溫度對(duì)中華真地鱉生長(zhǎng)發(fā)育及酶保護(hù)活性的的影響

王彥陽(yáng)，梁廣文

溫度對(duì)中華真地鱉生長(zhǎng)發(fā)育及酶保護(hù)活性的的影響

王彥陽(yáng)1，梁廣文2*

(1.江門職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 廣東江門 529090; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510640)

為了闡明溫度對(duì)中華真地鱉EupolyphagasinensisWalker.各蟲態(tài)存活率、發(fā)育歷期、卵孵化率的影響，及溫度對(duì)中華真地鱉保護(hù)酶活性的影響，分別測(cè)定了中華真地鱉在不同溫度(18℃，22℃，26℃，30℃和34℃) 下飼養(yǎng)對(duì)存活率、發(fā)育歷期、卵孵化率，及保護(hù)酶活性的影響。結(jié)果顯示，溫度對(duì)中華真地鱉的存活率和發(fā)育歷期有顯著影響，在18℃、22℃、26℃、30℃下中華真地鱉存活率分別為0.45、0.49、0.55、0.56，顯著高于在34℃下0.27的存活率(df=4，20；F=7.414；P=0.001)。相同溫度下雌性若蟲期發(fā)育歷期大于雄性若蟲期發(fā)育歷期。在這5個(gè)溫度下，卵期分別為74.6，65.9，53.3，44.5，39.4 d(F=24.251；df=4，20；P<0.05)；雌蟲世代發(fā)育歷期分別為286.2，258.6，228.2，198.6，182.5 d(F=72.846；df=4，20；P<0.05)；雄蟲世代發(fā)育歷期分別為263.3，232.6，216.2，186.4，169.3 d(F=38.332；df=4,20；P<0.05)。中華真地鱉體內(nèi)存在著清除自由基的SOD、POD、CAT保護(hù)酶系統(tǒng)，且不同溫度飼養(yǎng)對(duì)保護(hù)酶POD、SOD活性、CAT的活性有明顯的影響(P< 0.05)，其中CAT活性在26℃最高，在34℃最低；POD活性在26℃和30℃下最高，在34℃下最低；SOD活性在30℃下最高。結(jié)合發(fā)育歷期、存活率和卵孵化率考慮，26℃和30℃可做為人工大規(guī)模飼養(yǎng)的參考溫度。

中華真地鱉；溫度；存活率；發(fā)育歷期；保護(hù)酶

中華真地鱉EupolyphagasinensisWalker是《中華人民共和國(guó)藥典》 記載的藥材(崔月梨，1990)，該蟲喜愛群居飼養(yǎng)土中，其化學(xué)成分及藥理作用顯示出重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值(周彥鋼等，1997，1998；王林瑤等，2000；唐慶峰等，2004；王彥陽(yáng)等，2012)。溫度是影響昆蟲生命活動(dòng)最重要的因素，外界溫度波動(dòng)會(huì)引起昆蟲包括新陳代謝在內(nèi)的一系列生理生化反應(yīng)，通常直接影響昆蟲的存活、發(fā)育、繁殖和種群擴(kuò)散等(景曉紅等，2004； Maistrelloetal.，2006； Kocmánkováetal.，2010；P?yryetal.，2011；尚小麗等，2013；陶淑霞等，2014)。此前有過關(guān)于溫度對(duì)中華真地鱉影響的報(bào)道，但不夠系統(tǒng)和完整。金濤等(2006)和胡玉偉等(2008)報(bào)道了溫度對(duì)中華真地鱉的生長(zhǎng)發(fā)育、行為及進(jìn)化途徑都會(huì)產(chǎn)生很大影響，并且中華真地鱉不同地理種群間在形態(tài)和生物學(xué)上均有一定的差異，在食料充足的條件下，適當(dāng)加溫可增加中華真地鱉體重，減少死亡率，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用。

本文主要研究溫度對(duì)中華真地鱉卵孵化率、各蟲態(tài)存活率、發(fā)育歷期的影響，以及溫度對(duì)中華真地鱉保護(hù)酶活性的影響，試圖揭示在由高到低連續(xù)變化的溫度范圍內(nèi)中華真地鱉的發(fā)育情況，為中華真地鱉大量飼養(yǎng)技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 中華真地鱉實(shí)驗(yàn)種群的建立

