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    細菌脂多糖對豬圓環(huán)病毒2型在PK-15細胞中復制的影響

    2023-02-27 14:06:22張歆明鄭欽生劉獻輝張鵬飛王爽云張樂宜劉燕玲宋長緒
    動物醫(yī)學進展 2023年2期
    關鍵詞:孵育試劑盒通路

    張歆明,徐 舸,鄭欽生,劉獻輝,張鵬飛,王爽云,張樂宜,劉燕玲,宋長緒*

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學國家生豬種業(yè)工程技術研究中心,廣東廣州 510000;2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術廣東省實驗室,廣東廣州 510000;3.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510000)

    豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是一種小的無襄膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒[1]。主要引起“豬圓環(huán)病毒相關疾病”(Porcine circovirus-associated diseases,PCVAD),該病的主要臨床癥狀表現(xiàn)為仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)和繁殖障礙相關疾病,雖然針對PCV2的多種疫苗已經(jīng)被廣泛使用,但是由于其復雜的免疫逃逸機制和變異株的不斷產(chǎn)生,致使病毒很難被有效的防控,對全世界養(yǎng)豬業(yè)都造成嚴重的影響。PCV2經(jīng)常與許多致病菌和病毒共感染,而且與單獨感染相比,共感染表現(xiàn)出更加嚴重臨床癥狀。有研究表明,PCV2單獨攻毒時是很難出現(xiàn)典型的病理癥狀,但是在與其他病原體如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)[2]、豬細小病毒(PPV)[3]、豬肺炎支原體(Mycoplasmal hyopneumonia)[4],以及其他致病細菌混合感染或使用免疫刺激因子都會誘導嚴重的PMWS,這表明免疫刺激輔助因素對PCV2致病性是至關重要的[5]。

    細菌脂多糖(lipoolysaccharide,LPS)存在于革蘭氏陰性菌的外膜,一般在細菌死亡后脫落下來發(fā)揮毒性作用,是免疫系統(tǒng)最有效的誘導因子之一[6]。其與細胞復雜的“模式識別受體”級聯(lián)識別,主要與Toll樣受體4 (TLR4)-MD2復合物結合,由LPS結合蛋白(LBP)和CD14共同催化,激活多種細胞內(nèi)信號通路[7]。有報道稱LPS激活NF-κB信號通路,誘導白細胞介素(IL)-1、IL-2、IL-8,干擾素(IFN)-β和腫瘤壞死因子(TNF)-α[8]的產(chǎn)生。而NF-κB調(diào)節(jié)多種基因參與免疫和急性期炎癥反應和細胞生存。NF-κB信號通路的激活以及IFN-β的產(chǎn)生均可以促進PCV2的復制[9-11]。還有研究表明IL-2過表達后也可以促進PCV2的復制[12]。因此,刺激豬免疫系統(tǒng)會誘導干擾素和白介素產(chǎn)生可能是導致PCV2在體內(nèi)復制增加的關鍵,而理論上LPS可能是通過激活NF-κB信號通路,致使免疫系統(tǒng)激活,促進IFN-β產(chǎn)生導致PCV2復制的增加。然而,我們研究發(fā)現(xiàn)LPS對PCV2復制的影響具有雙重效果。

    本文研究LPS對PCV2復制的影響,發(fā)現(xiàn) LPS的確可以顯著激活NF-κB信號通路,促進IFN-β和IL-2的表達,從而促進PCV2的復制,值得注意的是,研究發(fā)現(xiàn)LPS處理前期是抑制PCV2復制的,深入研究表明LPS抑制PCV2的吸附,阻止PCV2進入細胞,而后期隨著IFN-β的產(chǎn)生,病毒滴度又顯著升高。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 病毒和細胞 PCV2病毒,PK-15細胞,華南農(nóng)業(yè)大學國家生豬種業(yè)工程技術研究中心豬病防控實驗室保存。

