生酮飲食導(dǎo)致小鼠骨質(zhì)疏松的顯微骨結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)研究

吳秀華 王曉萌 黃志平 劉俊豪 黃祖成 孔剛剛 朱青安

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 510515

生酮飲食(ketogenic diet，KD)是一種高脂肪、低碳水化合物的配方飲食，使機(jī)體產(chǎn)生酮體代謝，提高血液中β羥丁酸水平。生酮飲食時(shí)酮體成為主要的能量來源[1]，相對(duì)于糖代謝而言，酮體進(jìn)入三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)生能量速度較快[2]，消耗同等量氧氣時(shí)，酮體產(chǎn)生的能量更多。1921年Wilder提出KD治療兒童癲癇[3-4]，目前在臨床上是兒童耐藥性癲癇的治療手段之一，也用于治療急性和退變性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。雖然國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道KD總體上是安全和有效[5]，但其不良反應(yīng)和對(duì)生長發(fā)育的影響也受到關(guān)注[6]。例如，有多個(gè)KD治療耐藥性癲癇不良反應(yīng)的報(bào)道，出現(xiàn)腎結(jié)石、缺鐵性貧血、繼發(fā)性肉堿缺乏、心肌病、骨密度降低等[7]。盡管觀察到生酮飲食用于治療兒童耐用性癲癇時(shí)會(huì)引起骨質(zhì)疏松，但還缺少相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究。本文采用生酮飲食喂養(yǎng)成年C57雌性小鼠3個(gè)月，分析股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨和中段皮質(zhì)骨的顯微結(jié)構(gòu)，以及測量脛骨三點(diǎn)彎曲的力學(xué)性能，評(píng)價(jià)生酮飲食導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，為臨床上觀察生酮飲食對(duì)骨代謝的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與分組

10只8周齡雌性C57小鼠由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，體重16～18 g，隨機(jī)分為生酮飲食和正常飲食(SD)組，每組5只，喂養(yǎng)3個(gè)月。KD組給予“奇酮奶”喂養(yǎng)，SD組每天給予普通飼料喂養(yǎng)。每兩周通過剪尾法取血，測定血糖、血酮、體重。

SD組由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的普通飼料喂養(yǎng)。KD組喂養(yǎng)由深圳捷利康公司生產(chǎn)的“奇酮奶”，其碳水化合物與脂肪的比例為1:4。“奇酮奶”已用于臨床上治療兒童耐藥性癲癇，其基本營養(yǎng)素含量詳見表1。喂養(yǎng)3個(gè)月后的小鼠在過量麻醉下處死。取小鼠雙側(cè)股骨和脛骨，股骨置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h，而脛骨新鮮地冷凍于-80 ℃冰箱中。

表1 普通飼料與生酮飲食成分Table 1 Components of normal and KD diets

1.2 骨微結(jié)構(gòu)分析

對(duì)所有小鼠的右側(cè)股骨行顯微CT分析。右側(cè)股骨垂直放入顯微CT標(biāo)本杯中，并用圓形泡沫柱穩(wěn)妥固定，行顯微CT(μ80，Scanco公司，瑞士)掃描。預(yù)掃完畢后分別選擇股骨遠(yuǎn)端1/3的部位和股骨中段180層作為感興趣區(qū)域，進(jìn)行批量掃描。掃描參數(shù)設(shè)置為電壓55 kv，電流145 μA，層厚為12 μm。掃描完成后，從圖層中沒有股骨髁的層數(shù)開始選取100層，采用顯微CT自帶軟件進(jìn)行松質(zhì)骨顯微結(jié)構(gòu)分析，測量骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目 (Tb.N)、骨小梁間隙(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、各向異性程度(DA)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)、骨小梁連接密度(Conn.D.)等。測量股骨中段的100層皮質(zhì)骨的厚度(Ct.Th)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、皮質(zhì)骨骨密度(BMDBV)、皮質(zhì)骨橫截面面積(Barea)。

