一株柴油高級烴降解菌的篩選與鑒定

呂乾川，伍元東，周俊，賈紅華，韋萍，鄭濤，雍曉雨(.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京2800;2.南京工業(yè)大學(xué)生物能源研究所，江蘇南京2800;.中國科學(xué)院廣州能源研究所，廣東廣州50640)

一株柴油高級烴降解菌的篩選與鑒定

呂乾川1，2，伍元東1，2，周俊1，2，賈紅華1，2，韋萍1，鄭濤3，雍曉雨1，2
(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800;2.南京工業(yè)大學(xué)生物能源研究所，江蘇南京211800;3.中國科學(xué)院廣州能源研究所，廣東廣州510640)

從加油站附近土壤取樣，以不同的柴油高級烴為碳源、菌體生物量(OD600)為指示，分離篩選柴油高級烴降解菌株，同時應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析其降解率以及降解產(chǎn)物。結(jié)果篩選到一株對二苯并噻吩、芳香烴類都具有一定降解效果的菌株B5，它對二苯并噻吩的降解率為63.0%，芳香烴類降解率為83.4%。該菌株能將直鏈烷烴(如正十二烷)的末端羧基化形成羧酸類物質(zhì)，在實際應(yīng)用中具有提高油品潤滑性質(zhì)的潛力。經(jīng)16S rRNA基因鑒定，該菌株為一株紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)，并被命名為R.erythropolis B5。

柴油高級烴;直鏈烷烴;紅平紅球菌;降解菌

汽車工業(yè)的發(fā)展以及汽車排放標(biāo)準(zhǔn)的日益嚴(yán)格對我國的車用柴油提出更高的要求。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，2016年我國的柴油表觀消費量已高達1.633× 108t［1］。然而，目前我國車用柴油品質(zhì)不高，主要問題有:辛烷值低、含硫量高、部分柴油密度高以及對芳烴和稠環(huán)芳烴的含量尚無限制［2］。日益增長的柴油消費量和較低的柴油品質(zhì)已經(jīng)帶來了嚴(yán)重的環(huán)境壓力，其中，最為人們所熟知的就是在2013年成為年度關(guān)鍵詞的“霧霾”［3］。我國在2003年出臺的柴油車排放污染防治技術(shù)政策中提到國家鼓勵生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、低硫、低芳烴柴油新技術(shù)和新工藝的應(yīng)用［4］。雖然此政策在一定程度上改善了國內(nèi)柴油品質(zhì)，但與世界先進國家的產(chǎn)品質(zhì)量還有著較大的差距。

清潔柴油主要表現(xiàn)為柴油低硫、低芳烴及稠環(huán)芳烴等。傳統(tǒng)的柴油清潔化方法一般為加氫精制以及電脫硫，而這些方法將消耗大量的電能以及氫氣［5］。在自然界中，存在著大量可以利用柴油高級烴(如直連長烴和芳香烴等)生長的微生物(已報道的超過200種)［6］。其中，細菌有假單胞菌屬(Pseudomonas)、棒桿菌屬(Corynebacterium)等，霉菌有青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)等。美國的天然氣研究所(ITG)在20世紀(jì)90年代成功分離出一株能有效脫硫的紅平紅球菌株［7］，該菌株已被休斯頓的能源公司買斷并應(yīng)用在煉油工業(yè)上［8］。利用此類微生物對柴油進行清潔化處理，不僅能節(jié)省能源，在煉油產(chǎn)業(yè)以及車用燃油添加劑方面也會有廣闊的應(yīng)用前景。

本文中，筆者旨在從土壤中自主篩選分離出一株柴油高級烴降解菌株，并針對其降解效率及降解產(chǎn)物進行了初步研究，以期為柴油清潔化工藝提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品采集

土壤樣品采集自常州邦路加油站及桃園加油站的儲油罐進油口附近，深度為20 cm。

1.1.2 培養(yǎng)基

無機鹽培養(yǎng)基(g/L):NaCl 24，MgCl2·7H2O 7.0，NH4Cl1.0，KH2PO42.0，Na2HPO43.0;pH 7.2。

種子液培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10;pH 7.0。

LB平板培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，瓊脂15。

PDA平板培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)46。

以上培養(yǎng)基均使用高壓蒸汽滅菌鍋在121℃條件下滅菌20 min。

Gibbs試劑:取0.05 g 2，6-溴苯醌亞胺溶于50 mL乙醇，避光低溫保存。

HTP試劑:吡啶7 mL、六甲基二硅胺2 mL、三甲基氯硅烷1 mL，混合后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要儀器和試劑

