GnRH二聚體和GnRH并列二聚體合成肽疫苗對(duì)大鼠的免疫去勢(shì)效果

陳文娟，魏 冰，呂傳忠，任東興，陳 庚，付旭彬

(1．天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 西青 300384;2．天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 東麗 300308)

GnRH二聚體和GnRH并列二聚體合成肽疫苗對(duì)大鼠的免疫去勢(shì)效果

陳文娟1，魏 冰1，呂傳忠2，任東興2，陳 庚2，付旭彬2

(1．天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 西青 300384;2．天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 東麗 300308)

為了比較GnRH二聚體和GnRH并列二聚體單次和兩次免疫對(duì)雄性大鼠的免疫去勢(shì)效果。將上述兩種GnRH疫苗，分組免疫SD大鼠，免疫后每?jī)芍軝z測(cè)大鼠血清中的GnRH抗體滴度和血清睪酮水平、睪丸重量和組織結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，兩次免疫試驗(yàn)組的抗體滴度顯著高于單次免疫試驗(yàn)組的抗體滴度(P＜0.05);GnRH二聚體抗原免疫效果優(yōu)于GnRH并列二聚體抗原的免疫效果，且差異極顯著(P＜0.01)。免疫組大鼠血清睪酮水平及睪丸重量均極顯著低于空白對(duì)照組(P＜0.01)。免疫去勢(shì)效果顯著的大鼠只數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示，GnRH二聚體(5/6)和GnRH并列二聚體(4/6)兩次免疫均多于單次免疫(4/6和3/6)。同時(shí)，組織學(xué)觀察結(jié)果可見(jiàn)，免疫組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)萎縮，曲精小管管徑變窄，內(nèi)部精母細(xì)胞脫落，精子變少或者沒(méi)有。表明GnRH二聚體疫苗與GnRH并列二聚體疫苗均能達(dá)到去勢(shì)效果，前者優(yōu)于后者，兩次免疫優(yōu)于一次免疫。

免疫去勢(shì);GnRH二聚體;GnRH并列二聚體;單次免疫;兩次免疫;合成肽疫苗

免疫去勢(shì)是用促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)類(lèi)似物疫苗免疫的方法抑制性器官的發(fā)育，以達(dá)到去勢(shì)目的。采用免疫去勢(shì)，可有效防止手術(shù)去勢(shì)導(dǎo)致的出血、感染情況的發(fā)生，具有安全方便、應(yīng)激小、適合集約化養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn)，在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、改善肉質(zhì)、提高肉用家畜生產(chǎn)性能上具有廣闊的應(yīng)用前景［1－2］。目前，世界范圍內(nèi)商品化的GnRH疫苗只有碩騰公司旗下CSL動(dòng)物保健公司(Pflier，CSL animal health，Australia)生產(chǎn)的Improvac 疫苗，用于去除公豬膻味，需要在屠宰前4周和 8周兩次皮下注射(劑量:2 mL/次)［1，3］。合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)是用化學(xué)合成法制備具有保護(hù)作用的類(lèi)似天然抗原決定簇的多肽疫苗，隨著合成肽制備技術(shù)的發(fā)展，合成肽抗原的生產(chǎn)成本大大降低，合成肽疫苗在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用成為現(xiàn)實(shí)［4］。因此，在前人研究的基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了GnRH二聚體抗原肽和GnRH并列二聚體抗原肽，分別單次和兩次免疫雄性SD大鼠，在免疫后不同時(shí)間采血，檢測(cè)血清中抗體及睪酮水平的變化，進(jìn)一步分析兩種疫苗及兩種免疫方式在作用過(guò)程中的區(qū)別，為免疫去勢(shì)疫苗的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 健康、體重相近(240 g～280 g)的雄性SD大鼠，購(gòu)自天津市津南區(qū)春樂(lè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 主要試驗(yàn)試劑和儀器 GnRH二聚體合成肽抗原、GnRH并列二聚體合成肽抗原(201505，瑞普生物技術(shù)股份有限公司);MONTANIDE ISA 61VG佐劑(T30311，賽彼科(上海)特殊化學(xué)品有限公司);睪酮放免試劑盒(20151120，北京北方生物技術(shù)研究所有限公司);HRP標(biāo)記的羊抗大鼠IgG(14-16-06，KPL Corporation);TMB單組份顯色液(20151105，Solarbio公司);高剪切分散乳化機(jī)(FA25型，F(xiàn)LUKO公司);酶標(biāo)檢測(cè)儀 (Bio-RAD15146型，iMark);臺(tái)式冷凍離心機(jī)(3K-15型，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司);醫(yī)用冷藏箱(HYC-260型，Haier公司);冰箱(BCD-221CHC型，美菱公司);生化培養(yǎng)箱(SPX-250型，寧波江南儀器廠)。

