LC-MS/MS方法測(cè)定比格犬血漿中沙芬酰胺及其代謝物

楊可為，郝元斌，鄒巧根(南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京211800)

LC-MS/MS方法測(cè)定比格犬血漿中沙芬酰胺及其代謝物

楊可為，郝元斌，鄒巧根
(南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京211800)

建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用/質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定比格犬血漿中沙芬酰胺異構(gòu)體及其代謝物濃度的方法，在此基礎(chǔ)上對(duì)沙芬酰胺異構(gòu)體及其代謝物在比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。色譜檢測(cè)條件方法一為用AS-RH手性柱測(cè)定沙芬酰胺異構(gòu)體;方法二為用XB-C18分析柱測(cè)定沙芬酰胺代謝物。質(zhì)譜條件離子源為APCI源，離子化方式為正離子模式，噴霧電壓5 200 V，加熱毛細(xì)管溫度550℃，霧化氣(N2)流速75.8 KPa，氣簾氣(N2)75.8 KPa，碰撞氣(N2)55.16 KPa，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。建立的LC-MS/MS方法線性范圍左旋沙芬酰胺為10～2 000 ng/mL(r=0.999 4)，右旋沙芬酰胺為10～2 000 ng/mL(r=0.997 6)，沙芬酰胺代謝物為10～1 000 ng/mL (r=0.994 1)。本方法靈敏，快速且穩(wěn)定，適用于沙芬酰胺異構(gòu)體及其代謝物藥代動(dòng)力學(xué)研究。

沙芬酰胺;代謝物;藥代動(dòng)力學(xué);LC-MS/MS

甲磺酸沙芬酰胺的化學(xué)名稱(chēng)為(+)-(S)-2-［［對(duì)-［(間-氟芐基)氧基］芐基］氨基］丙酰胺-甲磺酸鹽，該藥物為手性藥物，并具有單一手性中心。沙芬酰胺是可逆的選擇性單胺氧化酶B(MAO-B)抑制劑，與谷氨酸鹽的釋放相互作用，能夠減少在帕金森綜合征進(jìn)程中相關(guān)基底核中紋狀體多巴胺傳遞和谷氨酸通道的過(guò)度活躍性，因此可以作為抗帕金森藥物［1－2］。沙芬酰胺的主要代謝物是沙芬酰胺酸［3］。關(guān)于手性藥物，對(duì)映異構(gòu)體具有幾乎相同的物理性質(zhì)(旋光性除外)和化學(xué)性質(zhì)(在手性環(huán)境中除外)，但生物系統(tǒng)常常很容易區(qū)分它們，并可能導(dǎo)致不同的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(吸收、分布、代謝和排泄)以及藥理學(xué)、毒理學(xué)效應(yīng)的量或質(zhì)的區(qū)別。代謝產(chǎn)物在血漿中長(zhǎng)期積累將產(chǎn)生有毒物質(zhì)并損害健康［4］，Leuratti等［3］采用的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用/質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法檢測(cè)了沙芬酰胺代謝物，缺點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間非常長(zhǎng)(50 min)。Dal等［5］采用的方法檢測(cè)了沙芬酰胺，但沒(méi)有檢測(cè)沙芬酰胺代謝物。Marzo等［6］采用的方法檢測(cè)了沙芬酰胺沒(méi)有檢測(cè)沙芬酰胺異構(gòu)體。Kumar等［7］采用的方法檢測(cè)了沙芬酰胺異構(gòu)體，定量下限很高(50 ng/mL)，不夠靈敏。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在分析藥物及其在各種復(fù)雜生物基質(zhì)(全血、血漿、尿、膽汁及生物組織)中的代謝產(chǎn)物時(shí)，由于其選擇性強(qiáng)、靈敏度高，不僅可以避免復(fù)雜、繁瑣、耗時(shí)的樣品前處理工作，而且能分離鑒定以往難以辨識(shí)的痕量藥物代謝產(chǎn)物，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)的應(yīng)用，通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，可以大大提高分析的專(zhuān)一性，改善信噪比，提高靈敏度，從而快速、方便地解決問(wèn)題［8－9］。比如Cao等［10］采用LC-MS/MS方法檢測(cè)了雷貝拉唑?qū)τ钞悩?gòu)體及其代謝物。

在本研究中，筆者擬用LC-MS/MS方法來(lái)檢測(cè)沙芬酰胺異構(gòu)體及代謝物，以期為研究沙芬酰胺及其代謝產(chǎn)物提供實(shí)際數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

