• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    8周跑臺訓(xùn)練對肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt通路的影響

    2017-08-01 00:43:34沈江振唐東輝
    關(guān)鍵詞:胰島素小鼠水平

    李 娟,沈江振,陳 巍,唐東輝

    (1.燕山大學(xué)體育學(xué)院,河北 秦皇島 066004;2.河北科技師范學(xué)院體育系,河北 秦皇島 066004;3.北京師范大學(xué)體育與運動學(xué)院,北京 100875)

    8周跑臺訓(xùn)練對肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt通路的影響

    李 娟1,沈江振2,陳 巍2,唐東輝3

    (1.燕山大學(xué)體育學(xué)院,河北 秦皇島 066004;2.河北科技師范學(xué)院體育系,河北 秦皇島 066004;3.北京師范大學(xué)體育與運動學(xué)院,北京 100875)

    目的:探討運動鍛煉對肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PIK3/Akt信號通路的影響,揭示運動鍛煉降低肥胖者心血管病風(fēng)險的相關(guān)生物學(xué)機制。方法:將雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組(CG, n=12)與高脂膳食組(HG, n=33),肥胖模型建立后,HG隨機分為肥胖組(OG, n=11)與肥胖運動組(OEG, n=13),OEG小鼠接受8周跑臺訓(xùn)練(12 m/min,60 min/ time,1 time/ d,6 d/w),記錄小鼠體重及能量攝入,免疫組織化學(xué)及western blot檢測小鼠主動脈內(nèi)皮IRS1、p-IRS1(Ser307)、Akt及 p-Akt(Thr308)水平的變化。結(jié)果:1)OEG小鼠體重較OG下降(P<0.01);2)OEG小鼠胰島素水平及HOMA-IR較OG顯著下降(P<0.05,P<0.05);3)OEG小鼠主動脈內(nèi)皮p-IRS1(Ser307)表達較OG降低(P<0.05),p-Akt(Thr308)表達較OG顯著上升(P<0.05)。結(jié)論:8周跑臺訓(xùn)練可降低肥胖小鼠體重增長,改善胰島素抵抗,促進血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。

    運動;肥胖小鼠;胰島素抵抗;血管內(nèi)皮細(xì)胞; PI3K/Akt通路

    由于人類生活方式發(fā)生了變化,導(dǎo)致肥胖(obesity)在全球范圍內(nèi)普遍流行,極大促進了動脈粥樣硬化、2型糖尿病、冠心病、高血壓等心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險[1]。血管內(nèi)皮功能障礙(endothelial dysfunction)是血管病變的啟動環(huán)節(jié),幾乎與所有的心血管疾病存在密切聯(lián)系[2-3]。大量研究證實,肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗(insulin resistance)在血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生過程中具有關(guān)鍵性作用[3]。生理條件下,胰島素可通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上胰島素受體激活經(jīng)磷酸肌醇3激酶(PIK3)/蛋白激酶B(Akt)信號通路,增加一氧化氮(NO)釋放,促進血管舒張[4]。但在肥胖狀態(tài)下,多種因素導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的能力下降,血管舒張功能減弱,進而增加上述心血管疾病罹患風(fēng)險[4-5]。越來越多的研究提示,提高身體活動水平或規(guī)律的運動鍛煉可以顯著降低肥胖者心血管疾病的發(fā)病率與死亡率[6-9],但其中的生物學(xué)機制并未完全闡明。在前期研究的基礎(chǔ)上,本研究主要探討8周跑臺訓(xùn)練對肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素信號調(diào)節(jié)蛋白表達及其磷酸化水平的影響,揭示運動鍛煉改善肥胖相關(guān)血管內(nèi)皮功能障礙、降低心血管病風(fēng)險的生物學(xué)機制。

    1 實驗對象與方法

    1.1 實驗對象與分組 雄性C57BL/6小鼠(6 weeks,15.62±1.45g,n=45),由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,小鼠在實驗室內(nèi)分籠飼養(yǎng),自由進食飲水,明暗交替周期為12h,動物房溫度為25℃±2℃,相對濕度為45%±10%。小鼠在動物房內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后隨機分為2組:對照組(CG,n=12)、高脂膳食組(HG,n=33),12周后將肥胖建模成功的小鼠(n=24)再隨機分為肥胖組(OG,n=11)、肥胖運動組(OEG,n=13)。

