跑臺運動對阿霉素聯(lián)合醋酸戈舍瑞林誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度和骨代謝的影響

蘇紅燕 馬濤

1. 山東體育學(xué)院, 山東 濟南 250102 2. 齊魯師范學(xué)院，山東 濟南 250200

多柔比星[商品名：阿霉素(doxorubicin，DOX)]是一種被用作有效治療各種癌癥的蒽環(huán)類抗生素。雖然應(yīng)用DOX治療癌癥會產(chǎn)生眾多的副作用和不良反應(yīng)，但臨床上最引起人們關(guān)注的是DOX可造成卵巢的損害，從而導(dǎo)致不育，并且這種損害是不可逆的[1,2]。如果在癌癥患者DOX給藥之前，先給予患者促性腺激素釋放激素(gonadtropin releasing hormone，GnRH)類似物醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate，GA)等藥物，則可以最大限度地降低DOX引起的卵巢損害。GA通過抑制卵巢功能，并進而降低卵巢對DOX引起的傷害的易感性[3,4]。 終止DOX治療后，GA給藥也應(yīng)當(dāng)及時終止，之后卵巢功能即可恢復(fù)到正常狀態(tài)[5]。

對于接受GA或者DOX治療的患者來說，一個重要的威脅是GA和DOX均可導(dǎo)致骨質(zhì)流失，并進而造成骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。既然單獨使用GA或DOX均可對骨代謝產(chǎn)生不良的影響[6,7]，那么聯(lián)合使用GA和DOX是否有可能比單獨使用GA或DOX對骨代謝產(chǎn)生更大的負面影響呢？然而，到目前為止，沒有查到關(guān)于GA和DOX聯(lián)合作用對骨代謝影響的報道，因此，本研究的目的之一在于研究GA和DOX聯(lián)合作用對骨代謝的影響是否顯著大于GA或DOX單獨作用對骨代謝的影響，本研究的目的之二在于研究跑臺運動對DOX聯(lián)合GA誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)流失的防治效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

8周齡雌性SD大鼠64只，體重218.07±9.26 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2007-0005]。在標(biāo)準(zhǔn)的實驗室環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為22±1 ℃，光照遵循12 h:12 h明暗周期，每日提供足夠食物，自由飲水。動物購回適應(yīng)本實驗室環(huán)境和飲食1周后，被隨機分為8組，每組8只：安靜對照組(SED)、DOX干預(yù)組(SED+DOX)、GA干預(yù)組(SED+GA)、DOX和GA聯(lián)合干預(yù)組(SED+DOX+GA)、跑臺運動對照組(EX)、跑臺運動結(jié)合DOX干預(yù)組(EX+DOX)、跑臺運動結(jié)合GA干預(yù)組(EX+GA)、跑臺運動結(jié)合DOX和GA聯(lián)合干預(yù)組(EX+DOX+GA)。

1.2 藥物干預(yù)方案

GA的給藥方式為在跑臺訓(xùn)練第1天和第29天分別給大鼠頸背部皮下注射諾雷得(GA緩釋植入劑，英國阿斯利康制藥公司)1支(3.6 mg/支)，因為據(jù)Furr報道[8]一次性注射3.6 mg的諾雷得可以維持大鼠雌激素分泌降低持續(xù)28 d左右，其余組別大鼠同一日頸背部皮下注射等量的可生物降解的硅膠作為對照。DOX的給藥方式[9]為在跑臺訓(xùn)練第15天開始，每天給予大鼠腹腔注射1.5 mg/kg體重的2 mg / mL的鹽酸阿霉素(上海生工)，共連續(xù)注射10 d，其余組別大鼠同時間周期內(nèi)每日注射等量的生理鹽水作為對照。

1.3 運動方案

對于EX組、EX +DOX組、EX +GA組以及EX +DOX+GA組大鼠，在分組后的第二天開始進行為期8周的跑臺訓(xùn)練，每周訓(xùn)練6 d，每天訓(xùn)練30 min，跑速為30 m/min。

