基于適配體-表面等離子共振的生物傳感技術(shù)及應(yīng)用

杜 斌， 童朝陽*， 劉志偉， 穆晞惠， 丁志軍， 曹 韡

(1. 國民核生化災(zāi)害防護國家重點實驗室， 北京 102205； 2. 防化研究院， 北京 102205)

基于適配體-表面等離子共振的生物傳感技術(shù)及應(yīng)用

杜 斌1， 童朝陽1*， 劉志偉1， 穆晞惠1， 丁志軍2， 曹 韡2

(1. 國民核生化災(zāi)害防護國家重點實驗室， 北京 102205； 2. 防化研究院， 北京 102205)

適配體以其合成、修飾、固定等方面的優(yōu)勢，在生物分子識別領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用?；诒砻娴入x子共振的傳感技術(shù)具有非標(biāo)記、無需前處理、實時監(jiān)測等優(yōu)點。適配體與表面等離子共振相結(jié)合研制的生物傳感器在生物傳感領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，本文綜述了基于適配體-表面等離子共振的生物傳感技術(shù)及應(yīng)用。

適配體； 表面等離子共振； 生物傳感； 檢測； 應(yīng)用

1 引 言

表面等離子共振(Surface plasmon resonance，SPR)是一種光學(xué)現(xiàn)象，當(dāng)金屬表面的物質(zhì)或者物質(zhì)的量發(fā)生變化時，其折射率發(fā)生相應(yīng)的變化。SPR光譜的共振角對與金屬相接觸的介質(zhì)折射率的微小變化極其敏感。SPR生物傳感技術(shù)是用于生物檢測的前沿性技術(shù)，具有非標(biāo)記、實時在線監(jiān)測、可再生等優(yōu)點[1]。近年來對SPR傳感芯片的改性受到了廣泛關(guān)注，已有許多課題組對此進行了深入研究，對傳感芯片進行修飾并將不同的生物識別基團與傳感器芯片偶聯(lián)。這些生物識別基團包括蛋白[2]、分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer，MIP)[3-6]、抗體(Antibody)[7-9]等。這些識別基團分子量和空間位阻較大，制備復(fù)雜，穩(wěn)定性易受溫度、酸堿度、電解質(zhì)等因素的影響導(dǎo)致靈敏度難以進一步提高，使其應(yīng)用受到了一定限制。

適配體(Aptamer)是通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選而來的，是一類能以較高親和力與各類靶分子特異性地結(jié)合的單鏈寡核苷酸(DNA、RNA、修飾RNA)[10-11]。與傳統(tǒng)的抗體相比，適配體具有易合成、易修飾、易固定、可反復(fù)使用和長期保存的優(yōu)點，在生物檢測方面有廣泛的應(yīng)用[12-17]。利用適配體的這些特性將其修飾至SPR基底上，進而用于生物分析檢測可以獲得更好的靈敏度和特異性。因此，適配體與SPR技術(shù)相結(jié)合，在生物檢測領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。本文綜述了近年來基于適配體-SPR的生物傳感技術(shù)應(yīng)用及研究進展。

2 適配體-SPR傳感器的構(gòu)建及檢測模式

2.1 傳感器的構(gòu)建

基于適配體-SPR的生物傳感器通常由適配體識別基團和SPR檢測平臺組成。其中，適配體由SELEX篩選得到，SPR檢測平臺的傳感芯片的基底上通常鍍有金膜[18]。適配體通常固定于SPR傳感芯片的基底上，當(dāng)目標(biāo)物流經(jīng)傳感芯片時，連接在SPR基質(zhì)上的適配體對目標(biāo)物特異性識別導(dǎo)致共振條件發(fā)生變化以改變SPR的輸出信號，從而對目標(biāo)物進行分析檢測，而連接在起放大效應(yīng)物質(zhì)上的適配體則與目標(biāo)物相互作用以放大SPR信號輸出。

2.2 適配體在SPR傳感芯片上固定方法

常用的SPR傳感芯片大多以金為基底，另一類則是在金膜表面覆蓋葡聚糖層(最常用的為羧甲基葡聚糖)。針對金膜傳感芯片，適配體固體方法主要有金硫鍵自組裝[19]與生物素-親和素法，覆蓋有葡聚糖層的芯片則適用于偶聯(lián)帶有氨基、巰基、醛基、羥基或羧基的分子?？筛鶕?jù)不同的結(jié)構(gòu)和需求選擇不同的固定方式將適配體偶聯(lián)在相應(yīng)的傳感芯片上。