中華真地鱉以飼養(yǎng)土為介質(zhì)，屬于雜食性昆蟲，卵的發(fā)育起點(diǎn)溫度為13.2℃(金濤等，2005)，可用土壤配置含一定比例有機(jī)物作為飼養(yǎng)基質(zhì),在表面撒食料喂食(金濤等，2007)，經(jīng)過多次蛻皮才能從若蟲成長(zhǎng)為成蟲，在其生長(zhǎng)發(fā)育過程中，其腹寬、體長(zhǎng)、體重的變化存在一定的規(guī)律(劉靜等，2005)。

供試蟲源：人工飼養(yǎng)蟲源由湖北襄樊長(zhǎng)運(yùn)中華真地鱉養(yǎng)殖基地提供，帶回實(shí)驗(yàn)室于溫度20℃-30℃、RH 50%-70%條件下用80 cm×100 cm飼養(yǎng)池飼養(yǎng)并建立種群備用。

實(shí)驗(yàn)儀器以及溫度設(shè)置：試驗(yàn)在人工氣候箱中進(jìn)行，氣候箱型號(hào)RXZ300多段智能人工氣候箱，溫度靈敏度為±0.5℃。溫度設(shè)置為18℃，22℃，26℃，30℃，34℃共五個(gè)溫度梯度，相對(duì)濕度為75%±5%，光照為L(zhǎng)∶D=12∶12。

1.2 溫度對(duì)若蟲存活率的影響

根據(jù)對(duì)中華真地鱉若蟲分齡的方法(劉靜等，2005)，按不同生長(zhǎng)期將供試中華真地鱉分為1-7齡若蟲及成蟲。分別從飼養(yǎng)池內(nèi)挑取六肢齊全、身體光澤、行為活潑的若蟲各齡100頭，同一齡期若蟲于裝有土壤有標(biāo)記編號(hào)的塑料盒內(nèi)飼養(yǎng)。土表放一小塊方形塑料薄膜，薄膜上放飼料，飼料配方參照王林瑤等方法(王林瑤等，2000)，盒口周圍上用塑料膜封邊，防止爬出。每個(gè)組分進(jìn)行5個(gè)重復(fù)，放入溫度設(shè)置為18℃，22℃，26℃，30℃，34℃恒溫箱內(nèi)飼養(yǎng)。每日定時(shí)觀察，并加水和飼料，連續(xù)觀察15 d后轉(zhuǎn)移至25℃人工氣候箱中飼養(yǎng)24 h后，重復(fù)5次，以毛筆輕觸會(huì)動(dòng)為判斷為存活，統(tǒng)計(jì)存活率。另取剛孵化出的若蟲100頭，放入溫度設(shè)置為18℃，22℃，26℃，30℃，34℃恒溫箱內(nèi)飼養(yǎng)至成蟲，每個(gè)溫度重復(fù)5次，統(tǒng)計(jì)存活率。

1.3 溫度對(duì)各蟲態(tài)發(fā)育歷期的影響

按不同生長(zhǎng)期將供試中華真地鱉蟲分為1-7齡若蟲及成蟲。從飼養(yǎng)池內(nèi)挑取各齡若蟲各5頭，各個(gè)齡期用毛筆隨機(jī)染色標(biāo)記1頭若蟲，將若蟲分別放入溫度設(shè)置為18℃，22℃，26℃，30℃，34℃恒溫箱內(nèi)飼養(yǎng)至標(biāo)記過的若蟲成長(zhǎng)到下一齡期，記錄標(biāo)記若蟲的發(fā)育歷期。卵發(fā)育歷期=孵化日期-產(chǎn)卵日期。重復(fù)5次。

將卵鞘與孵化土按1∶1混合放入飼養(yǎng)盆內(nèi)，在溫度設(shè)置為18℃，22℃，26℃，30℃，34℃共五個(gè)溫度梯度的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行孵化。孵化后在原溫度下飼養(yǎng)至成蟲，記錄從孵化到成蟲的發(fā)育歷期，設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.4 中華真地鱉在不同溫度下孵化率

從干土中保存的卵塊中抽取200粒，分為5組，各組與孵化土混合放入飼養(yǎng)盆內(nèi)，在溫度設(shè)置為18℃，22℃，26℃，30℃，34℃五個(gè)溫度梯度的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行孵化；從第1粒卵塊孵化起，每天記載卵的孵化情況，連續(xù)記錄100 d，若仍未孵化，則認(rèn)為卵塊不能孵化，統(tǒng)計(jì)孵化率，重復(fù)5次。