1.4 取材

8周的運動和藥物干預(yù)后，于跑臺訓(xùn)練組大鼠最后一次訓(xùn)練結(jié)束后24 h，斷頸椎處死所有大鼠，在斷頸椎后迅速心臟取血[10]，3 000 r/min 4 ℃離心20 min，分離血清，-20 ℃ 冰箱內(nèi)保存待測血鈣(Ca2+)、血清堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP5b)等血清骨代謝指標(biāo)。分離大鼠左側(cè)股骨，用浸透生理鹽水的紗布包好，于-20 ℃ 冰箱內(nèi)保存待測BMD。

1.5 測試方法

鄰甲酚酞絡(luò)合酮終點比色法(南京建成試劑盒)測定血鈣(Ca2+)，MODULAR 全自動生化分析儀(日本)(美國Roche公司試劑盒)測定血清堿性磷酸酶(ALP)；骨鈣素(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP5b)的測定采用酶免法(美國ADL 公司試劑盒，美國MUL2TISCAN MK3酶標(biāo)儀)。

股骨骨密度的測定采用pDEXA 型雙能X 線骨密度儀(美國Norland 公司)測定，將股骨從-20 ℃冰箱取出，室溫自然解凍12 h，雙能X 線骨密度儀掃描整個股骨，測定其骨密度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

各檢測結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS11.0軟件對組間差異進行方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，以P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨骨密度

由圖1可知，首先，DOX與GA的單獨或聯(lián)合給藥均顯著降低了各組大鼠的骨密度，即SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA組大鼠股骨骨密度均顯著低于其對應(yīng)的非藥物干預(yù)組SED組(P< 0. 01)；同樣，EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組大鼠股骨骨密度均顯著低于其對應(yīng)的非藥物干預(yù)組EX組(P< 0. 01)。其次，DOX和GA聯(lián)合干預(yù)對于大鼠骨質(zhì)疏松的影響顯著大于DOX或GA單獨給藥的影響，即SED+DOX+GA大鼠股骨骨密度顯著低于SED+DOX組和SED+GA組(P< 0. 01)；同樣，EX+DOX+GA組大鼠股骨骨密度顯著低于EX+DOX組和EX+GA組(P< 0. 01)。再次，跑臺運動顯著降低了DOX與GA的單獨或聯(lián)合給藥造成的骨質(zhì)流失，即EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組股骨骨密度均顯著高于其對應(yīng)的安靜組SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA組(P< 0. 05或P < 0. 01)。

圖1 各組大鼠股骨骨密度比較注：藥物干預(yù)組與其對應(yīng)的非藥物干預(yù)對照組相比較，@@P<0. 01；藥物聯(lián)合干預(yù)組與其對應(yīng)的藥物單獨干預(yù)組相比較，**P<0. 01；跑臺運動組與其對應(yīng)的安靜組相比較，#P<0. 05或##P<0. 01Fig.1 Comparison of BMD of the femur between each group

2.2 各組大鼠骨代謝指標(biāo)