金硫鍵自組裝是將末端(3′或5′)標(biāo)記有巰基的適配體在金硫鍵成鍵驅(qū)動作用力下有序吸附在傳感器金膜表面形成單層膜。該方法簡單易操作，且適配體易于末端巰基修飾，因此可以很好地固定于傳感膜芯片上，由該方法制備的傳感芯片穩(wěn)定性好、覆蓋度高、排列有序，應(yīng)用廣泛。Bianco等[20]將巰基修飾的適配體以自組裝單層膜(Self-assembled monolayers，SAM)形式固定在金膜表面用來檢測赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)，實驗結(jié)果表明SAM結(jié)構(gòu)對OTA的檢出限為0.005 ng/mL。

圖1 使用硫醇化適配體緊密自組裝單層膜(SAM)的功能化過程[20]

Fig.1 Scheme of the functionalization process with the thiolated aptamer compact self-assembled monolayers[20]

生物素-親和素法：親和素能夠特異性非共價結(jié)合生物素，它們之間的親和作用十分穩(wěn)定，生物素修飾的適配體可以很好地結(jié)合在親和素覆蓋的芯片上。生物素-親和素法是一種具有高親和力、靈敏度高、特異性強和穩(wěn)定性好等優(yōu)點的信號放大標(biāo)記技術(shù)，因而該方法廣泛應(yīng)用于傳感器表面的修飾。Loo等[21]將5′生物素修飾的適配體通過生物素-親和素法連接至親和素修飾的SPR金膜表面，該系統(tǒng)被用于細胞色素C的檢測，其檢測范圍為80 pmol/L～80 nmol/L，檢出限≥50 pmol/L。

圖2 羧基活化的金芯片用于親和素涂層；細胞色素C的適體通過DNA 5′末端的生物素-親和素相互作用固定在金表面上[21]。

Fig.2 Gold chip was activated with carboxyl group for avidin coating. The cyto-c specific aptamers are then immobilized on the gold surface at the DNA 5′-endviathe biotin-avidin interactions[21].

適配體在表面覆蓋有葡聚糖層的金膜傳感芯片上固定時主要采用化學(xué)鍵共價結(jié)合的方法。但由于葡聚糖層并不像金膜層那樣平整，適配體的表面分布可能受葡聚糖層的影響，且部分適配體會被掩埋在由葡聚糖改性產(chǎn)生的小孔內(nèi)，影響其構(gòu)象改變。因此，基于適配體-SPR的傳感技術(shù)較少選用金膜表面覆蓋有葡聚糖層的傳感芯片。Wang等[22]將氨基修飾的蓖麻毒素適配體通過化學(xué)鍵共價結(jié)合固定在羧甲基葡聚糖改性的金膜上，在SPR實驗中測定的蓖麻毒素檢出限約為25 pmol/L(1.5 ng/mL)。

2.3 適配體-SPR傳感器的檢測模式

常用的適配體-SPR傳感器檢測模式主要有直接測定法、夾心測定法和間接競爭性抑制測定等。

2.3.1 直接測定法

這類傳感器是將適配體固定在SPR傳感芯片上，適配體直接與被測物相互作用后改變傳感芯片表面的光學(xué)性質(zhì)。Janardhanan等[23]將A型肉毒毒素(type A botulinum neurotoxin，BoNT/A)的適配體固定在傳感芯片上，進行檢測時將BoNT/A的緩沖液注射流經(jīng)傳感芯片表面，適配體直接檢測到BoNT/A引起SPR信號的改變，該傳感器在90 min內(nèi)檢測到活性毒素，在稀釋5倍的人血清中的檢出限是22.5 ng/mL，并且可將毒素從變性和失活毒素中有效區(qū)分。Lee等[24]篩選出對視黃醇結(jié)合蛋白4(Retinol binding protein 4，RBP4)表現(xiàn)出較高的親和力和特異性的適配體，并將該適配體固定在SPR傳感芯片金膜上。當(dāng)樣品中存在RBP4時適配體直接捕獲目標(biāo)物，檢出限為75 nmol/L(1.58 μg/mL)。

