曲酸對(duì)飛蝗酚氧化酶以及其他生化酶活性的影響

李一波，曹廣春，賈 苗，紀(jì)明山

曲酸對(duì)飛蝗酚氧化酶以及其他生化酶活性的影響

李一波1,2，曹廣春2，賈 苗2，紀(jì)明山1*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110866；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

酚氧化酶(Phenoloxidase)可以催化黑色素中間體多巴胺的形成，是昆蟲黑化作用中的關(guān)鍵酶，在昆蟲細(xì)胞免疫和體液免疫過程中發(fā)揮著重要的作用。近年來，酚氧化酶成為新型殺蟲劑靶標(biāo)的研究對(duì)象之一，而酚氧化酶的抑制劑曲酸(Kojic acid)對(duì)昆蟲解毒酶和保護(hù)酶的影響的研究卻很少。為了探索酚氧化酶與昆蟲其他解毒酶或保護(hù)酶類的關(guān)系，本文利用含不同劑量曲酸的麥麩飼喂飛蝗，檢測(cè)飛蝗存活率以及蟲體酚氧化酶(PO)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、解毒酶(ESTs和GSTs)和保護(hù)酶(POD、SOD和CAT)的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，曲酸對(duì)飛蝗無明顯毒力；在曲酸處理1 d和3 d后，曲酸處理組飛蝗PO二酚酶活性顯著低于對(duì)照，5 d和7 d后飛蝗PO活性與對(duì)照相比差異不大；處理3 d后，飛蝗AChE活性顯著低于對(duì)照，而5 d后AChE相比于對(duì)照顯著升高；偏高濃度的曲酸在1 d和3 d后對(duì)飛蝗ESTS和GSTs有顯著的抑制，5 d和7 d后飛蝗ESTs和GSTs活性上升；曲酸在1 d和3 d后引起了飛蝗保護(hù)酶的升高，5 d后飛蝗保護(hù)酶有一定的下降。以上結(jié)果表明，曲酸對(duì)飛蝗PO有明顯抑制作用，同時(shí)也干擾了昆蟲其它生化酶的活性。由此推測(cè)，曲酸可以作為殺蟲劑或者殺蟲真菌的增效劑。

曲酸；飛蝗；酚氧化酶；解毒酶；保護(hù)酶

飛蝗LocustamigratoriaL.是我國分布最廣，危害最大的直翅目Orthoptera飛蝗屬LocustaLinnaeus害蟲(李春選和馬恩波，2003)。2002年飛蝗危害面積218萬hm2，2003-2006年危害面積都在100多萬公頃左右，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失(馮曉東，2007)。近幾年，飛蝗在山西永濟(jì)市、河北黃驊市、遼寧葫蘆島興城和海南都有不同程度大發(fā)生(宋國華等，2009；唐小村和盧芙萍，2009；劉浩升和李耀發(fā)，2010)。飛蝗的防治主要分為化學(xué)防治和生物防治。化學(xué)防治主要是一些高毒低殘留的農(nóng)藥，比如馬拉硫磷和高效氯氰菊酯(張志武和馬楠，2012)。但是，化學(xué)防治的主要問題是害蟲對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生的抗藥性，已有報(bào)道山西和天津等地由于馬拉硫磷的長期使用，飛蝗對(duì)馬拉硫磷的敏感性降低(楊紅軍等，2002；楊美玲，2008)。生物防治中利用殺蟲真菌綠僵菌的高毒力菌株防治飛蝗取得了較大的進(jìn)展(董輝等，2011)。但是，綠僵菌對(duì)飛蝗的防治效果受環(huán)境影響大，并且由于昆蟲自身免疫反應(yīng)，篩選高毒力菌株也十分的不易(高松，1996)。