培養(yǎng)基所用試劑(分析純)，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;752S型紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司。E100型光學(xué)顯微鏡，日本尼康公司;色譜工作站為美國Agilent 1260系統(tǒng);GC-MS系統(tǒng)采用Thermo Trace GC Ultra-ISQ。

1.2 菌株篩選

1.2.1 初篩

分別稱取兩個加油站土壤樣品各10 g，加入裝有100 mL無機鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中，同時加入體積分?jǐn)?shù)1%的0#柴油(柴油紫外滅菌20 min后用20μm濾膜過濾)作為唯一碳源。試樣放入搖床180 r/min、30℃下培養(yǎng)7 d，再以之為種子液(接種量為1%)，接入上述馴化液中，相同添加量下富集培養(yǎng)2次。

21 d后，將培養(yǎng)液依次稀釋成10－9、10－8、10－7、10－6和10－5的稀釋液，取10－7、10－6和10－5稀釋倍數(shù)的稀釋液100μL涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，取10－9、10－8和10－7稀釋倍數(shù)的培養(yǎng)液100μL涂布于LB平板培養(yǎng)基上，最后將平板放置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。

從平板上挑取生長旺盛的菌落，分別編號并劃線接種到對應(yīng)的平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)1～2 d，再選取單菌落再次平板劃線純化5次。將得到的菌株平板4℃保存，每隔30 d轉(zhuǎn)接活化1次。

1.2.2 復(fù)篩

待測菌株種子液制備。將得到的菌株接種至裝有100 mL種子液培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，放入搖床180 r/min、30℃培養(yǎng)1～2 d，制成種子液。

待測菌株芳香烴降解能力檢測。將種子液以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量加入裝有100 mL無機鹽培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶，并加入0.22 g鄰苯二酚，放入搖床，180 r/min、30℃培養(yǎng)7 d，測其OD600。

待測菌株脫硫能力檢測。將種子液以1%的接種量加入裝有100 mL無機鹽培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶，并加入0.01 mmol/L的二苯并噻吩(DBT)、5 mL甘油，放入搖床，180 r/min、30℃培養(yǎng)7 d，測其OD600。

1.3 柴油芳烴類降解率測定

將培養(yǎng)好的每份菌種種子液以1%的接種量分別加入20個裝有100 mL無機鹽培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，并以1%體積分?jǐn)?shù)的0#柴油作為唯一碳源，放入搖床，180 r/min、30℃條件下培養(yǎng)，每天取出每種菌株的培養(yǎng)液2瓶，以10 mL石油醚(30～60℃)超聲振蕩萃取3 min后，轉(zhuǎn)移到125 mL分液漏斗中，靜置分層后將下層溶液收集于原錐形瓶中，上層溶液則轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，再向收集到的下層溶液中加入10 mL石油醚，用同樣的方式再次萃取，取上層溶液一并收集到25 mL容量瓶中，并加入石油醚稀釋到刻度，混勻，稀釋50倍后，以石油醚作為空白，在250 nm波長下測定吸光度［9］。

1.4 鄰苯二酚雙加氧酶酶活測定

1.4.1 粗酶液的制備

將培養(yǎng)到對數(shù)期的菌液離心并收集菌體，超聲破碎后取上清液，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 酶活測定

由于鄰苯二酚2，3-雙加氧酶(C23O)在降解鄰苯二酚時，可以催化鄰苯二酚在兩個酚羥基的鄰位開環(huán)，生成2-羥粘糠酸半醛，而2-羥粘糠酸半醛在375 nm處有最大吸收峰［10］。測定系統(tǒng)總體積3 mL，內(nèi)含1μmol鄰苯二酚、2.8 mL pH 7.5 K3PO4緩沖液和0.2 mL粗酶液。在30℃條件下反應(yīng)1 min后在375 nm處測定吸光度的增加值［11］。酶活定義:每分鐘在375 nm處吸光度增加0.001為一個酶活單位。

1.5 二苯并噻吩降解率測定

1.5.1 二苯并噻吩的檢測方法

二苯并噻吩(DBT)是柴油中主要的含硫有機物，在實驗中通常也被用作柴油中含硫有機物的模型化合物。二苯并噻吩可采用液相色譜檢測。以V(甲醇)/V(水)=90/10作為流動相［12］，柱溫25℃，流量1 mL/min，檢測波長254 nm，進樣量10μL。

