豬源莢膜血清 F型多殺性巴氏桿菌分離鑒定

王 羽，董文龍，王 巍，張喜慶，田佳琪，馬紅霞，高云航

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

豬源莢膜血清 F型多殺性巴氏桿菌分離鑒定

王 羽，董文龍，王 巍，張喜慶，田佳琪，馬紅霞，高云航

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

本研究對從病死豬肺臟分離出的1株菌株，經(jīng)菌落形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)、藥敏試驗(yàn)、動物致病性試驗(yàn)，并采用PCR對該分離菌株進(jìn)行菌種及莢膜血清型鑒定。結(jié)果顯示，該分離菌株為較少見的莢膜血清F型多殺性巴氏桿菌，對小鼠有較強(qiáng)致病性，且對不同藥物的敏感性不同，為指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥提供依據(jù)。

多殺性巴氏桿菌;分離鑒定;莢膜血清型

多殺性巴氏桿菌廣泛分布于世界各地，能夠引起動物各類疾病，如牛出血性敗血癥、豬萎縮性鼻炎、兔膿血癥、鳥類禽霍亂。在同種或不同種動物間可相互傳染。Carter G B等將Pm莢膜血清型分為A、B、D、E和F［1］，在我國主要流行A、B型和D型，Townsend K M研究表明，基因Kmt1是Pm種的特異性片段［2］。A、B、D、E血清型和F血清型高度特異性的基因莢膜合成位點(diǎn)分別是hya D－h(huán)ya C、bcb D、dcb F、ecb J、fcb D［3］。由于莢膜血清型決定病原菌的免疫原性，各血清型之間交叉免疫保護(hù)性較低［4］，再加上抗生素的不合理使用，該菌逐漸產(chǎn)生了耐藥性，這給疾病防控帶來了很大困難。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基、藥物、試驗(yàn)動物 TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，胎牛血清，購自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所;紅霉素、氯霉素、阿莫西林、氟苯尼考、阿奇霉素等11種藥物，均購自河南惠農(nóng)聯(lián)科動物藥業(yè)有限公司;昆明系小鼠，購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 發(fā)病情況 該豬場不同日齡的豬均有發(fā)病，豬舍內(nèi)濕度大，空氣不流通，飼料有受潮現(xiàn)象。8月上旬陸續(xù)有23頭豬發(fā)病，病豬體溫突然上升到41℃～42℃，呼吸困難，心跳加快，口鼻黏膜發(fā)紫。耳根、頸部、腹部等處發(fā)生出血性紅斑。2～3 d內(nèi)出現(xiàn)死亡。

1.3 剖檢變化 剖檢病死豬可見氣管內(nèi)有大量泡沫樣黏液。肺部淤血、水腫，主要位于尖葉、心葉和膈葉前緣。肝病變表面有壞死灶，并與胸膜粘連。胸腔及心包腔積液。胸部淋巴結(jié)腫大，切面發(fā)紅、多汁。

1.4 病原分離培養(yǎng) 無菌分離病死豬肺臟接種于TSA培養(yǎng)基(含50 mL/L胎牛血清)和麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)，置37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h后，觀察細(xì)菌生長情況，菌落形態(tài)。

1.5 涂片鏡檢 挑取純化后的單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭染色和美藍(lán)染色，鏡檢。

1.6 細(xì)菌生化鑒定 將純化后的細(xì)菌，接種于葡萄糖、果糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇、乳糖、鼠李糖、麥芽糖、吲哚、M．R．(甲基紅)、V－P(乙酰甲基甲醇)培養(yǎng)基中。

1.7 致病性試驗(yàn) 將分離純化的菌株接種到TSA培養(yǎng)基(含50 mL//L胎牛血清)，37℃培養(yǎng)24 h。將菌液按10倍系數(shù)倍比稀釋，進(jìn)行活菌平板計(jì)數(shù)。隨機(jī)將小鼠分為2組，每組5只。每個(gè)稀釋度腹腔注射一組小鼠，0.3 mL/只，對照組每只小鼠接種0.3 mL生理鹽水。觀察并記錄各組小鼠的發(fā)病及死亡情況，以寇氏改良法計(jì)算半數(shù)死量(LD50);同時(shí)采集死亡小鼠的肝臟、心臟進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定。

1.8 PCR鑒定 參考Townsend等報(bào)道的多殺性巴氏桿菌特異性基因kmt1和莢膜血清型基因hya D-hya C、bcb D、dcb F、fcb D設(shè)計(jì)引物血清型A、B、D、F型［2］。引物序列送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成。如表1。

表1 引物

挑取單個(gè)菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，置于37℃水平搖床(170 r/min離心)增菌培養(yǎng)。取1．6 mL菌液12 000 r/min離心，棄上清，運(yùn)用酚－氯仿法提取分離菌株DNA。