酚氧化酶(Phenoloxidase)和保護(hù)酶(POD、SOD和CAT)是昆蟲抵抗綠僵菌侵染時(shí)啟動(dòng)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)中重要的酶類(Leclerc and Reichhart, 2004)。酚氧化酶(PO)可以催化黑色素中間體多巴胺的形成，是昆蟲免疫反應(yīng)黑化作用中的關(guān)鍵酶(Lee and Anstee, 1995; S?derh?ll and Cerenius, 1998)。PO平常在昆蟲體內(nèi)以無活性的酚氧化酶原(proPO)存在，必要時(shí)proPO就會(huì)被激活變成有活性的PO(Cerenius and S?derh?ll, 2004)。另外，殺蟲真菌還會(huì)引起昆蟲活性氧等毒性分子(O2-和H2O2)的生成，這些毒性分子對(duì)昆蟲本身也有毒害，所以昆蟲利用自身的保護(hù)酶(POD、SOD和CAT)來清除這些毒性分子(Kohchietal., 2009)。如超氧化物歧化酶(SOD)可以清除O2-，過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)可以使H2O2變?yōu)闊o毒的H2O(Robinson and Badwey, 1994)。在昆蟲抵抗綠僵菌的過程中發(fā)現(xiàn)，沙漠蝗Schistocercagregaria在被綠僵菌侵染的過程中，沙漠蝗體內(nèi)PO活性降低，而proPO活性升高(Gillespieetal., 2000)；而在綠僵菌侵染飛蝗后，可以引起飛蝗體內(nèi)PO活性的升高(Mullen and Goldsworthy, 2006)；綠僵菌還會(huì)引起大蠟螟GalleriamellonellaL.體內(nèi)全脂酶(ESTs)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的升高(Serebrovetal., 2006)；同時(shí)在綠僵菌侵染昆蟲中，昆蟲體內(nèi)氧化壓力的增加也會(huì)導(dǎo)致保護(hù)酶(POD、SOD和CAT)活性的升高(Sree and Padmaja, 2008)。

乙酰膽堿酯酶(AChE)和解毒酶是昆蟲對(duì)有機(jī)磷等農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性的關(guān)鍵酶類。有機(jī)磷農(nóng)藥的作用靶標(biāo)是AChE，昆蟲對(duì)此類農(nóng)藥抗藥性的產(chǎn)生，AChE的修飾或者改變是關(guān)鍵的考慮因素(Fournier and Mutero, 1994)。研究發(fā)現(xiàn)，飛蝗對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的抗藥性是因?yàn)轱w蝗體內(nèi)AChE對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性降低(Maetal., 2004；Yangetal., 2008)。另外，昆蟲抗藥性的產(chǎn)生還與昆蟲體內(nèi)解毒酶有關(guān)。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)可以把還原型谷胱甘肽(GSH)結(jié)合到農(nóng)藥的親電子中心，它介導(dǎo)的抗藥性農(nóng)藥種類主要是有機(jī)磷類、有機(jī)氯類和擬除蟲菊酯類(Lietal., 2007)。全脂酶(ESTs)可以催化脂健水解，它針對(duì)的農(nóng)藥種類主要是有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類(Terriere, 1984)。研究發(fā)現(xiàn)，飛蝗對(duì)馬拉硫磷的抗藥性與飛蝗GSTs和ESTs活性有關(guān)(Heetal., 2004；Qinetal., 2011)。

曲酸(Kojic acid)是PO的抑制劑，它是一種從殺蟲真菌提取的一種真菌毒素(Sarunoetal., 1979)。研究發(fā)現(xiàn)，曲酸可以抑制鱗翅目昆蟲PO活性(Dowd, 1999)，如小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(Wangetal., 2003)、甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner(Gaoetal., 2003)和?；页嵋苟闟podopteralittoralis(Lee and Anstee, 1995)。但是，曲酸對(duì)其他昆蟲PO的影響，以及曲酸對(duì)昆蟲其他生化酶影響的研究較少。本文利用PO的抑制劑曲酸處理飛蝗，并檢測(cè)1、3、5和7 d后飛蝗存活率以及體內(nèi)PO、解毒酶(ESTs和GSTs)和保護(hù)酶(POD、SOD和CAT)等生化酶活性的變化，明確曲酸對(duì)飛蝗免疫相關(guān)酶的影響，為曲酸可能作為化學(xué)農(nóng)藥或殺蟲真菌的增效劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