1.3 多肽疫苗制備 采用固相合成技術(shù)合成兩種GnRH抗原肽，分別與Montanide ISA 61VG佐劑進(jìn)行乳化制成油包水疫苗，終濃度為100μg/mL，分裝后于4℃保存。

1.4 動(dòng)物免疫與采血 8周齡的SD大鼠，隨機(jī)分為A、B、C、D、E共5組，每組6只。一周后背部皮下兩點(diǎn)注射，每只0.5 mL，其中C、E組于兩周后加強(qiáng)免疫一次，方法同第一次免疫，詳細(xì)免疫情況見(jiàn)表1。常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。于免疫前一天(即0周)和免疫后每?jī)芍苎劭艉箪o脈叢采血一次，3 000 r/min(4℃)離心10 min，收集血清，－20℃保存?zhèn)溆茫B續(xù)采集10次。

表1 動(dòng)物分組與免疫

1.5 大鼠血清睪酮檢測(cè) 采用碘［125I］睪酮放射免疫分析法，由北京北方生物技術(shù)研究所有限公司檢測(cè)。

1.6 間接ELISA方法檢測(cè)大鼠血清GnRH抗體GnRH合成肽抗原以常規(guī)方法包被，隨后以2%BSA進(jìn)行封閉，待檢的陰性和陽(yáng)性血清分別倍比稀釋后加樣置37℃溫育，然后加HRP－羊抗大鼠二抗，置37℃溫育，洗滌后加TMB避光顯色，終止反應(yīng)，室溫放置3 min后測(cè)量各孔吸光度值A(chǔ)450nm。繪制抗體滴度－A450nm曲線(xiàn)，計(jì)算樣品血清的抗體滴度。

1.7 睪丸外觀及組織學(xué)觀察 首次免疫后第18周，摘取SD大鼠兩側(cè)睪丸，測(cè)量睪丸的重量(除去附睪后)，然后置于10%福爾馬林緩沖液中固定，待用。常規(guī)脫水、透明、浸蠟進(jìn)行組織包埋，切片，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，H.E.染色)后鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫后小鼠安全評(píng)價(jià) 通過(guò)觀察，試驗(yàn)期內(nèi)所有免疫大鼠未出現(xiàn)異常癥狀。

2.2 大鼠血清抗體檢測(cè)結(jié)果 免疫及針對(duì)GnRH二聚體和GnRH并列二聚體抗原肽的抗體檢測(cè)結(jié)果表明，空白組大鼠血清的抗體滴度接近于零，而試驗(yàn)組大鼠免疫后0～6周血清抗體滴度迅速上升，極顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.01)，6周后趨于平穩(wěn)，到免疫后第18周滴度在2.5以上。GnRH二聚體與GnRH并列二聚體兩次免疫的抗體滴度均高于單次免疫的抗體滴度，在免疫后第6、10周差異顯著(P＜0.05)。同時(shí)，免疫原性上GnRH二聚體優(yōu)于GnRH并列二聚體，在免疫后第10、12、16、18周差異極顯著(P＜0.01)(圖1)。