    1.2 肥胖小鼠模型的建立 適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后,CG小鼠進食普通飼料(2.90kcal/g,13%脂肪,64%糖,23%蛋白質(zhì));OG與OEG小鼠進食高脂飼料(4.20kcal/g,51%脂肪,33%糖,16%蛋白質(zhì))。喂養(yǎng)12周后,將小鼠體重超過CG小鼠平均體重20%作為肥胖模型成功標(biāo)準(zhǔn)。剔除體重未達標(biāo)的小鼠,然后,OG與OEG小鼠繼續(xù)采用高脂飼料喂養(yǎng),OEG開始進行為期8周的跑臺運動干預(yù),CG與OG小鼠不進行運動干預(yù)。

    1.3 運動干預(yù)方案 運動干預(yù)采用電動跑臺訓(xùn)練(成都泰盟,F(xiàn)T-200),跑臺坡度為0度,恒定跑速為12m/ min,每次訓(xùn)練時間為60min,每日訓(xùn)練1次,每周連續(xù)訓(xùn)練6天,連續(xù)進行6周。

    1.4 能量攝入及體重的計算 實驗期間,每日詳細(xì)記錄小鼠進食行為與攝食量,每周計算1次24h平均能量攝入量及食物消耗量。小鼠24h能量攝入量(kcal/24h)= 食物消耗量(g/24h)×食物的能量密度(kcal/g)。每24h稱量一次小鼠體重(0.1g)。

    1.5 樣品采集及處理 最后一次運動結(jié)束48h后,每組取6只小鼠,用5%的水合氯醛溶液對小鼠腹腔注射(0.5 ml/10g),深度麻醉后,眼球取血,將全血放入離心管,以3500rp/min離心10min后,分離血清,分裝后置4℃環(huán)境待測;打開胸腔,分離主動脈,取結(jié)締組織,生理鹽水洗凈,取適當(dāng)長度置4%多聚甲醛溶液中固定,剩余血管組織用液氮冷凍后低溫保存。

    1.6 血清生化指標(biāo)檢測 小鼠血糖水平采用血糖儀(OMRON,中國)檢測;胰島素水平采用ELISA法測定,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒(美國R&D公司)說明書進行。穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),HOMAIR=空腹胰島素(mIU/L)×空腹血糖(mmol/L)/ 22.5。

    1.7 免疫組織化學(xué) 將甲醛固定后的小鼠主動脈進行石蠟包埋,休塊后,以5μm的厚度切片,將其附貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上,37℃過夜,脫蠟,蒸餾水洗3次,5%BSA封閉30min,滴加一抗孵育,4℃過夜。PBS沖洗10min×3次,滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,37℃靜置30min。PBS沖洗2min×3次;滴加試劑SABC,37℃靜置30min,PBS沖洗5min×3次,經(jīng)DAB顯色后采用蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,中性樹膠封片,采用Image-Pro Plus6.0軟件統(tǒng)計每個高倍視野內(nèi)的陽性細(xì)胞的平均光密度值(average optical density, AOD)。

    1.8 Western blot檢測 小鼠血管內(nèi)皮組織蛋白表達采用Western blot法,將適量血管組織進行剪切后放置預(yù)冷的勻漿器充分研磨后,加入適量裂解液裂解30min,以12 000r/min離心10min取上清液分裝,BCA法測定蛋白濃度。依次上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入稀釋的單克隆抗體,孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育60min,將ECL工作液加置PVDF膜,室溫下孵育5min后用保鮮膜包好PVDF膜,經(jīng)顯影、曝光、洗膜、封閉。將β-actin單克隆抗體按1∶500稀釋到一抗稀釋液中,室溫下?lián)u動60min,按上述方法得到內(nèi)參條帶,將膠片用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 本實驗所得的數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,所有的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各變量組間均數(shù)的比較采用方差分析(one way ANOVA),顯著性水平均為P<0.05。

    2 結(jié) 果

    2.1 小鼠體重變化 從第6周開始HG小鼠體重顯著高于CG小鼠(P<0.01)。第12周開始進行運動干預(yù),將HG中符合肥胖標(biāo)準(zhǔn)的小鼠隨機分為OG與OEG,與OG比較,OEG小鼠從第15周開始體重顯著下降(P<0.01)(圖1A)。

    圖1 小鼠體重與能量攝入變化

    2.2 小鼠能量攝入變化 HG小鼠在整個飼養(yǎng)過程中每日能量攝入顯著高于CG(P<0.01);運動干預(yù)開始后,OEG小鼠每日能量攝入在第13周、第14周均顯著高于OG(P<0.01),從第15周至第20周每日能量攝入,兩組未見顯著差異(圖1B)。