飛蝗最初的蝗卵卵囊采集于河北滄州，之后在室內(nèi)條件下純化傳代培養(yǎng)，擴(kuò)大種群，期間未接觸任何化學(xué)和生物藥劑。蝗卵的孵化是在人工氣候培養(yǎng)箱中，孵化溫度和濕度分別為30℃±2℃、60%±5% RH。7 d左右，將孵化出的蝗蝻置于長寬高分別為60 cm、50 cm、70 cm的養(yǎng)蟲籠中以麥麩和新鮮的小麥苗飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為30℃±2℃，光照時(shí)間為14 h。

1.2 供試試劑與儀器

曲酸(Kojic acid)購自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；鄰苯二酚、CDNB(1-氯-2,4-二硝基苯)、DTNB(5,5-二硫雙(2-硝基苯甲酸))、DCNB(1,2-二氯-4-硝基苯)、ATChI(碘化硫代乙酰膽堿)、和考馬斯亮藍(lán)G-250購自sigma公司；α-NA(乙酸-1-萘酯)購自Amresco公司；牛血清蛋白、固藍(lán)RR鹽、GSH(還原型谷胱甘肽)購自Solarbio公司。保護(hù)酶(POD、SOD和CAT)測(cè)定試劑盒購自于南京建成生物科技公司。

主要儀器有3K15型冷凍離心機(jī)(Sigma)、VERSAmax型酶標(biāo)儀(MDC)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藥劑處理

本試驗(yàn)所用試蟲為3齡蝗蝻，分別設(shè)1個(gè)對(duì)照和5個(gè)處理，8次重復(fù)(其中5個(gè)重復(fù)用于記錄死亡率，另外3個(gè)重復(fù)用于酶活取樣)，每個(gè)重復(fù)所用蝗蝻15頭。所用試劑(曲酸)溶于無菌水，然后與麥麩拌勻，稱為“含藥麥麩”，用于飼喂處理組蝗蝻。無菌水與麥麩質(zhì)量比1∶1混勻，稱為“無藥麥麩”，用于飼喂對(duì)照組蝗蝻。濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)(Chenetal., 1991)，與麥麩混勻后的含量為8%、4%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.01%。試驗(yàn)前一天，分別把蝗蝻置于塑料筐(長×寬×高：27×16×12 cm)內(nèi)，用玻璃板蓋住，并饑餓處理。在試驗(yàn)的第一天，對(duì)照組的蝗蝻被飼喂“無藥麥麩”，處理組的蝗蝻被飼喂“含藥麥麩”，1 d后，對(duì)照和處理組的蝗蝻都分別飼喂新鮮的麥苗。之后，記錄每天的死亡率，并分別在1 d、3 d、5 d和7 d后取樣，用于酶活測(cè)定。

1.3.2 酶液制備

取不同處理的試蟲置于勻漿器中，加入適量的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(1頭3齡蝗蝻用緩沖液約1.5 mL)，冰浴勻漿2-3 min。測(cè)定不同酶所用勻漿緩沖液pH不同(全脂酶：1.5 mL PBS(含0.1% TritonX-100)，pH7；乙酰膽堿酯酶和酚氧化酶：1.5 mL PBS，pH7；保護(hù)酶(SOD、POD和CAT)：1.5 mL PBS，pH7.3；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶：1.5 mL PBS，pH7.5)。然后，取勻漿液1 mL，在4℃、15000 rpm條件下離心10 min。之后，取上清液置于新的離心管中，再次以4℃、15000 rpm離心20 min。最后取上清液用于酶活和蛋白含量測(cè)定。

