為分析純；RBL-2H3細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞典藏中心，本實(shí)驗(yàn)室凍存使用。動(dòng)物：SD大鼠，體重200～250 g，雌性，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK (鄂) 2008-0004；動(dòng)物級(jí)別：SPF級(jí)。

1.1.2儀器：Agilent1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；FA1104N型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；BB16/BB5060儀器CO2培養(yǎng)箱(上海力創(chuàng)科學(xué)儀器有限公司)；超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)；CKX31型倒置顯微鏡(奧林巴斯公司)；ELx800通用酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)。

1.2 方法

1.2.1腸源性血清素合成抑制測(cè)試：首先用HPLC對(duì)血清素(5-羥色胺，5-HT)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，確定其保留時(shí)間。5-HT的抑制率通過(guò)積分所得面積比，計(jì)算公式為：抑制率(%)=100% -測(cè)試化合物峰面積/對(duì)照組峰面積。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RBL-2H3細(xì)胞株懸浮于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，鋪至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入200 μL的含有測(cè)試藥物(對(duì)照組不加藥物)的培養(yǎng)液培養(yǎng)2d后，棄去培養(yǎng)液，并用PBS洗滌，然后每孔加入100 μL 強(qiáng)裂解液RIPA裂解細(xì)胞，在加入200 μL PBS稀釋，離心后直接用HPLC測(cè)定5-HT的峰面積，并計(jì)算出藥物的對(duì)5-HT生物合成的抑制率。

1.2.2三萜類化合物對(duì)RBL-2H3細(xì)胞毒性的MTT檢測(cè)：為了進(jìn)一步確證三萜類化合物是否因其內(nèi)在毒性也影響血清素合成，接著采用MTT法測(cè)試三萜類化合物對(duì)RBL-2H3細(xì)胞的毒性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的測(cè)試細(xì)胞株懸浮于含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入100 μL的含有測(cè)試藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)2d后，每孔加入30 μL 5mg/mL MTT，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后每孔加入100 μL二甲亞砜(DMSO)溶解。使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度(OD)值。

1.2.3三萜類化合物對(duì)TPH-1蛋白量的影響：用ELISA試劑盒，繪制TPH-1蛋白量-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過(guò)測(cè)試三萜類化合物與RBL-2H3細(xì)胞相互作用后的吸光度值計(jì)算出不同濃度三萜類化合物對(duì)應(yīng)的TPH-1蛋白量，從而確定化合物對(duì)TPH-1蛋白量的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RBL-2H3細(xì)胞株懸浮于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，鋪至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入500 μL的含有測(cè)試藥物(對(duì)照組不加藥物)的培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d后，棄去培養(yǎng)液，并用PBS洗滌，然后將細(xì)胞反復(fù)的凍融，收集裂解液用ELISA試劑盒測(cè)試，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度(OD)值。

1.2.4三萜類化合物對(duì)TPH-1基因表達(dá)的影響：(1)總RNA提?。喝?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RBL-2H3細(xì)胞株懸浮于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，鋪至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞完全貼壁后，加入不同濃度測(cè)試藥物(對(duì)照組不加藥物)的培養(yǎng)液培養(yǎng)2d后棄去原培養(yǎng)液，每孔加入1 mL Trizol試劑，吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分裂解；隨后，加入0.2 mL氯仿，室溫靜置5 min后離心15 min，將上層水相移置另一個(gè)1.5 mL無(wú)RNA酶的離心管中，并加入預(yù)冷的異丙醇(0.5 mL)沉淀RNA，離心后棄上清液，加入1 mL 75%的乙醇(0.1%DEPC水現(xiàn)配現(xiàn)用)，用移液器吹打乙醇，洗滌RNA沉淀，離心后棄上清液，將離心管倒置，室溫晾10 min后加入80 μL DEPC水溶解RNA。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度值及OD260/OD280值，-80 ℃冰箱保存。(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR：首先登錄GenBank database和文獻(xiàn)查尋TPH-1基因序列[17]，并確定所用引物序列為5′-GAAGACGTGGGGAGTTGTGT-3′，5′-ACAGTGGAAA ACACGGAAGG-3′；接著以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄出第一條cDNA鏈(5PrimeScriptTMBuffer (for Real Time) 2 μL；PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5μL；Oligo dT Primer (50 μmol/L) 0.5μL；Random 6 mers (100 μmol/L) 2 μL；Total RNA 500 ng；補(bǔ)加Rnase Free dH2O水至10 μL。設(shè)定程序?yàn)?7 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min)。隨后以cDNA為模板進(jìn)行Real-Time PCR (SYBR Premix Ex TaqTMII 10 μL；PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.8 μL；PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.8 μL；ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL；DNA 模板 2 μL；ddH2O 6 μL。設(shè)定程序?yàn)?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 20 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s)。