1.5 溫度對(duì)中華真地鱉保護(hù)酶活性的影響

酶液制備：取供試中華真地鱉若蟲在18、22、26、30、34℃下飼養(yǎng)30 d，準(zhǔn)確測(cè)定每個(gè)溫度下5頭蟲體濕重,用高通量組織研磨器(MY-10) 在冰浴中勻漿，加600 μL 的生理鹽水(0.9% NaCl溶液)搖勻，制備成組織勻漿，2500 r/min離心10 min后，取上清液進(jìn)行酶活性的測(cè)定。保護(hù)酶活性的測(cè)定: 采用 CAT，POD和SOD 標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(南京建成公司)，并按說明書分別進(jìn)行定量測(cè)定。重復(fù)測(cè)定3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

發(fā)育速率與溫度間的關(guān)系常用Logistic方程來擬合，擬合方程為：V=K0/(1+exp(a-r*T))，其中V為發(fā)育速率，K0為最大發(fā)育速率，a、r為模型參數(shù)，T為溫度。用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，卵孵化率、存活率經(jīng)過反正弦轉(zhuǎn)換，用One-Way ANOVA 進(jìn)行方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)各處理間的差異，顯著水平P=0.05，表中具有不同英文小寫字母表示差異顯著。用Excel 2000作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)中華真地鱉各蟲態(tài)的存活率的影響

表1顯示，5個(gè)不同溫度除對(duì)中華真地鱉1齡期、2齡期、4齡期及以上若蟲有顯著影響(P<0.05)，而對(duì)3齡若蟲的存活率影響不顯著(df=4，20；F=0.209；P=0.930)。中華真地鱉若蟲在18℃、22℃、26℃、30℃下存活率分別為0.45、0.49、0.55、0.56，顯著高于在34℃下0.27的存活率。(df=4，20；F=7.414；P=0.001)。

2.2 不同溫度下中華真地鱉的發(fā)育歷期

5種溫度下中華真地鱉的發(fā)育歷期表明(表2)，溫度對(duì)各蟲態(tài)發(fā)育歷期長(zhǎng)短影響顯著。在18℃，22℃，26℃，30℃和34℃ 5個(gè)試驗(yàn)溫度下，隨著溫度的上升各歷期逐漸縮短；其中卵的發(fā)育分別是74.6，65.9，53.3，44.5，39.4 d(F=24.251；df=4，20；P<0.05)，雌蟲的發(fā)育歷期分別是286.2，258.6，228.2，198.6，182.5(F=72.846；df=4，20；P<0.05)，雄蟲的發(fā)育歷期分別是263.3，232.6，216.2，186.4，169.3(F=38.332；df=4,20；P< 0.05)。

2.3 不同溫度下中華真地鱉各齡期發(fā)育速率

圖1對(duì)不同溫度下中華真地鱉各蟲態(tài)的發(fā)育速率進(jìn)行了擬合，結(jié)果顯示，在16℃-34℃范圍內(nèi)，隨溫度上升，各蟲態(tài)發(fā)育速率加快。用Logistic模型將各蟲態(tài)的發(fā)育速率與溫度的關(guān)系進(jìn)行回歸，若蟲-成蟲(雌性)的發(fā)育速率方程為：V=15.7214/(1+EXP(4.3688-0.0318 t))。若蟲-成蟲(雄性)的發(fā)育速率方程為：V=36.2408/(1+EXP(5.0938-0.0298 t))。

2.4 中華真地鱉在不同溫度下的卵化率

26℃、30℃時(shí)中華真地鱉卵孵化率分別為56.5%和52.8%，34℃時(shí)卵孵化率為43.2%，二者顯著差異，表明溫度對(duì)中華真地鱉卵孵化率有顯著影響(df=4，20；F=3.354 ；P=0.030)(圖2)。

2.5 溫度對(duì)中華真地鱉保護(hù)酶活性的影響

在26℃和30℃下飼養(yǎng)的中華真地鱉CAT活性最高，在34℃下CAT活性最低，二者差異顯著(df=4，10；F=28.911；P< 0.01)，表明溫度對(duì)中華真地鱉CAT活性有影響(圖3)。