1.3.3 酶活性測(cè)定

全脂酶(ESTs)活性測(cè)定方法(Hanetal., 1998)：此方法中與酶液反應(yīng)底物為α-NA，顯色劑為固藍(lán)RR鹽。在加樣之前，分別把10 mg α-NA 和20 mg的固藍(lán)RR溶于1 mL丙酮，然后分別取200 μL加入0.1 mol/L pH=7.0磷酸鹽緩(PBS)沖液，并定容至8 mL，過濾后備用。加樣時(shí)，依次加入90 μL PBS，200 μL底物與顯色劑的混合液和10 μL 酶液，然后置于酶標(biāo)儀中，在450 nm 波長下，每25 s記錄一次光密度值，記錄10 min，反應(yīng)溫度37℃。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性測(cè)定方法(Oppenoorth and Welling，1976)：此方法中與酶液反應(yīng)底物有兩種，分別為CDNB和DCNB。當(dāng)CDNB為底物時(shí)，依次在酶標(biāo)板中加入90 μL PBS，10 μL酶液，100 μL 1.2 mmol/L CDNB和100 μL 6 mmol/L GSH；當(dāng)DCNB為底物時(shí)，依次在酶標(biāo)板中加入50 μL酶液，100 μL 1.2 mmol/L DCNB和100 μL 6 mmol/L GSH。最后，分別置于340 nm波長下，每25 s記錄一次光密度值，記錄10 min，反應(yīng)溫度27℃。

乙酰膽堿酯酶(AChE)活性測(cè)定方法(Hanetal., 1998)：此方法中與酶液反應(yīng)底物為ATChI。加樣過程中，依次為50 μL 0.1 mol/L PBS、50 μL酶液、100 μL 45 μmol/L DTNB和100 μL 1.5 mmol/L ATChI。最后置于405 nm波長下，每30 s記錄一次光密度值，記錄40個(gè)值，重復(fù)3次，反應(yīng)溫度27℃。

酚氧化酶(PO)活性測(cè)定方法(Luo and Xue, 2010)：此方法與酶液反應(yīng)底物為鄰苯二酚。在酶標(biāo)板孔中依次加入180 μL 10 mmol/L鄰苯二酚溶液與20 μL酶液，在420 nm波長下，記錄1 h內(nèi)OD值變化。

保護(hù)酶(SOD、POD和CAT)測(cè)定按試劑盒說明書測(cè)定。上述數(shù)據(jù)使用酶標(biāo)儀自帶的Softmax Pro 6.1軟件處理。

1.3.4 蛋白含量測(cè)定

蛋白含量用Bradford方法測(cè)定(Bradford, 1976)，牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)不同濃度處理飛蝗的存活率和各種生化酶活性進(jìn)行單因素方差分析，利用SPASS中One-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 曲酸對(duì)飛蝗存活率的影響

試驗(yàn)表明(圖1)，曲酸對(duì)飛蝗毒力很低，飛蝗的存活率在85%以上，與對(duì)照無顯著差異(P<0.05)。

圖1 不同濃度曲酸對(duì)飛蝗存活率的影響Fig.1 The survival rate of Locusta migratoria after Kojic acid treatment

2.2 曲酸對(duì)飛蝗酚氧化酶的影響

曲酸處理飛蝗1 d后，濃度為0.1%、4%和8%曲酸處理后的飛蝗體內(nèi)PO活性相對(duì)于對(duì)照顯著下降(P<0.05)，其他處理組與對(duì)照無顯著差異；3 d后，濃度為0.1%、1%、2%、4%和8%處理后的PO活性顯著低于對(duì)照(P<0.05)；5 d后，除0.01%、0.1%、0.5%和2%相比對(duì)照無顯著差異以外，其他處理的PO相比于對(duì)照活性增高(P<0.05)；7 d后，除0.5%的PO活性顯著高于對(duì)照，1% PO活性顯著低于對(duì)照外，其他處理的PO活性與對(duì)照無顯著差異(P<0.05)(表1)。總的來說，曲酸處理后，飛蝗在前期(1、3 d)的活性受到很強(qiáng)的抑制，5 d后PO活性升高并在7 d后趨于平穩(wěn)。

表1 不同濃度曲酸對(duì)飛蝗體內(nèi)酚氧化酶的影響Table 1 The activity of PO in Locusta migratoria after Kojic acid treatment

注：表中數(shù)據(jù)均是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異顯著性(P<0.05)，小寫字母代表縱向比。Note: Means within a vertical column indicated by different lowercase letters are significantly difference (P<0.05).