由表1可知，首先，DOX與GA的單獨或聯(lián)合給藥均使大鼠的骨形成指標(biāo)ALP和BGP水平顯著降低而骨吸收指標(biāo)Ca2+和TRACP5b水平顯著升高，即SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA大鼠的血清骨形成指標(biāo)ALP和BGP水平顯著低于其相對應(yīng)的非藥物干預(yù)組SED組(P<0. 01)，而SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA大鼠的血清骨吸收指標(biāo)Ca2+和TRACP5b水平顯著高于其相對應(yīng)的非藥物干預(yù)組SED組(P<0. 01)；同樣， EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組大鼠血清骨形成指標(biāo)ALP和BGP水平顯著低于其相對應(yīng)的非藥物干預(yù)組EX組(P<0. 05或P<0. 01)，而EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組大鼠血清骨吸收指標(biāo)Ca2+和TRACP5b水平顯著高于其相對應(yīng)的非藥物干預(yù)組EX組(P<0. 01)。其次，DOX和GA聯(lián)合干預(yù)對于大鼠骨代謝指標(biāo)的影響顯著大于DOX或GA單獨給藥的影響，即SED+DOX+GA組大鼠血清骨形成指標(biāo)ALP和BGP水平顯著低于SED+DOX組和SED+GA組(P<0. 01)，而SED+DOX+GA組大鼠血清骨吸收指標(biāo)Ca2+和TRACP5b水平顯著高于SED+DOX組和SED+GA組(P<0. 01)；同樣， EX+DOX+GA組大鼠血清骨形成指標(biāo)ALP和BGP水平顯著低于EX+DOX組和EX+GA組(P<0.01)，而EX+DOX+GA組大鼠血清骨吸收指標(biāo)Ca2+和TRACP5b水平顯著高于EX+DOX組和EX+GA組(P<0.01)。再次，跑臺運動顯著降低了DOX與GA單獨或聯(lián)合給藥對大鼠骨代謝造成的影響，即EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組大鼠血清骨形成指標(biāo)ALP和BGP水平顯著高于其相對應(yīng)的安靜組SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA組(P<0. 05或P<0. 01)，而EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組大鼠血清骨吸收指標(biāo)Ca2+和TRACP5b水平顯著低于其相對應(yīng)的安靜組SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA組(P<0. 05或P<0. 01)。

3 討論

3.1 阿霉素與醋酸戈舍瑞林聯(lián)合作用對大鼠骨密度和骨代謝的影響

DOX是臨床上廣泛應(yīng)用的治療腫瘤的藥物之一，通過嵌入DNA，抑制拓撲異構(gòu)酶II和解旋酶的作用，產(chǎn)生活性氧而有效抑制各種惡性細胞的生長和增殖[11]。但是，DOX也是已知的可使骨量減少的藥物之一，DOX給藥可以顯著降低骨礦含量和骨密度[12]。本研究的結(jié)果也進一步證實，與其相對應(yīng)的非藥物干預(yù)組SED組和EX組相比，SED+DOX組和EX+DOX組大鼠骨密度顯著降低、血清骨形成指標(biāo)ALP和BGP水平顯著降低而骨吸收指標(biāo)Ca2+和TRACP5b水平顯著升高，這說明DOX可造成大鼠骨形成作用減弱而骨吸收作用增強，加速骨質(zhì)的流失，并最終導(dǎo)致骨密度的下降。DOX毒性眾所周知的機制是其與線粒體相互作用導(dǎo)致的活性氧的增加，從而造成細胞的損傷，所以DOX與骨細胞線粒體相互作用產(chǎn)生的自由基對骨細胞造成傷害，這極有可能是DOX造成骨質(zhì)疏松的重要原因之一。此外，DOX可通過對于卵巢的損傷，減少雌激素的分泌，并進而對骨代謝造成不良影響，這也是DOX造成骨代謝失平衡的原因之一[13]。

表1 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)的比較Table 1 Comparison of serum bone metabolic markers between each

注：藥物干預(yù)組與其對應(yīng)的非藥物干預(yù)對照組相比較，@P<0.05或@@P<0.01)；藥物聯(lián)合干預(yù)組與其對應(yīng)的藥物單獨干預(yù)組相比較，**P<0. 01；跑臺運動組與其對應(yīng)的安靜組相比較，#P<0. 05或##P<0. 01

在應(yīng)用DOX治療各種癌癥時，DOX對于患者卵巢的損傷也是目前臨床上所面臨的一個主要問題。研究顯示，在應(yīng)用DOX治療各種癌癥時，DOX則會首先蓄積在位于卵巢中心的基質(zhì)細胞，隨后逐漸向卵巢周邊區(qū)域積累，并最終導(dǎo)致卵巢細胞的凋亡[14]。在癌癥患者的臨床治療中，為了抑制卵巢的功能從而避免DOX對于卵巢的損害，在DOX給藥之前和給藥期間，經(jīng)常采用聯(lián)合GA給藥的措施。