甲磺酸沙芬酰胺片劑、沙芬酰胺異構(gòu)體、沙芬酰胺酸，筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制。右旋雷貝拉唑(純度大于99%)、咪唑乙醇(純度大于99%)，南京海納醫(yī)藥科技有限公司。NH4HCO3(HPLC級(jí))，阿拉丁公司。甲醇、乙腈(HPLC級(jí))，默克公司。純水，默克公司純水儀制取。其他化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

安捷倫1100型液相色譜儀(LC-MS/MS)，Agilent Technologies，配備有電噴霧電離(APCI)接口使用正離子模式的API 3000三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(AB Sciex)組成。色譜數(shù)據(jù)和采集使用的是軟件Analyst version 1.5.2(AB Sciex)。

1.3 色譜條件

測(cè)定沙芬酰胺異構(gòu)體的色譜條件。AS-RH手性柱(4.6 mm×150 mm，5μm，中國(guó)大賽璐公司);流動(dòng)相A為5 mmol/L NH4HCO3水溶液、B為乙腈，梯度洗脫(0～16 min，20%B;16～18 min，20%～70% B;18～29 min，70%B;29～31 min，70%～20%B; 31～36 min，20%B);流速為0.4 mL/min;柱溫為25℃;進(jìn)樣量為5.0μL。

測(cè)定沙芬酰胺代謝物的色譜條件。XB-C18分析柱(4.6 mm×50 mm，3μm，中國(guó)月旭科技公司);流動(dòng)相A為水(含0.1%甲酸)、B為乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脫(0～0.5 min，20%B;0.5～1.5 min，20%～90%B;1.5～4 min，90%B;4～5 min，90%～20%B;5～5.5 min，20%B);流速為1 mL/ min;柱溫為40℃;進(jìn)樣量為10.0μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源為APCI源(離子化方式為正離子模式);噴霧電壓為5 200 V;加熱毛細(xì)管溫度為550℃;霧化氣(N2)流速75.8 kPa，氣簾氣(N2)75.8 kPa，碰撞氣(N2)55.16 kPa;掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。

用于檢測(cè)的各待測(cè)物的離子反應(yīng)分別是:m/z 302.4→m/z 215.3(沙芬酰胺)、m/z 303.6→m/z 215.2(沙芬酰胺酸)、m/z 360.2→m/z 242.0(右旋雷貝拉唑)、m/z 257.2→m/z 125.0(咪唑乙醇)。圖1為沙芬酰胺及沙芬酰胺酸的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖。

1.5 血漿樣品預(yù)處理

沙芬酰胺異構(gòu)體樣品制備。血漿樣品取采用液液萃取，取100μL血漿注入聚乙烯管隨后加入50μL內(nèi)標(biāo)右旋雷貝拉唑(1μg/mL)，渦旋3 min。然后加入400μL乙酸乙酯渦旋3 min，將混合物以12 000 r/min離心10 min。取300μL上清液40℃氮吹。然后加入5 mmol/L NH4HCO3-乙腈(體積比80∶20)溶液100μL復(fù)溶，渦旋3 min，以12 000 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣品，使用LC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。

沙芬酰胺代謝物樣品制備。血漿樣品萃取采用液液萃取，取100μL血漿樣品注入聚乙烯管，隨后加入50μL內(nèi)標(biāo)咪唑乙醇(1μg/mL)，渦旋3 min。然后加入400μL乙酸乙酯渦旋3 min，將混合物以12 000 r/min離心10 min。取300μL上清液40℃氮吹。然后加入水(含0.1%甲酸)-乙腈(含0.1%甲酸)(體積比為80∶20)溶液100μL復(fù)溶，渦旋3 min，以12 000 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣品，使用LC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.6 儲(chǔ)備液、校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品和質(zhì)量控制樣品的制備

左旋沙芬酰胺、右旋沙芬酰胺、沙芬酰胺酸、右旋雷貝拉唑和咪唑乙醇的儲(chǔ)備液用甲醇配制。一系列工作標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備通過(guò)用甲醇稀釋儲(chǔ)備液到對(duì)應(yīng)系列質(zhì)量濃度:左旋沙芬酰胺和右旋沙芬酰胺分別為20、15、10、5、1、0.5、0.2和0.1μg/mL;沙芬酰胺酸為10、5、1、0.5、0.2和0.1μg/mL;右旋雷貝拉唑?yàn)?μg/mL;咪唑乙醇為1μg/mL。所有工作溶液保持在-20℃。

校正標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。每10μL工作標(biāo)準(zhǔn)溶液用90μL空白比格犬血漿混合得到濃度為10、20、50、100、500、1 000、1 500和2 000 ng/mL的左旋沙芬酰胺或右旋沙芬酰胺;10、20、50、100、500和1 000 ng/mL的沙芬酰胺酸。