2.3 曲酸對(duì)飛蝗乙酰膽堿酯酶的影響

曲酸處理飛蝗1 d后，0.01%、0.5%和1%處理組飛蝗體內(nèi)AChE活性相比于對(duì)照顯著升高，而0.1%和2%處理組的AChE活性相比于對(duì)照顯著下降(P<0.05)；3 d后，除0.5%處理組飛蝗AChE活性顯著高于對(duì)照外，0.1%、1%、2%和4%處理組的飛蝗體內(nèi)AChE活性顯著低于對(duì)照(P<0.05)；特別是5 d后，所有處理組飛蝗體內(nèi)AChE活性相比于對(duì)照均顯著升高(P<0.05)，而7 d后，0.01%、0.5%、4%和8%處理組飛蝗體內(nèi)AChE的活性顯著高于對(duì)照(P<0.05)，其他處理組飛蝗AChE的活性與對(duì)照無顯著差異。總的來說，曲酸處理飛蝗后，飛蝗體內(nèi)AChE的活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)。

表2 不同濃度曲酸對(duì)飛蝗體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的影響Table 2 The activity of AChE in Locusta migratoria L.after Kojic acid treatment

注：表中數(shù)據(jù)均是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異顯著性(P<0.05)，小寫字母代表縱向比。Note: Means within a vertical column indicated by different lowercase letters are significantly difference (P<0.05).

2.4 曲酸對(duì)飛蝗解毒酶的影響

不同濃度的曲酸處理飛蝗1 d后，除0.5%處理組ESTs活性與對(duì)照無顯著差異外，其他處理組飛蝗ESTs活性均顯著低于對(duì)照(P<0.05)；3 d后，除0.5%處理組ESTs活性顯著高于對(duì)照外，其他組處理組飛蝗ESTs活性相比于對(duì)照顯著下降(P<0.05)；5 d后，處理組(0.01%、0.1%和0.5%)的ESTs活性顯著升高，其他與對(duì)照無顯著差異(P<0.05)；7 d后，處理組(0.01%、0.5%和4%)的ESTs活性相比于對(duì)照顯著升高，而1%和8%處理組ESTs活性顯著低于對(duì)照，其他處理組與對(duì)照無顯著差異(P<0.05)(圖2(A))。

由圖2(B)所示的是飛蝗體內(nèi)底物為CDNB的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的活性變化。在曲酸處理飛蝗1 d后，0.1%、2%和8%處理組的飛蝗GSTs/CDNB的活性顯著低于對(duì)照，而4%處理的飛蝗GSTs/CDNB活性顯著高于對(duì)照，其他處理的GSTs/CDNB活性與對(duì)照無顯著差異(P<0.05)；3 d后，只有2%處理組的飛蝗GSTs/CDNB活性顯著低于對(duì)照，0.01%、0.1%和0.5%處理組飛蝗的GSTs/CDNB活性相比于對(duì)照顯著升高；5 d后，除4%處理組GSTs/CDNB活性高于對(duì)照，0.1%處理與對(duì)照無顯著差異外，其他處理組飛蝗GSTs/CDNB活性均顯著低于對(duì)照(P<0.05)；7 d后，除2%處理飛蝗的GSTs/CDNB活性顯著低于對(duì)照，0.1%和0.05%處理的GSTs/CDNB活性與對(duì)照無差異外，其他處理組的GSTs/CDNB活性均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。