中華真地鱉POD活性在30℃飼養(yǎng)下與其他溫度下形成顯著差異(df=4，10；F=79.565；P< 0.01)，在34℃飼養(yǎng)下POD活性最低。表明溫度對(duì)中華真地鱉POD活性有影響(圖4)。

中華真地鱉SOD活性在26℃飼養(yǎng)下與其他溫度下形成顯著差異(df=4，10；F=34.116；P< 0.01)，在34℃飼養(yǎng)下SOD活性最低。表明溫度對(duì)中華真地鱉SOD活性有影響(圖5)。

圖1 華真地鱉在不同溫度下各蟲態(tài)發(fā)育速率的擬合Fig.1 The simulation equation of developmental speed Eupolyphaga sinensis in different instars at different temperatures

圖2 不同溫度下中華真地鱉卵孵化率Fig.2 Hatching proportion of Eupolyphaga sinensis at different temperatures

圖3 中華真地鱉若蟲在不同溫度飼養(yǎng)下CAT的活力Fig.3 The influence to CAT of Eupolyphaga sinensis at different temperatures

圖4 中華真地鱉若蟲在不同溫度飼養(yǎng)下POD的活力Fig.4 The influence to POD of Eupolyphaga sinensis at different temperatures

圖5 溫度對(duì)中華真地鱉若蟲SOD的影響Fig.5 The influence to SOD of Eupolyphaga sinensis at different temperatures

3 結(jié)論與討論

3.1 溫度對(duì)中華真地鱉的存活率和發(fā)育歷期的影響

溫度是昆蟲生活的重要生態(tài)因子,對(duì)昆蟲的發(fā)育、存活和繁殖等均有重要影響(羅舉等，2005)。本研究表明，在18℃、22℃、26℃、30℃下中華真地鱉存活率分別為0.45、0.49、0.55、0.56，顯著高于在34℃下0.27的存活率(df=4，20；F=7.414；P=0.001)。

昆蟲自身無恒定體溫，因此溫度的改變將直接導(dǎo)致昆蟲體溫和新陳代謝速度的變化(丁巖欽，1994)。在適合生長(zhǎng)發(fā)育的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，昆蟲的發(fā)育速率加快，發(fā)育歷期縮短(羅智心等，2009；杜艷麗等，2012)。本研究表明，中華真地鱉的各個(gè)歷期隨著溫度的上升而縮短，在18，22，26，30和34℃時(shí)，卵期分別為72.2，65.4，53.3，43.3，40.2 d；1齡若蟲分別為20.2，18.5，15.4，12.3，11.1 d；雌蟲世代發(fā)育歷期分別為286.2，258.6，228.2，198.6，182.5 d；雄蟲世代發(fā)育歷期分別為263.3，232.6，216.2，186.4，169.3 d。本試驗(yàn)有關(guān)于若蟲的發(fā)育歷期長(zhǎng)短的與此前的報(bào)道不完全一致(李長(zhǎng)福等，2003)，原因可能是此前報(bào)道的是在自然變溫條件下的一個(gè)日均溫度的發(fā)育歷期，而本試驗(yàn)是在人工恒溫下的發(fā)育歷期，另外，若蟲的齡期劃分、飼料、濕度的不同也可能存在影響。結(jié)合存活率考慮，溫度與昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育模型可用于研究溫度對(duì)昆蟲發(fā)育速率的影響，用Logistic模型將各蟲態(tài)的發(fā)育速率與溫度的關(guān)系進(jìn)行回歸，若蟲-成蟲(雌性)的發(fā)育速率方程為：V=15.7214/(1+EXP(4.3688-0.0318 t))。若蟲-成蟲(雄性)的發(fā)育速率方程為：V=36.2408/(1+EXP(5.0938-0.0298 t))。

溫度對(duì)中華真地鱉卵鞘孵化率有影響，越冬時(shí)期室內(nèi)加溫條件下的雌蟲掛卵率比室內(nèi)常溫下掛卵率高(金濤等，2006)；在自然變溫條件下，中華真地鱉卵孵化率較低(李長(zhǎng)福等，2003)；即使選用質(zhì)量較好的卵鞘，但其孵化率并不高(金濤等，2005)。本研究表明，在恒溫下， 26℃、30℃時(shí)中華真地鱉孵化率最高，分別為56.5%、52.8%，與溫度為34℃時(shí)孵化率43.2%形成顯著差異(P< 0.05)。從縮短發(fā)育歷期和提高存活率的角度出發(fā)，結(jié)合卵孵化率，本試驗(yàn)認(rèn)為大規(guī)模人工飼養(yǎng)溫度可以優(yōu)先考慮26℃和30℃。