然而，GA在抑制卵巢功能的同時也大大降低了雌激素的分泌，鑒于雌激素對于骨代謝的重要作用，GA的給藥將有可能進一步加重DOX對骨代謝造成的不利影響。研究顯示，接受GA治療的患者雌激素水平則會下降到絕經(jīng)后水平[15]，而雌激素水平的迅速下降對于骨代謝的負面影響已是眾所周知，絕經(jīng)后婦女由于雌激素的迅速下降而易患骨質(zhì)疏松癥已是不爭的事實[16]。Hydock等[17]的研究表明，8周的GA給藥可以顯著降低雌性大鼠脛骨近端松質(zhì)骨的骨量。本研究的結(jié)果也顯示，與其相對應(yīng)的非藥物干預(yù)組SED組合EX組相比，SED+GA組和EX+GA組大鼠骨密度顯著降低、血清骨形成指標(biāo)ALP和BGP水平顯著降低而骨吸收指標(biāo)Ca2+和TRACP5b水平顯著升高，進一步證實了GA通過破壞大鼠骨代謝的動態(tài)平衡，造成大鼠骨質(zhì)的流失。

關(guān)于GA和DOX聯(lián)合用藥對骨代謝影響的研究目前在國內(nèi)外尚未見報道，本研究顯示，聯(lián)合GA和DOX給藥比單獨的GA或DOX給藥可造成更嚴(yán)重的骨量丟失。與SED+DOX組和SED+GA組相比，SED+DOX+GA組大鼠骨密度顯著降低、血清骨形成指標(biāo)ALP和BGP水平顯著降低而骨吸收指標(biāo)Ca2+和TRACP5b水平顯著升高，同樣與EX+DOX組和EX+GA組相比，EX+DOX+GA組大鼠骨密度顯著降低、血清骨形成指標(biāo)ALP和BGP水平顯著降低而骨吸收指標(biāo)Ca2+和TRACP5b水平顯著升高。這說明，臨床上在應(yīng)用DOX治療各種癌癥時，經(jīng)常采用聯(lián)合GA的給藥，雖然可以顯著降低DOX對于卵巢的損傷，但同時也加重了DOX對于骨組織的損傷。這兩種藥物對骨代謝的累加效應(yīng)，可能是通過其對成骨細胞和破骨細胞的作用實現(xiàn)的。研究顯示，不僅雌激素能夠調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的生成和細胞凋亡[18,19]，而且DOX也可以以劑量依賴性的降低成骨細胞活性[20]和增加破骨細胞的活性[21]。而GA對骨代謝造成影響的原因可能主要是由于其導(dǎo)致的雌激素分泌減少與DOX共同作用于成骨細胞和破骨細胞，干擾正常的骨轉(zhuǎn)換過程，從而導(dǎo)致骨質(zhì)的加速流失，這將是臨床上接受GA聯(lián)合DOX治療方案的癌癥患者和醫(yī)學(xué)工作者們所面臨的一個重要的問題。

3.2 跑臺運動對阿霉素聯(lián)合醋酸戈舍瑞林誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度和骨代謝的影響

DOX和GA單獨或聯(lián)合用藥導(dǎo)致的骨質(zhì)流失的問題已經(jīng)成為困擾臨床上乳腺癌等癌癥患者接受治療的重要問題之一[22]，而減少這種骨質(zhì)流失的干預(yù)方法也已經(jīng)引起了科研人員的廣泛關(guān)注[23]。近年來，人們也一直在研究關(guān)于癌癥治療相關(guān)的骨量丟失的干預(yù)措施，包括使用雙膦酸鹽，維生素D和鈣補劑等[24]。此外，運動能夠?qū)谴x產(chǎn)生積極的影響，運動時肌肉的收縮以及運動時來自地面的反作用力，都能夠?qū)墙M織產(chǎn)生相應(yīng)的力學(xué)刺激，從而有利于骨量的積累[25]。運動也是近年來已被提出的作為保護由癌癥治療引起的骨量丟失的干預(yù)措施之一[26]。