1.5.2 降解率測定

將培養(yǎng)好的菌種種子液以1%的接種量加入裝有100 mL無機鹽培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，并加入0.01 mmol/L的二苯并噻吩、5 mL甘油，放入搖床，180 r/min、30℃下培養(yǎng)7 d后，用等體積二氯甲烷振蕩萃取3 min，隨后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除二氯甲烷，然后用10 mL甲醇溶解，HPLC檢測其含量，并以未加入菌液、放置7 d后的DBT為對照，檢測其降解率。

1.6 直鏈烷烴降解以及降解產(chǎn)物檢測

制作B5菌株種子液，將其以1%的接種量加入裝有100 mL無機鹽培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，并加入1 mL正十二烷，放入搖床180 r/min、30℃條件下培養(yǎng)7 d后，用5 mL二氯甲烷超聲萃取3次并收集下層清液，N2氣流下吹干后，加入1 mL的HTP試劑進行衍生化反應(yīng)(120℃下反應(yīng)30 min)，樣品制備好后運用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)檢測降解產(chǎn)物。

1.7 菌株鑒定

1.7.1 生長曲線測定

將菌株接種于200 mL種子液培養(yǎng)基中，放入搖床，180 r/min、30℃條件下培養(yǎng)，每隔1～2 h取樣測定其600 nm處的吸光值，以時間(h)為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.7.2 菌株的16S rRNA基因測序與鑒定

將純化好的菌株用種子液培養(yǎng)基培養(yǎng)成種子液后，委托南京金斯瑞生物科技有限公司提取并測定菌株的16S rRNA基因序列，測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST，并與GenBank數(shù)據(jù)庫進行相似性分析，再利用MEGA 4.0軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選的結(jié)果

以長期經(jīng)受柴油污染/浸潤的土壤作為目標(biāo)，利用以0#柴油作為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基篩選并挑取了能以柴油為唯一碳源快速生長的菌株共22株。再分別通過以二苯并噻吩、鄰苯二酚等為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基進行復(fù)篩，最終得到5株能同時利用鄰苯二酚以及二苯并噻吩生長的菌株，分別編號為A4和A9(真菌);B5、B6和B7(細菌)。將5株菌多次純化并鏡檢后，斜面保存，并制作甘油菌－80℃保存。

2.2 柴油中芳烴降解率測定結(jié)果

測定了5株目標(biāo)菌株對柴油中典型芳烴的降解率，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知:所有菌株在5 d內(nèi)都表現(xiàn)出較高的降解率，5 d后，降解率開始逐漸下降。這種表現(xiàn)可能是由于5 d內(nèi)，柴油中芳烴的含量較高，而隨著降解時間延長，易降解的芳烴已經(jīng)被降解，剩余的芳烴由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，降解過程緩慢，甚至一部分重芳烴無法降解，導(dǎo)致降解率趨于平緩。而空白樣由于柴油中含有的一部分芳烴具有揮發(fā)性，因此在空白對照中，芳烴含量也出現(xiàn)了小幅度的減少?？傮w而言，B5菌株在10 d時間里面，芳烴含量減少了83.4%，明顯高于其他4株菌株。與文獻報道相比，B5菌株的芳烴降解率高于馬宏瑞等［13］所篩選出的Pseudomonas DS-Ⅲ菌株(降解率為81.2%)和黃磊等［14］所篩選出的Rhodococcus erythropolis T7-2菌株(降解率為73.2%)。

圖1 柴油中芳烴降解率測定結(jié)果Fig.1 Degradation rate of bacteria candidates toward diesel alkanes

2.3 鄰苯二酚2，3-雙加氧酶酶活測定結(jié)果

鄰苯二酚雙加氧酶是芳香烴類開環(huán)、降解的關(guān)鍵酶，能催化鄰苯二酚或者鄰苯二酚的衍生物在鄰位開環(huán)生成粘糠半醛，再經(jīng)由三羧酸循環(huán)(TCA)將芳香烴完全代謝。許多芳烴降解菌都具有鄰苯二酚2，3-雙加氧酶基因，并在一定條件下表現(xiàn)出鄰苯二酚2，3-雙加氧酶酶活性［15－17］。

配制5株目標(biāo)菌株的粗酶液并分別測定其鄰苯二酚2，3-雙加氧酶的酶活，結(jié)果見圖2。由圖2可知:A4和B5菌株表現(xiàn)出較高的比酶活(分別為0.501和0.521 U/mg)。綜合所篩選菌株對柴油中典型芳烴降解率，最終選擇了B5菌株作為進一步研究對象。雖然所測得的375 nm處的吸光度的增加值僅為孫海波［18］所篩選得到的菌株3A的一半，但所加入酶液的蛋白量也為它的1/2(202 mg/L)，因此可以推斷，B5菌株的鄰苯二酚2，3-雙加氧酶的比酶活與3A菌株相當(dāng)。