質(zhì)量控制樣品的制備。左旋沙芬酰胺和右旋沙芬酰胺濃度為20、800和1 600 ng/mL;沙芬酰胺酸濃度為20、400和800 ng/mL。

圖1 沙芬酰胺(a)及沙芬酰胺酸(b)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和離子質(zhì)譜圖Fig.1 Chemical structures and product ion mass spectra of safinamide(a)and safinamide acid(b)

1.7 藥代動(dòng)力學(xué)的研究

成年比格犬12只(6公、6母)，隨機(jī)分為2組，每組6只，雌雄各半，分3周期完成試驗(yàn)。比格犬片劑口服給藥，使用真空采血管于給藥前(0 min)及口服給藥結(jié)束后(15±1)、(30±1)、(45±1)、(60±1)、(90±1)、(120±1)、(180±1)、(240±1)、(300±1)、(360±1)、(420± 1)、(480±1)、(600±1)、(660±1)、(1 440±1)和(2 100± 1)min靜脈采血約2 mL，抗凝劑為EDTA-K2，全血在4℃條件下以5 000 r/min離心10 min，獲得血漿樣品，預(yù)處理后使用LC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 專(zhuān)屬性

圖2顯示了血漿樣品加入一定濃度的左旋沙芬酰胺、右旋沙芬酰胺和右旋雷貝拉唑(內(nèi)標(biāo))及沙芬酰胺酸和咪唑乙醇(內(nèi)標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)溶液和比格犬口服50 mg甲磺酸沙芬酰胺15 min后分別用AS-RH手性柱和XB-C18分析柱測(cè)得的MRM質(zhì)譜圖。由圖2可知:左旋沙芬酰胺、右旋沙芬酰胺、沙芬酰胺酸和內(nèi)標(biāo)互不干擾，峰形良好，無(wú)雜峰干擾，基線平穩(wěn)。

圖2 血漿樣品加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和比格犬口服50 mg甲磺酸沙芬酰胺15 min后的MRM質(zhì)譜圖Fig.2 A plasma sample added with standard solution of a certain concentration and dog plasma samples obtained at 15 min after oral adminostration of 50 mg safinamide metharesulforate

2.2 線性及定量下限

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有待測(cè)物在濃度范圍內(nèi)呈線性，典型標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見(jiàn)圖3～5。由圖3～5可知:左旋沙芬酰胺的線性方程為Y=0.000 361X+0.007 9 (r=0.999 4，n=6)，10～2 000 ng/mL;右旋沙芬酰胺的線性方程為Y=0.000 3X+0.000 48(r=0.997 6，n= 6)，10～2 000 ng/mL;沙芬酰胺酸的線性方程為Y= 0.003 76 X+0.012 4(r=0.994 1，n=6)，10～1 000 ng/mL。左旋沙芬酰胺和右旋沙芬酰胺定量下限為10 ng/mL，沙芬酰胺酸定量下限為10 ng/mL。

2.3 精密度及準(zhǔn)確度測(cè)定

取空白血漿，按上述血漿樣品處理方法制備所有分析物的質(zhì)控樣品、左旋沙芬酰胺、右旋沙芬酰胺及沙芬酰胺酸的批內(nèi)、批間精密度(RSD)均小于15%，結(jié)果見(jiàn)表1，由表1可知，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合生物樣品的測(cè)定要求。

圖3 LC-MS/MS法測(cè)定血漿中左旋沙芬酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(方法驗(yàn)證第2天)Fig.3 The standard curve of(S)-safinamide in beagle plasma by LC-MS/MS method(Run.2)

2.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

取空白血漿，按上述血漿樣品處理方法制備所有分析物的質(zhì)控樣品，以血漿中分析物的峰面積與相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分析物峰面積的比值計(jì)算出上述質(zhì)控樣品濃度的提取回收率。左旋沙芬酰胺、右旋沙芬酰胺及沙芬酰胺酸的提取回收率見(jiàn)表2。由表2可知，在實(shí)驗(yàn)中未觀察到明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

圖4 LC-MS/MS法測(cè)定血漿中右旋沙芬酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(方法驗(yàn)證第2天)Fig.4 The standard curve of(R)-safinamide in beagle plasma by LC-MS/MS method(Run.2)

圖5 LC-MS/MS法測(cè)定血漿中沙芬酰胺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(方法驗(yàn)證第2天)Fig.5 The standard curve of safinamide acid in beagle plasma by LC-MS/MS method(Run.2)

表2 沙芬酰胺對(duì)映體及沙芬酰胺酸的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Extraction recovery and matrix effect ofsafinamide enantiomers and metabolite