1.3 脛骨三點(diǎn)彎曲測試

右側(cè)脛骨標(biāo)本在室溫下解3 h后，采用電磁伺服材料試驗(yàn)機(jī)(E1000，Instron公司，美國)對(duì)其進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)。具體方法如下：采用游標(biāo)卡尺測量脛骨長度，以確定脛骨的中點(diǎn)；將脛骨放置于自制的三點(diǎn)彎曲支架上，支架的跨距為10 mm，兩端支架到脛骨中點(diǎn)的距離為5 mm，以1 mm/min的速度在脛骨中點(diǎn)向下橫向壓縮至破壞。連續(xù)記錄載荷和位移，從載荷-位移曲線中得到最大載荷、剛度、最大吸收能量。

1.4 股骨組織學(xué)

取左側(cè)股骨清水沖洗后用EDTA脫鈣4 w，針刺無阻力感后開始脫水，浸蠟，石蠟包埋。行縱向切片，厚度為4 μm。行HE染色，觀察股骨遠(yuǎn)端骨小梁分布。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的體重、血糖、血酮情況

KD組小鼠在2 w、4 w、6 w、8 w、10 w和12 w的體重分別為(18.3±1.3)g、(18.3±1.2)g、(21.3±1.2)g、(20.0±1.4)g、(21.3±1.2)g和(22.3±1.2)g，而SD組在各時(shí)間點(diǎn)的體重分別為(19.5±1.3)g、(19.8±0.5)g、(20.5±0.5)g、(22.5±0.5)g、(23.5±1.5)g和(23.5±0.5)g，兩組間體重在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KD組在4 w、6 w、8 w、10 w和12 w的血糖水平分別為(13.6±2.1)mmol/L、(9.7±1.5)mmol/L、(14.5±1.9)mmol/L、(14.5±2.2)mmol/L和(11.5±1.8)mmol/L，SD組在各時(shí)間點(diǎn)分別為(8.6±1.2)mmol/L、(9.5±0.9)mmol/L、(12.1±1.6)mmol/L、(12.3±1.8)mmol/L和(12.5±2.1)mmol/L，兩組間血糖水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KD組在2 w、4 w、6 w、8 w、10 w和12 w的酮體水平分別為(1.2±0.3)mmol/L、(0.9±0.2)mmol/L、(1.0±0.3)mmol/L、(0.8±0.1)mmol/L、 (0.9±0.2)mmol/L和(0.9±0.2)mmol/L，而SD組各時(shí)間點(diǎn)分別為(0.1±0.1)mmol/L、(0.1±0.1)mmol/L、(0.1±0.1) mmol/L、(0.5±0.2)mmol/L、(0.2±0.1)mmol/L和(0.2±0.1)mmol/L，兩組間血酮水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 生酮飲食和正常飲食小鼠的體重、血糖、血酮水平Fig.1 Weight, blood glucose and blood ketone of mice in the SD and KD groups

2.2 股骨微結(jié)構(gòu)

KD組股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、連接密度均低于SD組，且骨小梁間隙變大，兩組間骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、連接密度等的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2和圖2、3)。

兩組間股骨中段皮質(zhì)骨骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)或皮質(zhì)骨厚度的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)，而KD組皮質(zhì)骨平均橫截面積顯著小于SD組(P<0.05)(圖2)。

表2 生酮飲食和正常飲食小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨和中段皮質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 2 Structural parameters of cancellous bone at distal femur and cortical bone at middle femur in mice under the two diets

注：表內(nèi)數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。每組小鼠數(shù)量為5只。*表示與SD組比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 生酮飲食和正常飲食小鼠股骨遠(yuǎn)端顯微CT重建和橫斷面圖像Fig.2 Micro-CT images of cancellous bone at distal femur in the two diet groups

圖3 生酮飲食和正常飲食小鼠股骨中段皮質(zhì)骨顯微CT圖Fig.3 Micro-CT images of cortical bone at middle femur in the KD and SD diet groups