2.4 二苯并噻吩降解率測定結(jié)果

考察菌株B5對二苯并噻吩的降解能力，結(jié)果見圖3。由圖3可知:菌株B5在添加二苯并噻吩的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)2～5 d后對二苯并噻吩表現(xiàn)出較高的降解率，7 d后降解率達到63.0%。但在降解處理的5 d后，降解率明顯下降，可能是由于生成的降解產(chǎn)物濃度過高抑制了酶的活性。魏玉霞等［19］研究發(fā)現(xiàn)，降解菌株以不同的物質(zhì)，如葡萄糖、甘油和乙醇等為碳源的情況下，二苯并噻吩降解率也會有所不同，后續(xù)將就此對B5菌株的二苯并噻吩降解進行進一步的優(yōu)化研究。

圖2 鄰苯二酚2，3-雙加氧酶酶活測定結(jié)果Fig.2 Enzyme activity of catechol 2，3-dioxygenase

圖3 二苯并噻吩降解曲線Fig.3 Degradation curve of dibenzothiophen

2.5 直鏈烷烴降解產(chǎn)物測定結(jié)果

由于菌株是以柴油為唯一碳源篩選所得，因此，若要將菌株運用于柴油清潔化工藝上，就必須考慮菌株是否會連同柴油中的主要成分一起降解代謝。因此，以十二烷(柴油中的主要直鏈烷烴)為代表，檢測菌株是否會將十二烷降解代謝并檢測代謝產(chǎn)物具有相當(dāng)?shù)膶嶋H意義［20］。經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，B5菌株能在以正十二烷為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。對培養(yǎng)7 d后的降解產(chǎn)物進行GC-MS分析，結(jié)果見圖4～6。由圖4～6可以發(fā)現(xiàn):9.05、20.21和25.58 min的吸收峰，經(jīng)質(zhì)譜比對分別為正十二烷(圖5)、正十二醇(已硅烷化，圖6)、正十二烷酸(已硅烷化，圖7)，但未在其中發(fā)現(xiàn)更短碳鏈的烷烴、醇以及酸。由此可以推斷，B5菌株可以將正十二烷代謝為正十二醇，并進一步氧化為正十二酸。

傳統(tǒng)工藝下生產(chǎn)的低硫、低芳烴的清潔化燃油在使用中發(fā)現(xiàn)因為其中的極性物質(zhì)的減少，導(dǎo)致了柴油的潤滑性下降。而范文琴［21］研究發(fā)現(xiàn)添加羧酸型抗磨劑是解決新配方柴油潤滑性差的最有效方法。Kajdas等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在低硫柴油之中，添加入正十二烷酸后，柴油的潤滑性能大大提高，即便添加劑量低至50 mg/kg，其檢測到的磨斑直徑(WS1.4)也可達到203μm，效果相當(dāng)顯著。與Anastopoulos等［23－27］的研究結(jié)果相比，脂肪酸類的添加劑相較于脂肪酸單脂化合物、醇醚類化合物、酯類化合物以及胺類化合物有著所需含量少，潤滑效果高的明顯優(yōu)勢。因此，菌株B5代謝產(chǎn)生正十二酸的特點也可以用來緩解清潔柴油潤滑性下降的問題，以減少、甚至移除新配方柴油外源添加潤滑劑的消耗。在實際應(yīng)用時，通過對該菌株烷烴羥化酶系與柴油潤滑的關(guān)聯(lián)性進一步深入研究，使菌株能夠更好地改良柴油以適應(yīng)其潤滑性要求，將會有更理想的效果［28］。

圖4 正十二烷GS-MS分析Fig.4 n-Dodecane analyzed by GS-MS

圖5 正十二醇GC-MS分析Fig.5 n-Dodecanol analyzed by GS-MS

圖6 正十二酸GC-MS分析Fig.6 n-Dodecyl acid analyzed by GS-MS

2.6 菌株鑒定結(jié)果

菌株生理生化鑒定結(jié)果見表1，革蘭氏染色結(jié)果見圖7。根據(jù)圖7的革蘭氏染色結(jié)果(B5菌為革蘭氏陽性菌)以及表1中的生理生化鑒定數(shù)據(jù)，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步推斷該菌為紅平紅球菌。