2.5 穩(wěn)定性

考察沙芬酰胺對(duì)映體及代謝物在以下存放及處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性:低、中和高濃度質(zhì)控血漿樣品室溫4 h的短期穩(wěn)定性;－80℃下20 d的長(zhǎng)期穩(wěn)定性;反復(fù)凍融的穩(wěn)定性;質(zhì)控樣品按上述血漿樣品處理方法提取后4℃下儲(chǔ)存在自動(dòng)進(jìn)樣器里48 h的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知:沙芬酰胺對(duì)映體及代謝物在所有條件下穩(wěn)定性良好。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果

兩個(gè)LC-MS/MS方法成功地用于比格犬口服甲磺酸沙芬酰胺(50 mg)后比格犬體內(nèi)沙芬酰胺及沙芬酰胺酸的藥代動(dòng)力學(xué)研究［9］。由圖6可知，比格犬口服甲磺酸沙芬酰胺后沙芬酰胺及沙芬酰胺酸的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖6。在比格犬體內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到右旋沙芬酰胺，這表明沙芬酰胺在體內(nèi)沒(méi)有手性轉(zhuǎn)化。將數(shù)據(jù)用DAS 2.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)矩分析，求算出沙芬酰胺及沙芬酰胺酸在比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知:左旋沙芬酰胺在比格犬體內(nèi)沒(méi)有發(fā)生手性轉(zhuǎn)化，左旋沙芬酰胺在口服后1.5 h左右達(dá)到峰濃度，沙芬酰胺酸在口服2 h左右達(dá)到峰濃度。(左旋沙芬酰胺的半衰期為5.09 h左右，沙芬酰胺的半衰期為4.59 h左右。)

表1 沙芬酰胺對(duì)映體及沙芬酰胺酸的批間批內(nèi)精密度Table 1 Intra-and inter-day precision and accuracy for safinamide enantiomers and metabolite

表3 沙芬酰胺對(duì)映體與代謝物的穩(wěn)定性研究Table 3 Stability analysis of safinamide enantiomers and metabolite under various conditions(n=6)

圖6 比格犬口服50 mg甲磺酸沙芬酰胺后左旋沙芬酰胺及沙芬酰胺酸的血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線Fig.6 Plasma concentration-time profiles of(S)-safinamide and safinamide acid after oral administration of 50 mg safinamide methanesulfonate to beagle dogs

表4 比格犬口服沙芬酰胺后左旋沙芬酰胺和沙芬酰胺酸的平均藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Mean pharmacokinetic parameters for(S)-safinamide and safinamide acid after oral administration to beagle dogs

3 結(jié)論

本文建立了LC-MS/MS方法用于測(cè)定比格犬血漿中沙芬酰胺異構(gòu)體及沙芬酰胺酸。以AS-RH手性柱為基礎(chǔ)測(cè)定了沙芬酰胺異構(gòu)體，以XB-C18分析柱測(cè)定了沙芬酰胺酸。此法靈敏度高、專(zhuān)屬性好、線性良好、精密度良好且準(zhǔn)確度高，在方法學(xué)研究的基礎(chǔ)上，可成功應(yīng)用于藥代動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果顯示，沙芬酰胺在體內(nèi)沒(méi)有手性轉(zhuǎn)化。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究沙芬酰胺及其代謝物提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯周曉薇)

Determination of safinamide and its metabolites in beagle dog plasma by LC-MS/MS

YANG Kewei，HAO Yuanbin，ZOU Qiaogen
(College of Pharmacy，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China)

An LC-MS/MS method was developed to determine safinamide enantiomers and their metabolite in beagle dog plasma to study the pharmacokinetic．The first method to determine safinamide enantiomers was using AS-RH chiral column．The second method todetermine safinamide metabolites was using an XB-C18 column．The mass spectrometric conditions were:APCI as ion source for ionization in positive ion mode，spray voltage 5 200 V，capillary temperature 550℃，atomization gas flow rate 75.8 KPa (N2)，curtion Gas(N2)75.8 KPa，collision Gas 55.16 KPa，andthe scanning mode for multiple reaction monitoring(MRM)．LC-MS/MS method was establishedfor the linear range of(S)-safinamide 10～2 000 ng/mL(r=0.999 4)，(R)-safinamide metabolite for 10～2 000 ng/mL(r=0.997 6)，safinamide acid 10～1 000 ng/mL(r=0.994 1)．This method was sensitive，rapid，stable and suitable for the pharmacokinetic study of safinamide enantiomers and theirmetabolites．

safinamide;metabolite;pharmacokinetic;LC-MS/MS

R969.1

A

1672－3678(2017)04－0070－07

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.012

2016－12－04

楊可為(1992—)，男，江蘇南京人，研究方向:藥劑學(xué);鄒巧根(聯(lián)系人)，教授，E-mail:zouqiaogen@healthnice．net