研究顯示，單純的使用運動干預(yù)并不足以抵消雌激素缺乏所造成的骨損傷[27]，因此，運動聯(lián)合應(yīng)用其它的骨保護干預(yù)措施來減少GA誘導(dǎo)的骨量丟失應(yīng)該是必要的，例如運動聯(lián)合雙膦酸鹽[28]和維生素D3[29]的補充等。有研究顯示，自愿轉(zhuǎn)輪運動對GA誘導(dǎo)的雌性大鼠脛骨松質(zhì)骨骨質(zhì)疏松幾乎沒有保護作用，并且作者推測自愿轉(zhuǎn)輪運動缺乏對骨組織的保護作用是因為其零星的運動時間以及這種運動方式對骨組織產(chǎn)生的機械應(yīng)力較小[30]。此外，也有研究表明，自愿轉(zhuǎn)輪運動對DOX誘導(dǎo)的生長期大鼠的骨質(zhì)流失也同樣沒有保護作用[31]。鑒于以上兩項研究結(jié)果，我們有必要研究其他能夠控制運動強度和時間，而且能夠?qū)墙M織產(chǎn)生較強機械刺激的運動方式對于GA和DOX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的保護效果。已經(jīng)有研究提出具有較強力學(xué)刺激的運動方式可作為減少這種骨質(zhì)流失的重要方法之一[32,33]。本研究結(jié)果顯示，跑臺運動可以顯著降低DOX與GA的單獨或聯(lián)合給藥對大鼠骨密度和骨代謝造成的負面影響，與其相對應(yīng)的安靜組SED+DOX組、SED+GA組和SED+DOX+GA組相比，EX+DOX組、EX+GA組和EX+DOX+GA組大鼠骨密度顯著升高、血清骨形成指標(biāo)ALP和BGP水平顯著升高而骨吸收指標(biāo)Ca2+和TRACP5b水平顯著降低，證明了跑臺運動對于DOX聯(lián)合GA誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松具有較好的防治效果。

在以往的臨床研究中，盡管運動已被證明是一種減少化療引起的骨量丟失的有效方法[34,35]，但以往的臨床研究中患者接受的抗癌藥物有些是含有DOX和GA的，有些則不含DOX和GA，雖然接受化療的癌癥患者仍然比健康對照組患骨質(zhì)疏松癥的幾率顯著提高[34]，但也很難就此推測癌癥患者的骨量丟失是否是由于抗癌藥物DOX和GA引起的。此外，由于癌癥患者患病后體力較差，會出現(xiàn)患病后長期靜臥缺乏運動的生活方式，即其骨質(zhì)疏松癥也有可能是由于患病后長期靜臥缺乏運動導(dǎo)致的，或者可能是抗癌藥物和缺乏運動共同作用的結(jié)果，故臨床的統(tǒng)計數(shù)據(jù)很難避開這些因素的干擾。在本研究中，選取健康大鼠作為研究對象，在其藥物干預(yù)期間，各組大鼠在飼養(yǎng)籠中的日?；顒恿繋缀鯖]有差別，這就避免了臨床上癌癥患者久臥少運動的生活狀態(tài)對于骨代謝的負面影響，DOX和GA藥物干預(yù)組與非藥物干預(yù)組大鼠骨密度及骨代謝的差異就可以認(rèn)為是單純的藥物作用的效果。同樣，在本研究中，跑臺運動對于DOX和GA誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的防治效果也避開了臨床上癌癥病人久臥少運動的生活狀態(tài)對于實驗數(shù)據(jù)的干擾。

4 結(jié)論

1．DOX和GA單獨或聯(lián)合作用均可造成大鼠骨代謝的失平衡和骨密度的下降，導(dǎo)致大鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

2．DOX和GA聯(lián)合作用誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松的程度顯著大于DOX或GA單獨作用的結(jié)果。

3．跑臺運動可以有效降低DOX和GA單獨或聯(lián)合作用誘導(dǎo)的骨密度下降和骨代謝失平衡，降低大鼠骨質(zhì)疏松的程度。