表1 生理生化特征表Table 1 Physiological and biochemical characters of strain B5

圖7 菌株B5的革蘭氏染色Fig.7 Gram staining of strain B5

菌株B5的生長曲線見圖8。由圖8可以發(fā)現(xiàn):菌株B5生長8 h開始進入對數(shù)期，23 h的時候，菌液濃度不再增加，進入穩(wěn)定期。提取菌株B5對數(shù)生長期細胞的基因組DNA，送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行16 S rRNA基因序列的擴增及測序，所獲序列上傳GenBank進行BLAST分析，再利用MEGA 4.0軟件，依據(jù)B5菌株的16S r RNA基因序列構(gòu)建進化樹并進行分析，結(jié)果見圖9。由圖9可知，與菌株B5同源性最高的菌株是Rhodococcus erythropolis LC107443，兩者16S r RNA基因序列相似性達到99%，因此將B5菌株鑒定為一株紅平紅球菌，并命名為R．erythropolis B5，制作甘油菌－80℃保存待后續(xù)實驗使用。

3 結(jié)論

從加油站進油口的土壤中篩選分離得到一株能有效降解柴油高級烴類的菌株B5，該菌株能在10 d內(nèi)使柴油中芳烴類的含量下降83.4%，且能在7 d內(nèi)，降解柴油中含硫物(DBT)的降解率達到63.0%。同時，該菌株可將柴油中的正構(gòu)烷烴末端羧基化生成羧酸，在柴油清潔化過程中，為保證柴油潤滑性的新型柴油的清潔化工藝提供了基礎(chǔ)。

圖9 菌株B5基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of B5 and reference strains

［1］朱春凱．我國成品油消費首現(xiàn)趨勢性拐點［J］．中國石化，2017 (2):78．

［2］薛永紅．清潔燃油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．石油化工應(yīng)用，2007，26 (5):8-12．

［3］韓夢非，郭斌．霧霾天氣和柴油車尾氣［C］//第八屆全國大氣細及超細粒子技術(shù)研討會暨PM2.5源譜交流會．北京:中國顆粒學(xué)會氣溶膠專業(yè)委員會，2015．

［4］中國環(huán)保產(chǎn)業(yè)編輯部．柴油車排放污染防治技術(shù)政策［J］．中國環(huán)保產(chǎn)業(yè)，2003(2):39-40．

［5］張景成，南軍，于海斌，等．劣質(zhì)餾分油加氫生產(chǎn)清潔柴油的工藝研究［C］//中國化工學(xué)會．廈門:全國工業(yè)催化技術(shù)及應(yīng)用年會，2012．

［6］劉秋，張耀尹，曹雪潔，等．海洋石油降解微生物及其降解機理［J］．微生物學(xué)雜志，2016，36(3):1-6．

［7］KILBANE II J J，JACKOWSKI K．Biodesulfurization of watersoluble coal-derived material by Rhodococcus rhodochrous IGTS8［J］．Biotechnol Bioeng，1992，40(9):1107-1114．

［8］MCFARLAND B L．Biodesulfurization［J］．Curr Opin Microbiol，1999，2(3):257-264．

［9］田貞樂，朱麗華，吳映輝，等．氣相色譜與紫外分光光度法評價石油烴類污染物的微生物降解過程［J］．分析化學(xué)，2006，34(3):343-346．

［10］章儉，夏春谷．芳香烴雙加氧酶的結(jié)構(gòu)與功能研究［J］．化學(xué)進展，2004，16(1):116-122．

［11］KOJIMA Y，ITADA N，HAYAISHI O．Metapyrocatechase:a new catechol-cleaving enzyme［J］．J Biol Chem，1961，236(8): 2223-2228．

［12］高常安，張愛茜，馮峰，等．固相微萃取-液相色譜法測定水中二苯并噻吩［J］．環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2009，32(2):106-108．

［13］馬宏瑞，趙敏，杜戰(zhàn)鵬，等．兩株柴油降解菌的性能研究［J］．化工環(huán)保，2007，27(2):105-108．

［14］黃磊，李丹，孫丹，等．1株低溫石油烴降解菌的分類鑒定及降解特性研究［J］．環(huán)境科學(xué)，2007，28(9):2101-2105．

［15］XIA Y，MIN H，LU Z，et al．Characterization and phylogenetic analysis of a phenanthrene-degrading strain isolated from oilcontaminated soil［J］．J Environ Sci，2004，16(4):589-593．