    1.1.2 試劑 LPS(大腸埃希氏菌),上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品;LPS(沙門氏菌),上海善然生物科技有限公司產(chǎn)品;干擾素β,武漢云克隆科技股份有限公司產(chǎn)品;高糖DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清,賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品;雙熒光報告基因試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司產(chǎn)品;CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑盒,MCE公司產(chǎn)品;病毒總核酸快速抽提試劑盒,廣州美基生物科技有限公司產(chǎn)品;SteadyPure通用型RNA提取試劑盒,Evo M-MLV反轉錄試劑預混液,湖南艾科瑞生物工程有限公司;;Eastep?qPCR Master Mix(2X),普洛麥格(北京)生物技術有限公司產(chǎn)品。

    1.1.3 主要儀器 熒光定量PCR檢測儀,美國應用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品;細胞培養(yǎng)箱,賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品;高速冷凍離心機,德國艾本德公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 引物設計與合成 從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載各基因序列,并用Primer 5生物軟件設計,在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列和GenBank序列號見表1。

    表1 引物序列

    1.2.2 PK-15細胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的PK-15細胞,37℃迅速水浴回溫,離心丟棄凍存液,加入100 g/L FBS高糖DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),待細胞長滿后進行傳代。細胞傳代,首先棄瓶內(nèi)的培養(yǎng)基,用已滅菌的PBS緩沖液清洗細胞3次,加入2.5 g/L胰酶進行消化,待細胞脫落后按照1∶3比例傳代,多余細胞可進行后續(xù)細胞試驗。

    1.2.3 PCV2病毒接種 待細胞長至80%~90%時進行PCV2病毒接種,用20 g/L FBS高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋病毒(MOI=1的病毒感染劑量),將病毒液完全均勻覆蓋細胞表面,放入37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱進行孵育1 h,隨后用PBS緩沖液潤洗3次,換成新鮮20 g/L FBS高糖DMEM培養(yǎng)基維持液繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.2.4 LPS對PK-15細胞活力試驗 用CCK-8試劑盒進行LPS細胞毒力檢測,操作方法嚴格按照產(chǎn)品說明書進行,將細胞鋪到96孔板中,待細胞長至90%時,使用不同濃度的LPS(50、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL)進行刺激,孵育24 h后,加入CCK-8試劑,37℃孵育1 h,用酶標儀在450 nm測定吸光度,對結果進行分析。

    1.2.5 病毒吸附和內(nèi)化試驗 將長至90%的細胞放入4℃預冷30 min,丟棄原有培養(yǎng)基,進行接毒,放入4℃環(huán)境中2 h,用提前預冷的PBS培養(yǎng)基進行潤洗3遍,清除未吸附的病毒粒子,使用病毒核酸提取試劑盒提取核酸,實時熒光定量PCR檢測吸附結果。用不同處理對病毒吸附影響試驗,處理1:用500 ng/mL的LPS在37℃孵育細胞1 h后,PBS潤洗3遍后進行吸附試驗;處理2:用50 ng/mL的LPS與PCV2病毒孵育1 h后,加入細胞中4℃孵育1 h;處理3:用500 ng/mL的LPS與PCV2病毒孵育1 h后,加入細胞中4℃孵育1 h,用實時熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù),分析試驗結果。

    1.2.6 雙熒光報告基因檢測 構建靶向NF-κB和IFN-β基因的啟動子基因序列連接到pGL3-basic質粒熒光素酶表達質粒上,成功得到pGL3-basic-NF-κB和pGL3-basic-IFN-β質粒,待PK-15細胞密度在60%時,將轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染細胞內(nèi),24 h后用500 ng/mL LPS刺激細胞,收集12 h、24 h和48 h的細胞樣品,加入裂解液冰浴5 min,充分離心去細胞上清液備用,配制螢火蟲熒光素酶反應工作液和海腎熒光素酶反應液,各取100 μL先后加入到20 μL細胞裂解液中,充分振蕩混勻,反應5 min后,分別在560 nm和465 nm波長采集熒光信號,分析試驗結果。