    2.3 小鼠血糖、胰島素及HOMA-IR的比較 與CG比較,OG小鼠血糖水平未見顯著變化,但胰島素水平及HOMA-IR卻顯著升高(P<0.01,P<0.05);與OG比較,OEG小鼠胰島素水平及HOMA-IR均顯著下降(P<0.05,P<0.05)(圖2)。

    圖2 小鼠血糖、胰島素及HOMA-IR的比較

    2.4 小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的IRS1與Akt表達及磷酸化水平比較 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,位于血管內(nèi)皮細(xì)胞層的目標(biāo)蛋白的免疫陽性反應(yīng)呈棕黃色染色(圖3)。與CG比較,OG小鼠血管內(nèi)皮IRS1及Akt的蛋白表達未發(fā)生顯著變化,但p-IRS1的表達水平非常顯著升高(P<0.01),而p-Akt的表達非常顯著降低(P<0.01);與OG比較,OEG小鼠血管內(nèi)皮p-IRS1顯著降低(P<0.05),p-Akt表達顯著增高(P<0.05)(圖4)。

    圖3 小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞p-IRS-1及p-Akt的定位表達

    圖4 小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞IRS1、Akt的蛋白表達及磷酸化水平比較

    3 討 論

    伴隨著經(jīng)濟社會的快速發(fā)展,肥胖在發(fā)達與發(fā)展中國家已成為影響人類健康的社會問題,也成為決定疾病模式變化的重要因素[1]。其中,胰島素抵抗是指胰島素靶組織對正常劑量的胰島素敏感性下降,即生理劑量的胰島素不能夠維持其正常的生理功能,胰島素抵抗是聯(lián)系肥胖與多種代謝異常的重要紐帶。除了經(jīng)典的靶組織,如骨骼肌、脂肪及肝臟組織外,胰島素還可以通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體,激活胰島素受體底物(IRS),通過PI3K或者絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮源性舒張因子與收縮因子的釋放,調(diào)控血管平滑肌舒張與收縮[4-5]。肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗可通過引起血管內(nèi)皮功能障礙,增加心血管病風(fēng)險[5]。充分的證據(jù)表明,規(guī)律的運動鍛煉對降低肥胖者代謝性疾病風(fēng)險具有重要的意義[6-8]。但相關(guān)生物學(xué)機制并未完全闡明。

    本研究發(fā)現(xiàn),肥胖小鼠的胰島素抵抗指數(shù)較正常小鼠明顯增加,血管內(nèi)皮p-IRS1(Ser307)水平明顯增加,而p-Akt(Thr308)水平卻顯著下降,這提示肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt信號途徑存在障礙。研究表明,胰島素作用于內(nèi)皮細(xì)胞受體后,可通過IR/IRS/ PI3K/Akt信號通路增加一氧化氮合酶(eNOS)的活性,促進內(nèi)皮細(xì)胞合成NO[9-11]。另一方面,胰島素還可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的MAPK通路促進內(nèi)皮素(ET-1)的釋放,NO與ET-1是體內(nèi)最重要的舒血管物質(zhì)和縮血管物質(zhì),這兩種物質(zhì)保持平衡是維持血管張力正常的重要基礎(chǔ)[11]。對于IRS1而言,胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生障礙后,其酪氨酸磷酸化水平會下降,而絲氨酸磷酸化水平會增加,進而導(dǎo)致PI3K依賴的胰島素信號通路抑制,NO合成降低,但是血管內(nèi)皮細(xì)胞MAPK信號依然正常,這就造成血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1的分泌量相對增加,最終導(dǎo)致血管趨向于收縮[5,12]。血管持續(xù)收縮會產(chǎn)生許多不良結(jié)果,一方面會使動脈血壓增加;另一方面會導(dǎo)致胰島素的靶組織血流灌注量降低,增加胰島素抵抗的程度[3,13]。肥胖者血管內(nèi)皮功能障礙主要的原因就是血管內(nèi)皮細(xì)胞NO合成減少所致[3,6]。這可能是胰島素抵抗增加肥胖人群心血管疾病風(fēng)險的重要原因之一。本研究還發(fā)現(xiàn),經(jīng)過8周跑臺訓(xùn)練后,肥胖小鼠體重增長速度與胰島素抵抗指數(shù)均顯著降低。同時還發(fā)現(xiàn),8周跑臺訓(xùn)練顯著降低了肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞p-IRS1(Ser307)水平,而p-Akt(Thr308)水平卻顯著升高。這提示運動干預(yù)可促進肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo),改善胰島素抵抗。