2.3 大鼠血清睪酮檢測(cè)結(jié)果 免疫后第4周，Gn-RH二聚體抗原肽與GnRH并列二聚體抗原肽免疫組的血清睪酮與空白對(duì)照組的相比較，含量極顯著下降(P＜0.01)，首次免疫后第18周仍維持在較低水平(圖3)。如果以血清睪酮含量≤0.1 ng/mL作為免疫去勢(shì)效果顯著的判定標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)顯示，GnRH二聚體抗原肽兩次免疫試驗(yàn)組5只大鼠去勢(shì)效果顯著、GnRH并列二聚體抗原肽兩次免疫試驗(yàn)組4只大鼠去勢(shì)效果顯著，均多于GnRH二聚體抗原肽單次免疫(4只)和GnRH并列二聚體抗原肽單次免疫(3只)，與抗體檢測(cè)結(jié)果相符。

2.4 睪丸重量 睪丸稱(chēng)重結(jié)果顯示，所有免疫組大鼠睪丸重量均極顯著低于空白對(duì)照組(P＜0.01)。C組大鼠睪丸重量為(0.33±0.13)g，均低于其他3個(gè) 免疫組，免疫組之間差異不顯著(P＞0.05)(表2)。

圖1 免疫后不同時(shí)期對(duì)照組、免疫組大鼠血清抗GnRH抗體滴度(log10)

圖2 免疫后不同時(shí)期空白對(duì)照組、免疫組大鼠血清中GnRH抗體滴度(log10)

圖3 免疫后不同時(shí)期對(duì)照組、免疫組大鼠血清中睪酮濃度(ng/mL)

表2 對(duì)照組、免疫組大鼠睪丸重量

2.5 睪丸組織學(xué)觀察 組織染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組(見(jiàn)中插彩版圖4 a、b)大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)完整，曲細(xì)精管內(nèi)的精原細(xì)胞逐漸向管腔發(fā)育，明顯分化成初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子。免疫組C組的大鼠睪丸明顯萎縮，曲細(xì)精管管徑變小，精原細(xì)胞脫落，管腔中僅有少量精原細(xì)胞，無(wú)成熟精子細(xì)胞(見(jiàn)中插彩版圖4 c、d)。

3 討論

GnRH是下丘腦調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)的一種重要性激素，通過(guò)刺激垂體前葉分泌促黃體素(luteinizing hormone，LH)進(jìn)而調(diào)節(jié)睪丸生長(zhǎng)、發(fā)育。主動(dòng)免疫可使動(dòng)物產(chǎn)生GnRH抗體，中和內(nèi)源性GnRH，導(dǎo)致下丘腦-垂體-睪丸軸功能的破壞，抑制LH和FSH促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)的釋放，使被免疫動(dòng)物表現(xiàn)睪丸萎縮和重量減輕，血清睪酮水平下降，從而達(dá)到免疫去勢(shì)的效果［5］。

Brunius C等研究表明，GnRH疫苗可以誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，通過(guò)間接ELISA方法檢測(cè)血清中GnRH抗體滴度［4，6］，可對(duì)免疫去勢(shì)效果評(píng)價(jià)提供參考。本研究中，使用GnRH二聚體及并列二聚體合成肽疫苗免疫的大鼠均可產(chǎn)生免疫應(yīng)答，采用單次免疫和兩次免疫均能抑制睪丸生長(zhǎng)，使睪丸重量極顯著減輕。與對(duì)照組相比，免疫組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)萎縮，曲精小管管徑變窄，內(nèi)部精母細(xì)胞脫落，精子變少甚至缺如。因此，組織結(jié)構(gòu)變化表明，GnRH合成肽疫苗與以往報(bào)道的GnRH疫苗一樣，能夠誘導(dǎo)免疫去勢(shì)。