    1.2.7 實時熒光定量PCR檢測 將待測細胞培養(yǎng)液吸出,PBS緩沖液潤洗2遍,加入適量的細胞裂解液,隨后按照動物細胞RNA提取試劑盒操作步驟進行操作,提取細胞RNA,使用Evo M-MLV反轉錄試劑盒進行反轉錄(10 μL的體系:5× Evo M-MLVRT Master Mix 2 μL,總RNA 500 ng,無核酸酶水加至10 μL,37℃ 15 min,85℃ 5 s),反轉錄產(chǎn)物作為定量檢測模板,配制定量體系,總體系20 μL(Eastep?qPCR Master Mix 2× 10 μL,DNA模板2 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,無核酸酶水7.2 μL,95℃ 2 min,40個循環(huán),95℃ 15 s,60℃ 50 s),放入定量PCR儀中進行擴增,分析結果。

    2 結果

    2.1 LPS在對PCV2在PK-15細胞復制的影響

    LPS對PK-15細胞毒性試驗結果見圖1,僅在2 000 ng/mL時沙門氏菌來源的LPS出現(xiàn)細胞毒性,其他濃度均無明顯的細胞毒性。隨后用安全濃度為500 ng/mL的來源于大腸埃希氏菌和沙門氏菌的LPS處理細胞,驗證不同時間對PCV2復制情況的影響(圖2),從PCV2的Cap基因的相對表達量來看,接毒后12 h,LPS均顯著抑制了PCV2的復制,而24 h和48 h又顯著促進了PCV2的復制,經(jīng)3次重復,結果一致。

    圖1 LPS對PK-15細胞活性的影響

    圖2 不同時間點LPS對PCV2在PK-15細胞復制的影響

    2.2 LPS抑制PCV2病毒的吸附

    PCV2從侵入細胞到復制出新的子代病毒,至少需要18 h[13],在12 h抑制PCV2復制可通過抑制第1代PCV2病毒的吸附和內(nèi)化來實現(xiàn)。本研究吸附試驗表明(圖3),LPS可以抑制PCV2病毒的吸附和內(nèi)化。影響PCV2吸附存在兩種可能,一是LPS直接與PCV2病毒粒子相互作用,抑制其與受體結合;或者LPS競爭PCV2的細胞受體發(fā)揮作用,為驗證LPS的作用,設計不同處理方式(圖4),與PCV2正常孵育細胞相比,用500 ng/mL LPS孵育細胞后接毒組未出現(xiàn)明顯差異,而LPS與PCV2孵育后接毒明顯抑制病毒的吸附,并且隨著濃度的增加,抑制效果更加明顯。表明LPS可能直接與PCV2病毒有相互作用,抑制病毒與細胞受體相互作用。

    圖3 LPS對 PCV2吸附的影響

    1.對照組;2.處理1;3.處理2;4.處理3

    2.3 PCV2 Cap蛋白與LPS分子對接

    用Pymol軟件進行分子對接,從Uniprot數(shù)據(jù)庫中查詢PCV2蛋白序列,從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載LPS分子結構,用Pymol軟件進行預測繪制兩者相互作用圖。選取親和力較高的結果進行對接,提示兩者存在相互作用的可能,并且具有多處結合位點(圖5)。

    圖5 LPS與PCV2的Cap蛋白分子對接圖

    2.4 LPS促進TLR4的表達以及 NF-κB和IFN-β基因的轉錄

    LPS是通過TLR4識別后,激活NF-κB信號通路,促進IFN-β產(chǎn)生。LPS刺激PK-15細胞后顯著促進TLR4的mRNA的表達,而PCV2感染并不影響其表達量的變化(圖6)。雙熒光報告基因試驗顯示(圖7),與對照組相比,在LPS刺激和病毒感染后12 h和24 h,NF-κB轉錄水平明顯增加,在48 h促進效果不明顯;同時IFN-β轉錄水平在各個時間點均有明顯提高,所以LPS可以激活NF-κB和 IFN-β基因的轉錄,表明PCV2和LPS均能激活NF-κB信號通路,促進IFN-β的轉錄。