    目前,運動鍛煉改善肥胖相關(guān)胰島素抵抗的機制已經(jīng)成為研究熱點。本研究結(jié)果提示,運動干預(yù)可顯著改善肥胖小鼠胰島素抵抗,提高血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),這二者之間可能存在密切聯(lián)系。由于胰島素抵抗被認(rèn)為是孕育多種代謝性疾病的“共同土壤”,因此,肥胖者應(yīng)重視通過規(guī)律的運動鍛煉改善胰島素抵抗與血管內(nèi)皮功能,這可能會成為肥胖者降低心血管疾病風(fēng)險的重要策略。

    4 結(jié) 論

    8周跑臺訓(xùn)練可以明顯降低肥胖小鼠體重增長,改善胰島素抵抗,同時還可以促進血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/ Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這可能是規(guī)律運動鍛煉降低肥胖者心血管疾病風(fēng)險的重要生物學(xué)機制之一。

    [1]Finkelstein EA, Khavjou OA, Thompson H, et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030 [J].Am J Prev Med, 2012, 42(6): 563-570.

    [2]Brian E. Sansbury, Bradford G. Hill. Regulation of obesity and insulin resistance by nitric oxide [J]. Free Radical Biology and Medicine, 2014,73: 383-399.

    [3]Angelo Avogaro, Saula Vigili de Kreutzenberg. Mechanisms of endothelial dysfunction in obesity [J].Clinica Chimica Acta, 2005, 360(1-2): 9-26.

    [4]唐東輝,李娟.肥胖兒童血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗及運動干預(yù)的研究現(xiàn)狀[J].沈陽體育學(xué)院學(xué)報,2014, 33(1):82-86.

    [5]Matthias Barton, Renata Carmona, Jana Ortmann, et al.Obesity-associated activation of angiotensin and endothelin in the cardiovascular system [J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2003,35: 826-837.

    [6]李娟,唐東輝,陳巍.有氧運動結(jié)合抗阻訓(xùn)練對男性肥胖青少年心血管功能的改善及可能機制[J].體育科學(xué), 2013, 33(8): 37-42.

    [7]Aaron S Kelly, Rachel J Wetzsteon, Daniel R Kaiser, et al. Inflammation, insulin, and endothelial function in overweight children and adolescents: The role of exercise [J].The Journal of Pediatrics, 2004, 145(6): 731-736.

    [8]Satoshi Kurose, Hiromi Tsutsumi, Yutaka Yamanaka, et al. Improvement in endothelial function by lifestyle modification focused on exercise training is associated with insulin resistance in obese patients [J].Obesity Research & Clinical Practice, 2014, 8(1):106-114.

    [9]唐東輝,劉潤芝,李娟,等.8周游泳運動干預(yù)對肥胖小鼠血管內(nèi)皮功能改善及其炎癥機制[J].中國體育科技,2016, 52(6): 86-91.

    [10]李娟, 陳巍, 唐東輝. 肥胖激活血管ET-1系統(tǒng)與胰島素抵抗及運動干預(yù)的研究進展[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 30(10): 1074-1077.

    [11]Carmine Cardillo, Francesca Schinz ari, Angelo Adamo, et al. Endothelin-dependentvasoconstrictor activity in metabolically healthy and unhealthy obese patients [J].Life Sciences, 2013, 93(25-26):75.

    [12]丁麗, 張錦.胰島素對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用[J].國際內(nèi)分泌代謝,2010, 30(5): 337-339.

    [13]Ranganath Muniyappa, Sahzene Yavuz. Metabolic actions of angiotensin II and insulin: A microvascular endothelial balancing act[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2013, 378:59-69.