［16］IIORI M O，AMUND D I．Degradation of anthracene by bacteria isolated from oil polluted tropical soils［J］．Z Naturforsch C， 2000，55(11/12):890-897．

［17］LIU Y，ZHANG J，ZHANG Z．Isolation and characterization of polycyclic aromatic hydrocarbons-degrading Sphingomonas sp．strain ZL5［J］．Biodegradation，2004，15(3):205-212．

［18］孫海波．多環(huán)芳烴降解菌的篩選、鑒定，降解特性及鄰苯二酚-2，3-雙加氧酶的初步研究［D］．濟南:山東大學(xué)，2009．

［19］魏玉霞，肖寶清，閆海，等．二苯并噻吩脫硫微生物菌種的篩選與活性［J］．中國環(huán)境科學(xué)，2006，26(3):311-314．

［20］FUNHOFF E G，BAUER U，GARCA-RUBIO I，et al．CYP153A6，a soluble P450 oxygenase catalyzing terminal-alkane hydroxylation［J］．J Bacteriol，2006，188(14):5220-5227．

［21］范文琴，趙良．影響柴油潤滑性因素初探［J］．高橋石化，2005 (3):1-3．

［22］KAJDAS C K，MAJZNER M．The influence offatty acids and fatty acids mixtures on the lubricity of low-sulfur diesel fuels［J］．SAE Paper，doi:10．4271/2001-01-1929．

［23］ANASTOPOULOS G，LOIS E，KARONIS D，et al．A preliminary evaluation of esters ofmonocarboxylic fatty acid on the lubrication properties of diesel fuel［J］．Ind Eng Chem Res，2000，40(1): 452-456．

［24］ANASTOPOULOS G，LOIS E，ZANNIKOS F，et al．Influence of aceto acetic esters and di-carboxylic acid esters on diesel fuel lubricity［J］．Tribol Int，2001，34(11):749-755．

［25］ANASTOPOULOS G，LOIS E，SERDARI A，et al．Lubrication properties of low-sulfur diesel fuels in the presence of specific types of fatty acid derivatives［J］．Energy Fuels，2000，15(1): 106-112．

［26］ANASTOPOULOS G，LOIS E，SERDARI A，et al．The impact of aliphatic amines and tertiary amides on the lubrication properties of ultra-low sulfur diesel fuels［J］．SAE Tech Paper，DOI:10．4271/2000-01-1916．

［27］ANASTOPOULOS G，LOIS E，ZANNIKOS F，et al．The tribological behavior of alkyl ethers and alcohols in low sulfur automotive diesel［J］．Fuel，2002，81(8):1017-1024．

［28］JEON H J，KIM M N．Functional analysis of alkane hydroxylase system derived from Pseudomonas aeruginosa E7 for low molecular weight polyethylene biodegradation［J］．Int Biodeter Biodegr，2015，103:141-146．

(責(zé)任編輯荀志金)

Isolation and identification of a diesel alkanes degrading bacterium

LYU Qianchuan1，2，WU Yuandong1，2，ZHOU Jun1，2，JIA Honghua1，2，WEI Ping1，ZHENG Tao3，YONG Xiaoyu1，2
(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China; 2.Bioenergy Research Institute，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China;3.Guangzhou Institute of Energy Conversion，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510640，China)

A bacterium with the ability of diesel alkanesdegradation was isolated from the soil sample near gas station with different diesel alkanes as carbon sources and biomass density(OD600)as indicator．High performance liquid chromatography(HPLC)and gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)were used to analyzed the degradation efficiency and the degradation products of the bacterium．The isolated bacterial strain B5 could metabolize and degrade dibenzothiophene and aromatic hydrocarbons，with the degradation efficiency of 63.0%and 83.4%respectively．In addition，the alkyl group at the end of straight-chain alkanes can be transformed into carboxyl group by the strain through carboxylation，which potentially helps to enhance the lubricating performance of diesel．Finally，this strain was identified to be Rhodococcus erythropolis by sequencing the 16S rRNA gene and was named as R.erythropolis B5．

diesel alkanes;straight-chain alkanes;Rhodococcus erythropolis;degrading bacterium

Q945.78

A

1672－3678(2017)04－0057－07

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.010

2017－03－23

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2013CB733904);江蘇省自然科學(xué)基金(BK20130932)

呂乾川(1989—)，男，江蘇南京人，研究方向:生物化工;雍曉雨(聯(lián)系人)，講師，E-mail:yongxiaoyu@njtech．edu．cn