    圖6 LPS促進TLR4的mRNA表達

    圖7 LPS刺激與PCV2感染促進NF-κB,IFN-β基因轉錄

    2.5 IFN-β促進PCV2 的復制

    為了進一步驗證LPS后期促進PCV2的復制與IFN-β產(chǎn)生相關,用豬源的500 ng/mL IFN-β加入接毒后的PK-15細胞培養(yǎng)液中,結果表明,與對照組相比,PCV2的復制情況在12 h沒有明顯差異,24 h后逐漸顯現(xiàn)IFN-β促進PCV2復制,在48 h促進效果達到2.5倍之多(圖8)。

    圖8 IFN-β處理PK-15細胞促進PCV2的復制

    3 討論

    PCV2病毒是目前基因組最小的病毒之一[14],同時也是進化最成功的病毒之一,能充分利用自身遺傳序列,推測至少編碼11個開放型閱讀框(ORFs),其中只有4個用于蛋白質的表達,分別為Cap蛋白、Rep蛋白、ORF3蛋白和ORF4蛋白,這些蛋白在滿足自身增殖功能的同時,還可以逃避宿主的先天性免疫反應[15]。PCV2被認為是免疫抑制病原體,感染后會增加感染其他病原的風險[16]。有研究稱PCV2與革蘭氏陰性菌等共同感染可能是促進PCV2復制的重要因素,至少部分地促進了PMWS的全面發(fā)展[2]。臨床上PCV2常與副豬嗜血桿菌、大腸埃希氏菌和沙門氏菌混合感染,并且表現(xiàn)出更加嚴重的癥狀,這其中很大程度上在于LPS引起的免疫系統(tǒng)的激活有關[17]。尤其是促進了IFN-β和IL-2的表達,可以顯著促進PCV2的復制,深入研究PCV2病毒可以發(fā)現(xiàn),該病毒有許多異于其他病毒的地方,NF-κB信號通路激活是宿主用于清除致病微生物的利刃,但是可以被PCV2所利用,當該通路受到抑制時,反而抑制了病毒的復制。而且具有抗病毒作用的干擾素(IFNα,IFN-β,IFN-γ)及白介素(IL-2)卻可以促進病毒的復制[11,18]。

    LPS作為免疫激活劑,可以激活TLR4-NF-κB信號通路從而促進IFN-β產(chǎn)生促進PCV2在PK-15的復制,然而,在本文中發(fā)現(xiàn)LPS本身可能與PCV2蛋白Cap存在相互作用,抑制PCV2被受體識別,從而達到抑制病毒吸附的效果。而且LPS與PCV2的Cap蛋白有多處結合位點,為了排除偶然性,用了來自不同細菌的LPS進行試驗,重復3次,均發(fā)現(xiàn)在12 h,明顯抑制PCV2的病毒滴度,這與后期的促進現(xiàn)象看似矛盾,卻也可以合理的解釋:在加入LPS前期,LPS與部分PCV2病毒粒子相互作用,抑制了部分病毒的吸附作用,而未相互作用的LPS與病毒粒子被相應受體識別,PCV2完成吸附和內(nèi)化,釋放核酸進行后續(xù)的復制,而LPS可以促進TLR4的表達,并且通過TLR4激活NF-κB等相關信號通路,致使細胞釋放多種炎性因子,其中包括IFN-β和IL-2等,可以促進PCV2的復制,隨著LPS濃度逐漸降低和失效,后期促進效果明顯。另外,LPS與PCV2的核衣殼蛋白Cap在結構功能預測存在多處結合位點,具體機制還需進一步驗證,這一現(xiàn)象也為研發(fā)PCV2抗病毒藥物提供思路。

    本文揭示了LPS對PCV2復制的影響,提示LPS自身存在抑制PCV2病毒吸附的功能,這將為開發(fā)抗PCV2病毒藥物提供參考。LPS會激活TLR4-NF-κB-IFN-β信號通路,促進多種炎性因子的表達,促進PCV2的復制,提示PCV2與細菌或其他病毒共感染可能會促進病毒的復制,放大免疫反應,進一步加重臨床癥狀;在構建PCV2發(fā)病模型時,加入LPS作為免疫刺激劑時,要注意引入的順序和時間。

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