    Effects of 8-week Treadmill Training on PI3K/Akt Pathway in Vascular Endothelial Cells of Obese Mice

    LI Juan1, SHEN Jiang-zhen2, CHEN Wei2, TANG Dong-hui3
    (1. College of Physical Education,Yanshan University,Qinhuangdao 066004,Hebei China;2. Department of Physical Education, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066004, Hebei China;3. P.E. and Sport College, Beijing Normal University, Beijing 100875, China)

    The objective of this study is to investigate the effect of treadmill exercise on PI3K/Akt pathway of vascular endothelial cells in obese mice. Methods: male C57BL/6 mice were randomly divided into control group (CG, n=12) and high fat group (HG, n=33). HG were randomly divided into obesity group (OG, n=11) and obesity group (OEG, n=13) after obese model induced by high fat diet, OEG mice were taken treadmill exercise for 8 weeks (12 m/min, 60 min/ time, 1 time/d, 6 d/w); the body weight and energy intake were recorded, the IRS1, p-IRS1(Ser307), Akt and p-Akt (Thr308) in aortic endothelium were detected by immunohistochemistry and western blot. Results: 1) the body weight of OEG mice was lower than CG (P < 0.01). 2) The insulin level and HOMA-IR signif i cantly increased in OG (P < 0.01, P < 0.01); and insulin levels and HOMA-IR signif i cantly decreased in OEG compared with OG (P < 0.05, P < 0.01). 3) The expression of TH in VTA-NAc system was lower in OG than CG (P < 0.01); and was morein OEG than OG (P < 0.05). The expression p-IRS1(Ser307) in OEG was lower than OG (P < 0.05), and the p-Akt (Thr308) expression was more in OEG than OG (P < 0.05). Conclusion: 8-week treadmill training can decrease weight gain, improve insulin resistance, and promote insulin PI3K/Akt signaling pathway in vascular endothelial cells in obese mice.