2.3.2 夾心測定法

夾心測定法的機理為：將可結(jié)合至目標(biāo)物不同位點的一對適配體分別固定在SPR傳感芯片和起放大效應(yīng)的增敏物上，當(dāng)目標(biāo)物存在時，增敏物上所連接的適配體與傳感芯片上適配體結(jié)合住的目標(biāo)物相結(jié)合，以增強SPR信號。Park等[25]篩選得到了可以高親和力和特異性與1型牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)結(jié)合且具有不同結(jié)合位點的兩種適配體。他們將一個適配體固定在金膜表面，使用Au NPs與另一個適配體偶聯(lián)，以適配體-病毒-適配體的夾心檢測形式對BVDV 1型進行超靈敏檢測。該方法檢出限為5×102TCID50/mL(約800 copies/mL)，這與實時PCR方法相當(dāng)。Nguyen等[26]篩選出一對可同時與H5N1病毒結(jié)合且結(jié)合位點不同的適配體，第一個適配體固定于金膜表面，當(dāng)它與H5N1結(jié)合后再加入與Au NPs偶聯(lián)的次級適配體對檢測進行放大，檢出限為200 EID50/mL。該傳感器可快速、準(zhǔn)確地從H5N1感染的糞便樣本中檢測禽流感全病毒。

圖3 使用次級適配體AuNP偶聯(lián)物的夾心分析的檢測機理示意圖[26]

Fig.3 Schematic of detection mechanism of sandwich assay secondary aptamer conjugated-AuNP[26]

2.3.3 間接競爭性抑制測定

間接競爭性抑制測定(Indirect competitive inhibition assay，ICIA)過程如下：目標(biāo)物適配體的巰基化互補單鏈DNA首先固定在傳感芯片上，目標(biāo)物適配體與具有放大效應(yīng)的物質(zhì)如磁性納米粒子(Magnetic nanoparticles，MNPs)和金納米粒子(Gold-nanoparticles，Au NPs)形成偶聯(lián)物。由于這類物質(zhì)能夠提高傳感芯片生物分子的固載量[27-29]，具有放大效應(yīng)，當(dāng)目標(biāo)物不存在時偶聯(lián)物溶液被添加到SPR元件中，偶聯(lián)物通過DNA雜交反應(yīng)吸附到SPR芯片表面并導(dǎo)致SPR信號的巨大變化。當(dāng)偶聯(lián)物與目標(biāo)物結(jié)合后，SPR信號的變化即降低。這是因為目標(biāo)物與適配體在偶聯(lián)物中反應(yīng)并且將其結(jié)構(gòu)從單鏈DNA改變?yōu)槿壗Y(jié)構(gòu)，不能與固定在SPR金膜表面上的互補單鏈DNA雜交。因此，SPR信號的變化將隨著具有三級結(jié)構(gòu)的偶聯(lián)物的數(shù)量增加而減少，它與目標(biāo)物的濃度成比例。Wang等[30]通過金硫鍵將腺苷適配體的互補鏈在金膜表面自組裝成單層膜，再將Fe3O4MNPs-腺苷適配體偶聯(lián)物在SPR傳感芯片基底上組裝，以放大傳感器檢測腺苷的信號。加入腺苷后SPR信號隨腺苷濃度的增加而減弱。

2.3.4 組合適配體增強測定

組合適配體增強測定是一個適配體分子中存在兩種不同目標(biāo)物的適配體結(jié)構(gòu)，適配體分子與一個目標(biāo)物結(jié)合后其構(gòu)型改變并可以與另一個目標(biāo)物結(jié)合以放大檢測信號。Chang等[31]設(shè)計了一種具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)的適配體，并在該適配體中引入SA的適配體，當(dāng)IFN-γ存在時，靶分子IFN-γ會誘導(dǎo)適配體探針重折疊，形成SA適配體的結(jié)合構(gòu)象，通過SA分子與適配體探針的結(jié)合進一步增強SPR的響應(yīng)。在優(yōu)化條件下，測得的檢出限為33 pmol/L，濃度范圍為0.3～333 nmol/L。

圖4 基于SPR生物傳感器檢測小分子原理圖[30]

圖5 增強IFN-γ檢測的流程示意圖[31]

Fig.5 Schematic illustration of the procedure for amplified IFN-γ detection[31]

3 適配體-SPR傳感器在生物檢測中的應(yīng)用

適配體-SPR生物傳感技術(shù)結(jié)合了適配體與SPR技術(shù)的優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于毒素、病毒、蛋白、腺苷和干擾素等生物組分的檢測。