以提取的DNA為模板，對kmt1基因及莢膜血清型基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為94℃ 5 min; 94℃ 1 min;50℃ 1 min;72℃ 1 min;30個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min;4℃保存，隨后用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，將純化的PCR產(chǎn)物和pMD-18T連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli．DH5α感受態(tài)細(xì)胞，按照試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，并送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.9 藥敏試驗(yàn) 將多殺性巴氏桿菌接種到TSB液體培養(yǎng)基中，37℃水平搖床(170 r/min離心)過夜。將測定過濃度的多殺性巴氏桿菌菌液進(jìn)行倍比稀釋至，選取濃度為106CFU/mL的菌液作為藥敏試驗(yàn)用的細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。

參考CLSI動物源細(xì)菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分別以敏感、中介和耐藥3種形式對MIC值大小進(jìn)行評定，并進(jìn)行藥物敏感性分析。

2 結(jié)果

2.1 多殺性巴氏桿菌分離培養(yǎng) 通過鏡檢、生化試驗(yàn)及多殺性巴氏桿菌特異性基因擴(kuò)增，成功分離到豬源多殺性巴氏桿菌。病料接入TSA(含50 mL/L胎牛血清)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，菌落潤滑，似水珠狀，在麥康凱培養(yǎng)基上不生長。

2.2 鏡檢結(jié)果 多殺性巴氏桿菌美藍(lán)染色表現(xiàn)兩極濃染，革藍(lán)染色表現(xiàn)出陰性菌，單個(gè)或成對存在。顯微鏡檢查結(jié)果如中插彩版圖1所示。

2.3 細(xì)菌的生化試驗(yàn)結(jié)果 多殺性巴氏桿菌生化試驗(yàn)的結(jié)果為，分離菌株可以發(fā)酵果糖、葡萄糖、甘露醇，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能發(fā)酵麥芽糖、乳糖、鼠李糖，吲哚、硝酸鹽還原試驗(yàn)表現(xiàn)陽性，M．R．V-P試驗(yàn)表現(xiàn)陰性。該分離菌符合多殺性巴氏桿菌生化特征。

2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果 活菌平板計(jì)數(shù)測得菌液濃度為5×1010CFU/ml，LD50值為6．29×107。試驗(yàn)組5只小鼠36 h出現(xiàn)背毛逆立，精神沉郁，站立不穩(wěn)，48 h后小鼠出現(xiàn)死亡。對照組小鼠無異樣。剖檢病死小鼠，觀察病變，并進(jìn)行細(xì)菌分離及分子生物學(xué)鑒定，初步確定為多殺性巴氏桿菌。

2.5 PCR鑒定及分型 以DNA為模板，擴(kuò)增多殺性巴氏桿菌特異基因引物kmt1，在400～600 bp得到特異性條帶，見圖2。多殺性巴氏桿菌kmt1有較高特異性和靈敏度，其kmt1序列可不經(jīng)測序，直接用于對多殺性巴氏桿菌的快速鑒定［5］。對F莢膜血清型特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在約700～1 000 bp得到特異性條帶，見圖3。

2.6 基因的序列分析 對700～1 000 bp之間的特異性片段的測序結(jié)果表明，分離菌株全長為852 bp，擴(kuò)增序列與GenBank上已公布的莢膜血清型特異性基因fcb D多殺性巴氏桿菌(AY604234．1)序列同源性達(dá)到100%，據(jù)此可鑒定該菌為F型多殺性巴氏桿菌。

圖2 Pm的kmt1基因擴(kuò)增結(jié)果M:Mark;L:kmt1基因擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 Pm的血清型擴(kuò)增結(jié)果M:Mark;L:Pm血清型擴(kuò)增

2.7 耐藥性分析結(jié)果 耐藥結(jié)果為分離菌株對紅霉素、阿米霉素的耐藥性表現(xiàn)中等，而對阿莫西林、環(huán)丙沙星、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶表現(xiàn)耐藥，對氯霉素、氟苯尼考、阿奇霉素、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素敏感。

3 討論

分離菌株經(jīng)菌落形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)初步判定為多殺性巴氏桿。該菌對人工培養(yǎng)基具有選擇性，在TSA(含50 mL/L胎牛血清)培養(yǎng)基上生長良好，在麥康凱上不生長。

我國由多殺性巴氏桿菌引起的豬病主要流行株為莢膜A，B型和D型［6］。其中A型引起豬肺疫，B型引起牛出血性敗血癥，D型引起豬傳染性萎縮性鼻炎［7］。而莢膜血清F型巴氏桿菌報(bào)道非常少見［7］，1987年，莢膜血清F型巴氏桿菌從火雞體內(nèi)被分離出［8］，后證實(shí)該莢膜血清與禽霍亂有關(guān)，對火雞有十分強(qiáng)的致病性。本研究通過常規(guī)方法從仔豬肺臟中分離到一株多殺性巴氏桿菌，用Townsend等人的研究方法對細(xì)菌的血清型進(jìn)行鑒定，結(jié)果為F型。該分離菌株對小鼠有較強(qiáng)的致病性。關(guān)于莢膜血清F型巴氏桿菌對豬群的致病機(jī)制目前還不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