2.3 脛骨三點(diǎn)彎曲

與SD組相比較，KD組脛骨三點(diǎn)彎曲的最大力、最大橈度、剛度、最大吸收能量均有下降趨勢(表3)。兩組間最大力、剛度和最大吸收能量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 小鼠脛骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)的力學(xué)參數(shù)Table 3 Mechanical parameters of the three-point bending test of tibia in mice

注：表內(nèi)數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。每組小鼠數(shù)量為5只。*P<0.05。

2.4 股骨組織學(xué)

HE染色的組織學(xué)圖片也表明KD組股骨遠(yuǎn)端骨小梁稀疏、數(shù)量減少，骨小梁間隙增大(圖4)。

圖4 生酮飲食和正常飲食小鼠股骨遠(yuǎn)端HE染色的組織學(xué)圖像Fig.4 Histological images of distal femur by HE staining in KD and SD diet groups

3 討論

已證實(shí)生酮飲食在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)于兒童耐藥性癲癇有治療作用，本文進(jìn)一步研究其對(duì)骨代謝的影響。本研究發(fā)現(xiàn)生酮飲食弱化了小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致松質(zhì)骨骨質(zhì)疏松。本研究還發(fā)現(xiàn)生酮飲食盡管對(duì)皮質(zhì)骨的微結(jié)構(gòu)沒有影響，但減少了其幾何尺寸，導(dǎo)致皮質(zhì)骨骨質(zhì)疏松。從生物力學(xué)和組織學(xué)上證實(shí)了生酮飲食導(dǎo)致的骨結(jié)構(gòu)的弱化和生物力學(xué)強(qiáng)度的降低。

生酮飲食是一種特殊的高脂飲食，其極低的碳水化合物含量使得機(jī)體從糖代謝轉(zhuǎn)為酮體代謝[8]。酮體代謝很容易受到破壞，少許的碳水化合物就可以使體內(nèi)的酮體水平大幅度降低，且需要較長時(shí)間才能恢復(fù)。所以，生酮飲食有別于一般的高脂飲食，它導(dǎo)致了機(jī)體代謝的轉(zhuǎn)變，維持血糖水平正常，但高血酮水平[9]。多個(gè)研究證實(shí)高脂飲食弱化C57小鼠股骨松質(zhì)骨骨結(jié)構(gòu)[10-12]，導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松與去勢骨質(zhì)疏松相似，但股骨中段皮質(zhì)骨未發(fā)生明顯變化[13]。本文發(fā)現(xiàn)生酮飲食不僅弱化小鼠松質(zhì)骨骨結(jié)構(gòu)，而且減少了皮質(zhì)骨橫截面積，弱化了生物力學(xué)性能。這可能是在酮體代謝下特有的現(xiàn)象，值得進(jìn)一步的研究。因此，生酮飲食導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松可能不同于高脂飲食所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，這也為皮質(zhì)骨的骨質(zhì)疏松造模提供了一種方法。

本文在研究中觀察到生酮飲食6w的小鼠股骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨均未發(fā)生明顯變化，說明短期的生酮飲食對(duì)骨代謝的影響不大。這提示在臨床上使用生酮飲食作為治療癲癇的手段時(shí)，要注意其對(duì)骨代謝所產(chǎn)生的不利影響。

有報(bào)道發(fā)現(xiàn)更高酮體水平對(duì)急性脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)作用更為明顯[14]。本文采用的生酮飼料是臨床上用于治療兒童耐藥性癲癇的食品之一，其蛋白質(zhì)和碳水化合物與脂肪比例為1∶4，可使小鼠的血酮水平達(dá)到1.0 mmol/L。今后還需要研究更高比例的生酮飲食對(duì)骨代謝的影響，確定骨代謝對(duì)酮體水平的依賴性。

總之，本文證實(shí)了生酮飲食對(duì)小鼠骨代謝的影響，不僅導(dǎo)致松質(zhì)骨的骨質(zhì)疏松，還導(dǎo)致皮質(zhì)骨的弱化，提示需要進(jìn)一步探討生酮飲食引起骨質(zhì)疏松的機(jī)理，觀察生酮飲食對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的抑制或增殖作用，研究其作用的分子機(jī)制。