1.2.5體內(nèi)抑制血清素的合成測(cè)試：將11w大的雌鼠分為給藥組[10 mg/(kg·d)組、20 mg/(kg·d)組、30 mg/(kg·d)組]、空白組和假手術(shù)組，每組5只。在摘除卵巢造模術(shù)后第4天開(kāi)始灌胃給藥[陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射20 mg/(kg·d)的PTH]，連續(xù)給藥35d后頸動(dòng)脈取血。將血液在37 ℃下靜置45min后得到的血清用HPLC(104.6 mm，5μm C18柱)測(cè)試其血清素的含量；小腸則在酸化后測(cè)試其血清素，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

1.2.6促進(jìn)骨細(xì)胞增殖：將20只出生2～3d的乳小鼠斷頭處死，取出其頭蓋并刮去軟組織，放入10 mL 成骨細(xì)胞消化液中(0.1% collagenase+0.2% dispase+0.01M PBS+15%FBS的α-MEM培養(yǎng)基配置而成)，37 ℃消化15 min后取上清液，并于2000 rpm離心5 min收集細(xì)胞；隨后，將收集到的細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)4d，洗去為貼壁的細(xì)胞，剩下的細(xì)胞即為成骨細(xì)胞；接著，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的測(cè)試細(xì)胞株懸浮于含15%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入100 μL的含有測(cè)試藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)2d后，每孔加入30 μL 5mg/mL MTT，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后每孔加入100 μL二甲亞砜(DMSO)溶解。使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的吸光度(OD)值。

2 結(jié)果

2.1 體外抑制血清素合成

腸源性血清素主要由TPH-1合成，因此血清素的水平變化是TPH-1活性的重要指標(biāo)。利用RBL-2H3(表達(dá)TPH-1)細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)三萜類化合物抑制血清素的能力，結(jié)果如圖2所示。

圖2 五環(huán)三萜類化合物抑制腸源性血清素的合成作用Fig.2 Inhibitory effects of pentacyclic triterpeneson on serotonin biosynthesis

圖4 GA對(duì)TPH-1蛋白量的影響。A：TPH-1含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：GA在RBL2H3細(xì)胞中對(duì)TPH-1蛋白量的影響。每組數(shù)據(jù)都是 Fig.4 Effect of GA on the protein expression. (A) Standard curve for ELISA determination of TPH-1; (B) Effects of GA on the protein expression of TPH-1 in RBL-2H3 cells. Each value was expressed as means ± SD, n=4, *P< 0.01, **P< 0.05 vs controls (Con.)

2.2 體外抑制血清素合成的抑制活性

研究發(fā)現(xiàn)這些五環(huán)三萜類化合物對(duì)血清素均有一定程度的抑制作用，考慮到這些三萜類化合物有可能是通過(guò)其內(nèi)在的毒性殺傷細(xì)胞而抑制血清素的合成，因此采用MTT法測(cè)試了這類化合物的毒性，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 五環(huán)三萜類化合物對(duì)RBL-2H3細(xì)胞的毒性 Fig.3 Cytotoxicity of pentacyclic triterpenes on RBL-2H3 cells

2.3 18β-甘草次酸(GA)對(duì)TPH-1蛋白量的影響

通過(guò)體外活性實(shí)驗(yàn)(圖2、3)表明，18β-甘草次酸(GA)能夠顯著地抑制血清素的合成，為了進(jìn)一步確證GA對(duì)TPH-1蛋白的影響，采用了ELISA試劑盒檢測(cè)了GA在RBL-2H3細(xì)胞中對(duì)TPH-1蛋白量的影響，TPH-1蛋白量-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線和GA對(duì)TPH-1蛋白量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

2.4 18β-甘草次酸(GA)對(duì)TPH-1 mRNA表達(dá)的影響

通過(guò)體外活性實(shí)驗(yàn)(圖4)表明，18β-甘草次酸(GA)能夠顯著影響RBL-2H3細(xì)胞中TPH-1蛋白量并呈劑量依賴關(guān)系。為了一步研究GA對(duì)TPH-1mRNA表達(dá)的直接影響，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量GA對(duì)TPH-1 mRNA表達(dá)影響，其結(jié)果如圖5所示。

圖5 GA對(duì)TPH-1 m RNA表達(dá)的影響，對(duì)照組加入0.1% DSMO，數(shù)據(jù)表示倍數(shù)變化。每組數(shù)據(jù)都是 vs Controls (Con.) Fig.5 Effect of GA on the mRNA expression. Control group was treated with 0.1% of DMSO, and the data were expressed as a fold change. Each value was expressed as means ± SD, n=4, *P<0.01,**P<0.05 vs controls (Con.)