由圖2(C)所示的是飛蝗體內(nèi)底物為DCNB的GSTs的活性變化。在曲酸處理飛蝗1 d后，0.01%處理飛蝗的GSTs/DCNB活性顯著高于對(duì)照，0.1%、0.5%、2%和8%處理組飛蝗GSTs/DCNB活性顯著低于對(duì)照，其他處理無顯著差異(P<0.05)；3 d后，0.01%和0.5%處理飛蝗的GSTs/DCNB活性顯著高于對(duì)照，而2%、4%和8%處理組的GSTs/DCNB活性顯著低于對(duì)照，其他處理無顯著差異(P<0.05)；5 d后，只有2%處理飛蝗的GSTs/DCNB活性顯著低于對(duì)照，0.01%、0.1%和4%處理組的GSTs/DCNB活性顯著高于對(duì)照(P<0.05)；7 d后，只有2%處理飛蝗的GSTs/DCNB活性顯著低于對(duì)照，4% GSTs/DCNB活性顯著高于對(duì)照，其他處理與對(duì)照相比無顯著差異(P<0.05)。

圖2 不同濃度曲酸對(duì)飛蝗解毒酶的影響Fig.2 The activities of detoxification enzymes in Locusta migratoria L.after Kojic acid treatment注：解毒酶活性是處理組酶活與對(duì)照組酶活的比值。其中CDNB和DCNB代表的是測(cè)定GSTs時(shí)所用的底物。Note: The value of ordinate represents the enzymes activities of treatment group divided by control group.CDNB and DCNB are the substrates of GSTs, respectively.

2.5 曲酸對(duì)飛蝗保護(hù)酶的影響

不同濃度曲酸處理飛蝗后，保護(hù)酶的活性變化如圖3所示。

由圖3(A)所示，0.1%、2%、4%和8%曲酸在處理飛蝗1 d后，體內(nèi)POD活性顯著低于對(duì)照，0.01%和1%處理飛蝗的POD活性顯著高于對(duì)照(P<0.05)；3 d后，除1%和2%的POD活性與對(duì)照無差異，0.1%處理的飛蝗POD活性顯著低于對(duì)照外，其他處理組的飛蝗POD活性均顯著高于對(duì)照(P<0.05)；5 d后，除4%和0.01%以外，其他處理組POD活性均顯著低于對(duì)照(P<0.05)；7 d后，除0.01%的POD高于對(duì)照外，其他處理組POD活性與對(duì)照組無顯著差異(P<0.05)。

由圖3(B)所示，0.1%、4%和8%曲酸處理飛蝗1 d后，體內(nèi)SOD活性顯著下降，而0.01%、0.5%和1%處理的SOD活性顯著高于對(duì)照(P<0.05)；3 d后，0.1%和2%處理的飛蝗SOD活性顯著低于對(duì)照，0.5%和1%處理的SOD活性顯著高于對(duì)照，其他處理與對(duì)照無顯著差異(P<0.05)；5 d后，除8%處理的SOD與對(duì)照無差異，0.01%和4%處理組SOD活性顯著高于對(duì)照外，其他處理組飛蝗SOD均顯著低于對(duì)照(P<0.05)；7 d后，除0.1%的SOD活性顯著對(duì)照，0.01%和1%無差異外，其他處理組SOD均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。

由圖3(C)所示，不同濃度處理飛蝗后，體內(nèi)CAT的活性在1、3和7 d后與對(duì)照差異不大；第5 d，0.1%、2%和8%處理的飛蝗CAT活性顯著低于對(duì)照，而0.01%和0.5%處理的CAT活性顯著高于對(duì)照，其他處理與對(duì)照無顯著差異(P<0.05)。

圖3 不同濃度曲酸對(duì)飛蝗保護(hù)酶的影響Fig.3 The activity of antioxidant enzymes in Locusta migratoria L.after Kojic acid treatment注：保護(hù)酶活性是處理組酶活與對(duì)照組酶活的比值。Note: The value of ordinate represents the enzymes activities of treatment group divided by control group.