多殺性巴氏桿菌對某一類具有相同或是相似結(jié)構(gòu)的抗菌藥物耐藥，可能是抗菌藥物新作用位點(diǎn)的產(chǎn)生或是作用位點(diǎn)的改變［9］。有研究表明，在印度的8個(gè)反芻養(yǎng)殖場的所有抗生素試驗(yàn)中，多殺性巴氏桿菌對恩諾沙星和氯霉素敏感［10］。孔令聰從我國不同地區(qū)分離得到12株多殺性巴氏桿菌。此12株菌對新諾明、鏈霉素高度耐藥［5］。本試驗(yàn)分離菌株對阿莫西林、環(huán)丙沙星、慶大霉素、磺胺間甲氧嘧啶表現(xiàn)耐藥，這可能與抗生素用量不斷加大，品種更新快有關(guān)。

近年來隨著豬飼養(yǎng)量的增加，豬多殺性巴氏桿菌病發(fā)病率也越來越高，多殺性巴氏桿菌是一種條件性病原菌，當(dāng)豬處在不良的環(huán)境中，如寒冷、悶熱潮濕、氣候劇變、通風(fēng)不良、營養(yǎng)缺乏、長途運(yùn)輸?shù)?，致使豬的抵抗力下降，這時(shí)病原菌大量增殖并引起發(fā)病。另外病豬可經(jīng)分泌物、排泄物等排菌傳染給健康豬。也可由咳嗽、噴嚏經(jīng)呼吸道傳染。此外，吸血昆蟲叮咬皮膚及黏膜傷口都可傳染。本病一般無明顯的季節(jié)性，但以冷熱交替、氣候多變，高溫季節(jié)多發(fā)，一般呈散發(fā)性或地方流行性。所以養(yǎng)殖戶必須制定相應(yīng)的防治措施，加強(qiáng)綜合飼養(yǎng)管理，以控制傳染源，切斷傳播途徑，增強(qiáng)易感動物抵抗力為原則，才能控制多殺性巴氏桿菌病的發(fā)病率，為養(yǎng)殖場帶來更大的經(jīng)濟(jì)效益。

［1］ Carter G R，Genus I．Pasteurella．In:Bergey＇s manual of system atic bacteriology［M］．Baltimore:Williams and Wilkins，1984: 554-557．

［2］ Townsend K M，Boyce J D，F(xiàn)rost A J，etal．Developmentof PCR assays for species-and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates［J］．J Clin Microbiol，1998，36(4): 1096-1100．

［3］ Townsend K M，Boyce J D，Chung J Y，et al．Genet ic organi zation of Pasteurella multocida caplociand developmentofa multiplex capsular PCR typing system［J］．J Clin Microbiol，2001，39 (3):924-929．

［4］ Cm J R，Rt E．Polymorphism in repeated16S rRNA genes is a common property oftype strains and environmentalisolates ofthe genus Vibrio［J］．Microbiology，2002，148(pt4):1 233-1 239．［5］ 孔令聰．牛源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及對喹諾酮類抗生素耐藥機(jī)制［D］．長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013．

［6］ 馬文戈，于力．牛源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定［J］．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30(10):747－750+754

［7］ 高明燕，徐步，趙寶華，等．多殺性巴氏桿菌檢測、鑒定和分型研究進(jìn)展［J］．動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31(1):67-72．

［8］ 李富祥，宋建領(lǐng)，李華春，等．豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及其莢膜血清型鑒定［J］．上海畜牧獸醫(yī)通訊，2012，02:19-21．

［9］ Rimler R B，Rhoades K R，Serogroup F．a(chǎn) new capsular serogroup of Pasteurella mutocida［J］．J Clin Mcrobiol，1987，25(4):615-618

［10］ 林志敏，林彬彬，程龍飛．禽源多殺性巴氏桿菌耐藥性及其質(zhì)粒多樣性的研究［J］．福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31(7):648-651．

Isolation and identification of a Pasteurella multocida strain belonged to capsular type F from swine

WANG Yu，DONG Wen-long，WANG Wei，ZHANG Xi-qing，TIAN Jia-qi，MA Hong-xia，GAO Yun-hang

(College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)

In this study，one strain was identified by colonial morphology，culture characteristics，biochemical reaction，antimicrobial susceptibility test，and animal pathogenicity test．Species and capsular serotype were determined using PCR．Results showed that the strain belonged to capasular type F of Pasteurella multocida(Pm)，which had a strong pathogenicity to mice，and the sensitivity to different drug was different．

Pasteurella multocida;isolation and identification;capsular serotype

GAO Yun-hang

S828

A

0529-6005(2017)06-0031-03

2016-11-21．

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272611)

王羽(1993-)，女，碩士生，從事動物疫病防治工作，E-mail:1846020084@qq．com

高云航，E-mail:gaoyunhang@163．com