2.5 18β-甘草次酸 (GA)對(duì)OVX大鼠血清和腸中血清素的影響

體外活性測(cè)試表明GA能夠抑制血清素的合成，并且沒(méi)有毒性，為了進(jìn)一步研究GA在動(dòng)物體內(nèi)是否也能夠有效地抑制血清素的合成，筆者采用了大鼠摘除卵巢(ovariectomized， OVX)的動(dòng)物模型進(jìn)行研究。灌胃給予摘除卵巢大鼠不同劑量的GA。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用HPLC測(cè)定血清和小腸的血清素水平，標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 GA抑制體內(nèi)血清素的合成。A：5-HT含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B、C分別為假手術(shù)組(Sham)與摘除卵巢大鼠血清和小腸的血清素水平。每組數(shù)據(jù)都是 Fig.6 Effect of GA on serotonin biosynthesis in vivo. A: Standard curve of 5-HT; B (serum) and C (gut) serotonin levels of Sham-operated and ovariectomized (OVX) rats. Each value was expressed as means ± SD, n=4, #P< 0.05 vs Sham;*P< 0.01, **P< 0.05 vs OVX

2.6 18β-甘草次酸(GA)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖

通過(guò)體外和體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)GA能夠顯著地抑制血清素的合成，接著采用MTT法探討GA是否能夠促成骨細(xì)胞的增殖，其結(jié)果如圖7所示。

圖7 GA促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖效果。每組數(shù)據(jù)都是Fig.7 Stimulating effect of GA on osteoblast proliferation. Each value was expressed as means ± SD, n=3,*P< 0.01, **P< 0.05 vs controls (Con.)

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，骨吸收超過(guò)骨形成所致。因此，促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性是治療骨質(zhì)疏松癥的重要方法。本研究以色氨酸羥化酶-1 (TPH-1)為靶點(diǎn)，探討了具有廣泛生物活性的天然五環(huán)三萜類化合物對(duì)TPH-1的抑制活性以及成骨細(xì)胞的活性。從圖2腸源性血清素的抑制活性結(jié)果中可以看出這些五環(huán)三萜類化合物對(duì)血清素合成均有抑制作用，抑制率為3.6%～76.5%，并呈劑量依賴關(guān)系；但是三萜類化合物之間對(duì)血清素合成抑制作用卻有較大的差異。從結(jié)構(gòu)上看，這些測(cè)試的化合物均是五環(huán)結(jié)構(gòu)，但在環(huán)上有不同的取代基，正是這些取代基團(tuán)的不同使得化合物對(duì)血清素合成展現(xiàn)出了不同程度的抑制作用；由這些基團(tuán)與活性之間的關(guān)系可以初步得出五環(huán)三萜類化合物的構(gòu)效關(guān)系。以齊墩果酸(OA)作為母體化合物，將其D環(huán)的一個(gè)甲基(-CH3)由C20位轉(zhuǎn)移到C19位(熊果酸，UA)能夠保留對(duì)血清素合成的抑制活性；進(jìn)一步在熊果酸的C環(huán)引入α,β-不飽和酮(18β-甘草次酸，GA)能夠顯著地提高其活性，在30 μM的濃度下，GA對(duì)血清素的抑制率可達(dá)到76.5%；然而，在C3位引入取代基后卻降低了活性(OA vs EA；GA vs AKBA；UA vs AA)；同時(shí)，將α,β-不飽和酮由C環(huán)轉(zhuǎn)移到A環(huán)后也降低了活性(GA vs TO)；此外，將D環(huán)修由六元環(huán)修飾成五元環(huán)也將降低活性(OA vs BA；UA vs BA)。這些結(jié)果說(shuō)明C環(huán)的α,β-不飽和酮是一個(gè)能夠抑制血清素合成的藥效團(tuán)。事實(shí)上，在五環(huán)三萜類化合物的結(jié)構(gòu)修飾中，C環(huán)的α,β-不飽和酮也能夠增強(qiáng)母體化合物的抗腫瘤、抗炎等活性；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)五環(huán)三萜類化合物對(duì)血清素的抑制活性不是來(lái)源于其對(duì)RBL-2H3細(xì)胞的毒性，而是來(lái)源于其對(duì)TPH-1的抑制活性(圖3)，并能夠明顯地抑制TPH-1蛋白含量及其mRNA表達(dá)，并呈劑量依賴性(圖4、5)。在動(dòng)物水平上，與Sham組相比，OVX組血清和小腸中血清素的水平明顯增高，而經(jīng)過(guò)GA給藥后大鼠血清和小腸中血清素的水平卻明顯降低并呈現(xiàn)出劑量依賴性，尤其是在30 μM濃度下血清(426 ng/mL)和小腸(304 ng/mL)中血清素的濃度較OVX組(含量分別為1050 ng/mL和723 ng/mL)降低了大約2.4倍。這些結(jié)果說(shuō)明GA在動(dòng)物體內(nèi)也能夠抑制血清素的合成(圖6)；隨后，在促進(jìn)成骨細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與比空白組相比，GA能夠顯著地促進(jìn)乳小鼠成骨細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性(圖7)。

綜上所述，色氨酸羥化酶-1(TPH-1)是治療骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)重要靶點(diǎn)，抑制TPH-1能夠抑制血清素合成的活性，并能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，而五環(huán)三萜類化合物能夠有效抑制TPH-1并促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖，其中18β-甘草次酸(GA)可以作為治療骨質(zhì)疏松癥的先導(dǎo)化合物進(jìn)行更深入的研究。