3 結(jié)論與討論

曲酸(Kojic acid)是一種真菌毒素，它是許多殺蟲真菌如曲霉菌Aspergillus和青霉菌Penicillium的代謝產(chǎn)物(Sarunoetal., 1979)。最初人們期望這種真菌毒素可以發(fā)展成為殺蟲劑，但是之后證明它對(duì)臭蟲、果蠅、蚊子等急性毒力很低，無法滿足殺蟲劑的標(biāo)準(zhǔn)(Beard and Walton, 1969)。在對(duì)豆莢草盲蝽Lygushesperus的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，每天對(duì)豆莢草盲蝽飼喂含500 mg/L、1000 mg/L和1500 mg/L曲酸的飼料，直到26 d之后，成蟲的存活率分別為94%、77%和81%(Alverson, 2003)。而在對(duì)草地貪夜蛾和玉米夜蛾的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，25 mg/L的曲酸對(duì)它們的毒力為零(Dowd, 1988a)。從本試驗(yàn)也可以看出，僅飼喂一天含曲酸的飼料，曲酸對(duì)飛蝗無明顯的毒力，這與上述研究結(jié)果類似。由此可見，曲酸對(duì)昆蟲的毒殺作用很弱，其本身并不適合直接作為殺蟲劑進(jìn)行應(yīng)用。

曲酸(Kojic acid)是一種酚氧化酶(PO)的抑制劑。曲酸可以抑制從植物、甲殼類動(dòng)物和昆蟲提取出的酶液中的酚氧化酶活性(Chenetal., 1991; Dowd, 1999)。對(duì)于昆蟲來說，曲酸對(duì)PO的抑制作用的研究在鱗翅目中較多。離體條件下，從小菜蛾P(guān).xylostella和甜菜夜蛾S.exigua整個(gè)蟲體粗提取的酚氧化酶在測(cè)定時(shí)加入曲酸后，明顯看出酚氧化酶的單酚酶和二酚酶活性下降(Gaoetal., 2003; Wangetal., 2003)；海灰翅夜蛾S.littoralis的血淋巴內(nèi)的PO活性也受到曲酸的抑制作用(Lee and Anstee, 1995)。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，飛蝗取食含曲酸的麥麩后，蟲體內(nèi)PO的二酚酶活性在1 d和3 d后顯著下降，這與鱗翅目昆蟲中結(jié)果相似。不同的是本試驗(yàn)證明了在活體飼喂條件下，曲酸對(duì)飛蝗PO活性也有抑制作用。

乙酰膽堿酯酶(AChE)是生物體神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵酶(Toutant, 1989)，它同時(shí)又是有機(jī)磷農(nóng)藥的作用靶標(biāo)，昆蟲對(duì)此類農(nóng)藥抗藥性的產(chǎn)生，乙酰膽堿酯酶的修飾或者改變是關(guān)鍵的考慮因素(Fournier and Mutero, 1994)。有研究表明，曲酸可以抑制哺乳動(dòng)物的膽堿酯酶(Giroiretal., 1991)。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)曲酸處理后的1 d和3 d飛蝗體內(nèi)AChE活性降低。乙酰膽堿酯酶的活性可以被銅離子螯合物抑制(Mario, 1965)，而王樹棟等人發(fā)現(xiàn)曲酸抑制PO的作用機(jī)制可能是因?yàn)榍崤cPO內(nèi)銅集團(tuán)的結(jié)合(王樹棟等，2004)。因此，我們推測(cè)飛蝗體內(nèi)AChE活性被曲酸抑制也可能是由于曲酸與銅離子結(jié)合的緣故。