3.2 溫度對(duì)中華真地鱉保護(hù)酶活性的影響

昆蟲體內(nèi)存在自由基(宋月芹等，2009)，在不利環(huán)境條件下增加自由基會(huì)對(duì)生物分子起到破壞作用(Fridovich，1976；Packer，1984)。SOD 能清除部分自由基而形成 H2O2，POD和CAT 能分解H2O2。在SOD、POD和CAT的共同作用下，自由基將維持在一個(gè)較低水平從而防止生物細(xì)胞被自由基毒害(李周直等，1994)。因此Fridovich 把 SOD、 POD、 CAT 3 種酶稱為保護(hù)酶系統(tǒng)(Fridovichetal.,1997)。溫度脅迫是影響昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育過程的中常見的逆境因子，也是影響酶活力的重要因素,當(dāng)反應(yīng)條件如pH值、反應(yīng)時(shí)間等恒定時(shí),酶反應(yīng)就有一個(gè)最適溫度,此時(shí)酶的活力最大 (唐慶峰等，2005；張青等，2016)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，中華真地鱉體內(nèi)存在著清除自由基的SOD、POD、CAT保護(hù)酶系統(tǒng)，且不同溫度飼養(yǎng)對(duì)保護(hù)酶的活性有明顯的影響。不同溫度下飼養(yǎng)，中華真地鱉CAT活性在26℃最高，在34℃最低；POD活性在26℃和30℃下最高，在34℃下最低；SOD活性在30℃下最高，在34℃下最低。

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Effects of temperature on the growth, development and protective enzyme activity ofEupolyphagasinensisWalker (Blattaria:Polyphagidae)

WANG Yan-Yang1，LIANG Guang-Wen2*

(1.Jiangmen Polytechnic, Jiangmen 529090, Guangdong Province China；2.South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China)

In order to clarify the effects of temperature on the instar survival rate, developmental duration, egg hatchability and protective enzyme activity ofEupolyphagasinensisWalker.The instar survival rate，developmental duration，egg hatchability and the activities of three protective enzymes (superoxide dismutase，SOD; catalase，CAT; peroxidase，POD) inE.sinensisat different temperature were assayed and analyzed.The results showed that the temperature has significant influence on the survival rate and developmental duration ofE.sinensis(P< 0.05).the survival rate ofE.sinensiswas significantly higher at 18; 22; 26; 30℃ than at 34℃(df=4，20；F=7.414；P=0.001).The developmental duration of female larvae was longer than male larvae at the same temperature.The developmental duration of eggs was 74.6; 65.9; 53.3; 44.5; 39.4 d(F=24.251；df=4，20；P<0.05), developmental duration of female nymph was 286.2; 258.6; 228.2; 198.6; 182.5 d(F=72.846；df=4，20；P<0.05) and developmental duration of male nymph was 263.3; 232.6; 216.2; 186.4; 169.3 d(F=38.332；df=4,20；P< 0.05) respectrively at above five temperatures.There were protective enzymes (superoxide dismutase，SOD; catalase，CAT; peroxidase，POD) inE.sinensisand different temperature had significant impact on the activities(P< 0.05).The CAT activity was highest at 26℃ and lowest at 34℃.The POD activity was highest at 26℃ or 30℃ and lowest at 34℃.The SOD activity was highest at 30℃ and lowest at 34℃.Considering the developmental duration and the survival rate and hatching rate，26℃and 30℃ can be used as the reference temperature of artificial feeding.

EupolyphagasinensisWalker; temperature; survival rate ; developmental duration; protective enzyme

王彥陽(yáng)，梁廣文.溫度對(duì)中華真地鱉生長(zhǎng)發(fā)育及酶保護(hù)活性的的影響[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2017,39(3):679-686.

江門市第一批產(chǎn)業(yè)技術(shù)與開發(fā)項(xiàng)目(20120030103416)；江門市基礎(chǔ)理論與科學(xué)研究專項(xiàng)(20140080091332)

王彥陽(yáng)，男，1978年生，博士，E - mail：wang_238@126.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail：gwliang@scau.edu.cn

Received：2016-04-24；接受日期 Accepted：2016-10-08

Q965

A

1674-0858(2017)03-679-08