3.1 毒素檢測

Zhu等[32]使用生物素-親和素法將赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)適配體固定在SPR傳感芯片上。該傳感器對OTA的檢出限可達0.005 ng/mL。Park課題組[33]則是將OTA適配體通過金硫鍵自組裝的方式固定在金納米棒基底上，當(dāng)OTA與之結(jié)合后會引起適配體折疊形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致金納米棒表面RI的巨大改變并引起波長位移。當(dāng)OTA濃度在0.1 nmol/L～10 μmol/L范圍內(nèi)時，可觀察到局域表面等離子共振(Localized surface plasmon resonance，LSPR)紅移與OTA濃度呈線性關(guān)系，對OTA的檢出限低于1 nmol/L。

3.2 病毒檢測

由于高致病性H5N1流感在動物和人類中可能爆發(fā)，因此迫切地需要快速和特異性檢測禽流感病毒。Wang等[34]篩選和表征了可與H5N1特異性結(jié)合的適配體，并使用生物素-親和素法將其固定在SPR芯片表面。該適配體-SPR傳感器可以用于檢測禽流感病毒H5N1，當(dāng)病毒滴度在0.064～0.64 HAU范圍內(nèi)時SPR信號與病毒滴度呈線性關(guān)系。Bai等[35]使用生物素-親和素法將適配體固定在鏈霉親和素(Streptavidin，SA)修飾的SPR傳感芯片金膜上。優(yōu)化SA與適配體參數(shù)后，當(dāng)禽流感病毒濃度在0.128～1.28 HUA范圍內(nèi)時，RI值與禽流感病毒濃度線性相關(guān)，檢出限可達0.128 HUA。Nguyen等[26]篩選出一對可同時與H5N1病毒結(jié)合的適配體，且這對適配體結(jié)合于同一H5N1全病毒的不同位點。該課題組使用這對適配體發(fā)展了一種夾心生物傳感器，對H5N1全病毒檢測的線性范圍為0～105EID50/mL，檢出限為200 EID50/mL。

3.3 免疫球蛋白檢測

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是一類重要的免疫效應(yīng)分子，是檢查機體體液免疫功能的一項重要指標(biāo)。Wang等[36]使用巰基修飾的IgE適配體修飾傳感器表面，并使半胱氨酸與硫醇適配體共沉積以促進適配體的適當(dāng)空間排列，以保持其最佳結(jié)合效率。實驗結(jié)果表明IgE和適配體之間存在濃度依賴性的線性關(guān)系，IgE濃度在8.4～84 nmol/L范圍內(nèi)時，信號強度和IgE濃度呈線性關(guān)系，檢出限為2 nmol/L。Kim等[37]使用具有不同摩爾比的各種低聚乙二醇混合物構(gòu)建SAM，再將適配體通過生物素-親和素法固定在SAM上用于非標(biāo)記檢測人IgE。他們使用直接測定法和改進的夾心分析法用于實時IgE檢測，這兩種方法的線性范圍都是1.0～1 000 ng/mL，而且樣品檢出限分別為3.44 ng/mL和2.07 ng/mL。

3.4 腺苷檢測

Wang等將腺苷適配體的互補鏈固定在金膜表面，再將適配體分別與Fe3O4MNPs和Au NPs連結(jié)。與Fe3O4MNPs和Au NPs連結(jié)的偶聯(lián)物具有放大效應(yīng)，他們使用這兩種基于ICIA的傳感器檢測腺苷，線性范圍分別為10～10 000 nmol/L[30]和1×10-10～1×10-7mol/L[38]。

3.5 其他蛋白檢測

凝血酶是一種生物活性物質(zhì)，其促凝和抗凝的特性在凝血級聯(lián)反應(yīng)中有著重要作用。Henseleitng等[39]把抗凝血酶適配體通過生物素-親和素法固定在金膜表面，使用注射泵將不同濃度的凝血酶溶液注入傳感器表面以測定其相互作用。該方法能夠獲得可重現(xiàn)、顯著和穩(wěn)定的信號，檢出限約26 nmol/L。Wang等[40]使用具有放大效應(yīng)的Fe3O4MNPs-適配體偶聯(lián)物構(gòu)建了一個夾心型生物傳感器以檢測凝血酶。當(dāng)凝血酶濃度在0.27～27 nmol/L范圍內(nèi)時，凝血酶濃度的對數(shù)與SPR角位移呈線性關(guān)系，檢出限為0.017 nmol/L。Polonschii等[41]將生物素化的適配體固定在SPR金膜上，測試表明其對凝血酶的檢出限為3 nmol/L，在其他干擾蛋白質(zhì)(血漿)存在時，檢測凝血酶的變異系數(shù)為5%。