昆蟲解毒酶(GSTs、ESTs)可以代謝對(duì)昆蟲有害的外源性物質(zhì)，昆蟲對(duì)農(nóng)藥的抗藥性的產(chǎn)生也與解毒酶相關(guān)(Oppenoorth and Welling, 1976; Hanetal., 1998)。曲酸可以作為擬除蟲菊酯類和氨基甲酸酯類殺蟲劑防治玉米夜蛾Heliothiszea和草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda的增效劑，因?yàn)樗绊懤ハx氧化酶活性(Dowd, 1990)；另外研究發(fā)現(xiàn)曲酸可以阻止CDNB結(jié)合到谷胱甘肽上(Dowd, 1988b)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高濃度曲酸對(duì)飛蝗ESTs和GSTs在前期都有很強(qiáng)的抑制作用。這可能與曲酸本身與酶活底物的作用有關(guān)。昆蟲保護(hù)酶(POD、SOD和CAT)可以清除昆蟲體內(nèi)氧化毒性分子，如超氧根離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)，昆蟲保護(hù)酶活性的升高代表昆蟲所受到了氧化壓力(Kohchietal., 2009)。本試驗(yàn)中，偏低濃度的曲酸引起了飛蝗POD和SOD活性的升高可能是由于曲酸造成了飛蝗的氧化壓力。而偏高濃度曲酸在對(duì)飛蝗POD和SOD還有一定的抑制作用，可能是因?yàn)榍岜旧砜梢宰柚股矬w的氧化解毒作用(Mullin and Scott, 1992)。

近年來，酚氧化酶(PO)成為新型殺蟲劑靶標(biāo)的研究對(duì)象之一。而它的抑制劑曲酸對(duì)昆蟲其他生化酶的研究卻很少。本文研究表明，曲酸本身對(duì)飛蝗毒力不高。但是，曲酸可以抑制飛蝗PO的活性，并且還對(duì)飛蝗AChE、解毒酶和保護(hù)酶有一定的抑制作用，這說明曲酸可能干擾昆蟲的免疫系統(tǒng)。曲酸對(duì)飛蝗AChE、和解毒酶的抑制作用，可作為有機(jī)磷類殺蟲劑防治飛蝗的增效劑；另外，曲酸對(duì)飛蝗免疫系統(tǒng)中酚氧化酶和保護(hù)酶的抑制作用，推測(cè)其可以作為殺蟲真菌的增效劑。所以，本研究為曲酸可能成為殺蟲真菌的一種增效劑提供理論基礎(chǔ)。

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The effects of kojic acid on the activities of phenoloxidase and other biochemical enzymes ofLocustmigratoriaL.

LI Yi-Bo1,2, CAO Guang-Chun2, JIA Miao2, JI Ming-Shan1*

(1.College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China.)

Phenoloxidase (PO) catalyses the oxidation of phenols to quinones, which then will polymerize nonenzymatically to melanin.Therefore PO plays a pivotal role in melanisation reactions in the innate immune system of insects.In recent years, PO has been studied as a new target of insecticides.But few researches have looked at the effects of kojic acid which is an inhibitor of PO on detoxification enzymes and antioxidant enzymes in insects.To investigate the relationship between PO and other biological enzymes of insects, the activities of PO, acetylcholinesterase (AChE), general esterases (ESTs), glutathione-S-transferases (GSTs), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were assayed afterLocustamigratoriaL.were treated with kojic acid.PO, AChE, ESTs and GSTs activities decreased in the kojic acid-treatedL.migratoriain comparison with control after 1, 3 d.POD, SOD and CAT activities increased after 3 d and decreased after 5 d in comparison with control.The results indicated that kojic acid showed inhibitory effects on PO and other biochemical enzymes ofL.migratoriaand kojic acid may be a synergist for chemical and biological insecticides.

Kojic acid;LocustamigratoriaL.; phenoloxidase; detoxification enzymes; antioxidant enzymes

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國家自然科學(xué)基金(31471824)

李一波，男，1990年生，山西晉城人，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥毒理學(xué)，E-mail: liyibo373@163.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail: jimingshan@163.com

Received: 2016-04-05; 接受日期Accepted: 2016-05-12

Q965;S433.2

A

1674-0858(2017)03-0640-10