睪酮主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，血清中睪酮濃度的高低可以間接反映去勢(shì)疫苗對(duì)睪丸機(jī)能及生殖性能的影響的程度［5，12－13］。本研究顯示，免疫后伴隨著GnRH抗體滴度的快速升高，血清中睪酮濃度迅速下降，免疫后第4周至第18周，GnRH二聚體及并列二聚體免疫組大鼠血清中睪酮濃度極顯著低于空白組，這一結(jié)果與以往報(bào)道的GnRH疫苗作用機(jī)制相符［7－9］。值得注意的是，免疫組B組B-2、B-3大鼠和免疫組C組C-1大鼠的睪酮水平?jīng)]有顯著下降，其抗體滴度也比組內(nèi)其他大鼠的抗體滴度低，這一現(xiàn)象說(shuō)明不同大鼠對(duì)GnRH肽抗原肽的免疫反應(yīng)存在個(gè)體差異。因此，為提高該疫苗免疫的有效率，有必要通過(guò)改進(jìn)疫苗的抗原結(jié)構(gòu)、加入免疫增強(qiáng)劑(如蛋白脂質(zhì)體或細(xì)胞表位［10－11］)、使用免疫佐劑或改變不同的劑型等措施來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗的效力［14－15］。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，合成肽抗原的分子量大小與抗原性強(qiáng)弱不呈正相關(guān)，GnRH二聚體抗原分子量小，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體滴度卻高于分子量大的Gn-RH并列二聚體，造成這一現(xiàn)象的原因可能是GnRH并列二聚體的抗原表位被覆蓋。

GnRH二聚體兩次主動(dòng)免疫可以刺激大鼠機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生GnRH抗體，同時(shí)血清睪酮濃度下降至較低水平，并且能夠維持至少14周，說(shuō)明該疫苗在免疫去勢(shì)研究上具有一定的價(jià)值。就動(dòng)物飼養(yǎng)而言，有望用于控制寵物能育性、減少雄性動(dòng)物攻擊性、去除動(dòng)物性肉制品中膻味等的疫苗開(kāi)發(fā);就人類(lèi)醫(yī)藥而言，可通過(guò)抑制性激素分泌而進(jìn)行性激素依賴(lài)性疾病的治療，如前列腺癌和乳腺癌，以及子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、頷下腺體癌，垂體病癥和其他激素敏感性腫瘤等。

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Efficacy of Immunocastration Vaccines Composed of GnRH-dimer or GnRH-tandem-dimer Peptides in Rats

CHEN Wen-juan1，WEI Bing1，LV Chuan-zhong2，REN Dong-xing2，CHEN Geng2，F(xiàn)U Xu-bin2
(1．College of Animal Science and Animal Medicine，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China;2．Tianjin Ringpu Bio-Technology Co.，Ltd.，Tianjin 300308，China)

This study was performed to evaluate the castration efficacies of GnRH-dimer and GnRH-tandem-dimer peptide vaccines in male SD rats by single and double immunization．GnRH-dimer and GnRH-tandem-dimer peptides were prepared as emulsion vaccines．The testosterone concentration and GnRH antibodies in the sera，weight of testes and histological structural changes were observed．The results showed that in immunization groups，GnRH-dimer and GnRH-tandem-dimer peptide vaccines both induced higher titer anti-GnRH antibodies(P＜0．01)．The antibody titers of double immunization group were significautly higher than those of single immunization group(P＜0．05)．In the GnRH-dimer immunized group，the titers of anti-GnRH antibodies were higher than those immunized with GnRH-tandem-dimer vaccine(P＜0．05)．Serum testosterone and testis weights indicated that the concentrations in all immunization groups were lower than those of control group(P＜0．01)．Significantly，in the groups which were immunized twice，the serum testosterone of 5 rats in Gn RH-dimer group and 4 rats in Gn RH-tandem-dimer group was even decreased to be undetectable．However，the corresponding number was 4 and 3 when the rats were immunized once with the respective vaccine．Meanwhile，the testes were observed atrophy in tissue structure as well as a narrowing of the internal diameter of seminiferous tubule，shedding of internal spermatocyte and less or even no sperm．Gn RH dimer vaccine and Gn RH-tandem-dimer vaccine respectively have significant effect of immunocastration in rats．The effect of double immunization is better，and GnRH-dimer peptide is more promising than Gn RH-tandem-dimer peptide as a vaccine candidate．

Immunocastration;GnRH-dimer;GnRH-tandem-dimer;Immunization;Synthetic peptide vaccine

FU Xu-Bin

2017-02-27

國(guó)家科學(xué)技術(shù)部資助項(xiàng)目(2014DFA31180)

陳文娟(1991-)，女，碩士生，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail:cwj128534@163．com

付旭彬，E-mail:fxb@ringpu．com

S852．4

A

0529-6005(2017)06-0014-04