Tran等[42]篩選出花生過敏原Ara h 1的適配體，該適配體在生物素化后通過SA固定在11-巰基十一烷酸SAM修飾的金膜上。當(dāng)Ara h 1蛋白濃度在0～634 nmol/L范圍內(nèi)時，該適配體修飾的光纖SPR檢測系統(tǒng)信號強度和濃度呈線性關(guān)系，在緩沖液中用Au NPs增強測定時檢出限約為2 nmol/L。

Wu等[43]將C反應(yīng)蛋白的適配體通過金硫鍵自組裝的方式固定在金膜表面，適配體檢測到目標(biāo)物后加入偶聯(lián)了C反應(yīng)蛋白抗體的Au NPs對SPR信號進行放大。該型Au NPs增強的適配體-抗體夾心型SPR生物傳感器對C反應(yīng)蛋白的檢出限為10 pmol/L。

核酸適配體與SPR技術(shù)相結(jié)合，在生物檢測領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。適配體-SPR生物傳感器主要用于生物蛋白、毒素、病毒等物質(zhì)的檢測。如表1所示，其檢測對象主要為IgE、凝血酶、H5N1病毒等。這主要是由于這類免疫球蛋白和生物活性蛋白與人體的生理功能息息相關(guān)，各類毒素和病毒深刻地影響著人類的生命健康。因此，這些物質(zhì)的檢測研究成為人們的研究重點。

表1 適配體-SPR的傳感技術(shù)在生物檢測中的應(yīng)用

表1(續(xù))

4 結(jié) 論

SPR技術(shù)具有檢測速度快、無需標(biāo)記樣品、靈敏度高等優(yōu)點，近些年得到了較大的發(fā)展，且已有商業(yè)化的SPR傳感器推出應(yīng)用。用適配體檢測生物分子具有特異性好、可反復(fù)使用和可長期保存的優(yōu)點。根據(jù)目前報道的相關(guān)文獻可以發(fā)現(xiàn)，基于適配體-SPR的生物傳感技術(shù)，綜合了SPR技術(shù)與適配體的優(yōu)點，表現(xiàn)出較高的靈敏度和特異性，可用于檢測生物活性蛋白、毒素、病毒等生物分子，是具有應(yīng)用前景的生物檢測技術(shù)。雖然目前在實驗室中的檢測效果十分優(yōu)異，但將其應(yīng)用于生化物質(zhì)的現(xiàn)場快速檢測，真正實用化還有一定距離。未來發(fā)展方向是研制便攜、精確、快速的基于適配體-SPR的生物傳感器。

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杜斌(1987-)，男，山東濟寧人，博士研究生，2012年于防化研究院獲得碩士學(xué)位，主要從事偵檢材料與技術(shù)的研究。

E-mail： dubin51979@163.com童朝陽(1972-)，男，四川樂山人，博士，研究員，2000年于防化研究院獲得博士學(xué)位，主要從事生物檢測技術(shù)的研究。

E-mail： billzytong@126.com

Research and Application of Biosensing Technology Based on Aptamer-Surface Plasmon Resonance

DU Bin1, TONG Zhao-yang1*, LIU Zhi-wei1, MU Xi-hui1, DING Zhi-jun2, CAO Wei2

(1.StateKeyLaboratoryofNBCProtectionforCivilian,Beijing102205,China; 2.ResearchInstituteofChemicalDefense,Beijing102205,China)
*CorrespondingAuthor,E-mail:billzytong@126.com

The aptamers have been widely used in biomolecule recognition because of their advantages of synthesis, modification and immobilization. The sensing technology developed by surface plasmon resonance(SPR) has the advantages of non-labeling, no pretreatment, real-time monitoring. The sensors based on aptamer and SPR have important application values in biosensing techniques. The applications of biosensor based on aptamer-SPR are reviewed in this paper.

aptamer; surface plasmon resonance; biosensor; detection; application

1000-7032(2017)08-1039-08

2017-01-10；

2017-04-13

國家自然科學(xué)基金(21402237)； 國民核生化災(zāi)害防護國家重點實驗室基礎(chǔ)研究基金(SKLNBC2012-01)資助項目 Supported by National Natural Science Foundation of China (21402237); Basic Research Foundation of State Key Laboratory of National NBC Protection for Civilian (SKLNBC2012-01)

TP212.3

A

10.3788/fgxb20173808.1039