    exercise; obese mice; insulin resistance; endothelial cell; PI3K/Akt signaling

    G804.2

    A

    1004 - 7662(2017)04- 0084- 05

    2017-03-03

    國家自然科學(xué)基金(項目編號:81472992);燕山大學(xué)青年教師自主研究計劃課題資助(項目編號:14LGB030)。

    李娟,講師,碩士,研究方向:運動防治肥胖生物學(xué)機制。

    猜你喜歡
    胰島素小鼠水平
    張水平作品
    小鼠大腦中的“冬眠開關(guān)”
    自己如何注射胰島素
    加強上下聯(lián)動 提升人大履職水平
    米小鼠和它的伙伴們
    門冬胰島素30聯(lián)合二甲雙胍治療老年初診2型糖尿病療效觀察
    糖尿病的胰島素治療
    加味四逆湯對Con A肝損傷小鼠細(xì)胞凋亡的保護作用
    臨床常用胰島素制劑的分類及注射部位
    營救小鼠(5)
    成年女人毛片免费观看观看9| 色精品久久人妻99蜜桃| 18美女黄网站色大片免费观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 成人国产综合亚洲| 欧美日韩国产亚洲二区| 免费观看精品视频网站| 国产成人啪精品午夜网站| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲欧美日韩高清专用| 免费看十八禁软件| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 最近视频中文字幕2019在线8| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 在线免费观看的www视频| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 成人三级做爰电影| 国产97色在线日韩免费| 后天国语完整版免费观看| 青草久久国产| 男人和女人高潮做爰伦理| 我要搜黄色片| 欧美激情在线99| 亚洲七黄色美女视频| 一夜夜www| 日韩欧美免费精品| 亚洲七黄色美女视频| 观看美女的网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 黄色视频,在线免费观看| 久久久久久久午夜电影| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| or卡值多少钱| 日韩欧美免费精品| 制服丝袜大香蕉在线| 久久中文字幕人妻熟女| 一个人免费在线观看的高清视频| 深夜精品福利| 亚洲激情在线av| 国产精品久久久久久精品电影| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产三级在线视频| 12—13女人毛片做爰片一| 18禁观看日本| 亚洲 国产 在线| 国产爱豆传媒在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 午夜福利在线在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲 国产 在线| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 最好的美女福利视频网| 午夜福利18| av天堂在线播放| 国产av在哪里看| 91av网一区二区| 精品国产三级普通话版| 久久久成人免费电影| 国产一区在线观看成人免费| 一a级毛片在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 少妇丰满av| 丰满的人妻完整版| 国产精品免费一区二区三区在线| 黄片小视频在线播放| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 五月玫瑰六月丁香| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久久精品欧美日韩精品| 日本免费a在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 精品久久久久久久毛片微露脸| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲性夜色夜夜综合| or卡值多少钱| 91在线精品国自产拍蜜月 | 午夜福利免费观看在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲精品美女久久av网站| 精品国产美女av久久久久小说| 1024香蕉在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 国产三级黄色录像| 国产精品精品国产色婷婷| 香蕉丝袜av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 精品欧美国产一区二区三| 日本黄色片子视频| 色av中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 韩国av一区二区三区四区| 国产乱人伦免费视频| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 综合色av麻豆| 久久久久久久精品吃奶| 一级作爱视频免费观看| 少妇的丰满在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 可以在线观看毛片的网站| 国产午夜精品论理片| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 好男人在线观看高清免费视频| 免费在线观看亚洲国产| 91麻豆av在线| 一级毛片精品| 99国产精品一区二区三区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日韩人妻高清精品专区| 国产91精品成人一区二区三区| 成年女人永久免费观看视频| 麻豆av在线久日| 久久久国产成人免费| 女人被狂操c到高潮| 成年免费大片在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 一级毛片女人18水好多| 亚洲av片天天在线观看| 岛国在线观看网站| 老汉色∧v一级毛片| 最好的美女福利视频网| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 香蕉丝袜av| 禁无遮挡网站| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 色综合婷婷激情| 国内精品美女久久久久久| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美成人性av电影在线观看| 1024手机看黄色片| 精品久久久久久成人av| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲欧美日韩东京热| 国产一级毛片七仙女欲春2| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 成人国产一区最新在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 免费高清视频大片| 免费搜索国产男女视频| 久99久视频精品免费| 午夜成年电影在线免费观看| 99热这里只有是精品50| 亚洲av成人一区二区三| 久久香蕉精品热| 国产三级中文精品| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 熟女人妻精品中文字幕| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 色综合婷婷激情| 亚洲国产高清在线一区二区三| av天堂在线播放| 国产精品久久久人人做人人爽| 日韩三级视频一区二区三区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品 欧美亚洲| 一级毛片高清免费大全| 老司机在亚洲福利影院| 午夜影院日韩av| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久中文字幕一级| 精品一区二区三区视频在线 | 国产精品 欧美亚洲| 国产亚洲精品一区二区www| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产真实乱freesex| 国产精品国产高清国产av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美一级a爱片免费观看看| 51午夜福利影视在线观看| 日本 欧美在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| h日本视频在线播放| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产黄a三级三级三级人| 在线观看午夜福利视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产av在哪里看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲精品久久国产高清桃花| av片东京热男人的天堂| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产精品1区2区在线观看.| 床上黄色一级片| 18美女黄网站色大片免费观看| 校园春色视频在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲激情在线av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国内精品久久久久久久电影| 91老司机精品| 九九在线视频观看精品| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲在线观看片| 女同久久另类99精品国产91| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 免费大片18禁| 中出人妻视频一区二区| 搞女人的毛片| 精品人妻1区二区| 久久久国产精品麻豆| 精品欧美国产一区二区三| 午夜久久久久精精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 无遮挡黄片免费观看| 露出奶头的视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 日本一本二区三区精品| 国产精品99久久久久久久久| 久久久久久九九精品二区国产| avwww免费| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产淫片久久久久久久久 | 18美女黄网站色大片免费观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲第一电影网av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 大型黄色视频在线免费观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| www.www免费av| 伦理电影免费视频| 日韩精品中文字幕看吧| 久久人人精品亚洲av| 亚洲av电影在线进入| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | svipshipincom国产片| 国产免费男女视频| 色在线成人网| 哪里可以看免费的av片| 欧美在线一区亚洲| 老司机午夜福利在线观看视频| 一本综合久久免费| 此物有八面人人有两片| 国产高清视频在线观看网站| 欧美黑人巨大hd| 少妇的丰满在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 给我免费播放毛片高清在线观看| 天堂影院成人在线观看| 婷婷亚洲欧美| 午夜a级毛片| 国产精品 国内视频| 国产 一区 欧美 日韩| 国产视频一区二区在线看| 丁香欧美五月| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品野战在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲欧美日韩高清专用| 一级毛片精品| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜福利免费观看在线| 三级毛片av免费| 真人做人爱边吃奶动态| 男人舔女人的私密视频| 国产一区二区在线av高清观看| 国产美女午夜福利| 中文字幕高清在线视频| 国产三级中文精品| 天天添夜夜摸| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 99国产精品99久久久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 舔av片在线| 免费看日本二区| 国产乱人伦免费视频| 国产高清激情床上av| www.www免费av| 亚洲在线观看片| 国内精品美女久久久久久| 久久精品影院6| 美女 人体艺术 gogo| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 午夜福利在线在线| 日本免费a在线| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品98久久久久久宅男小说| www日本黄色视频网| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产精品99久久99久久久不卡| 99精品欧美一区二区三区四区| 后天国语完整版免费观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美一区二区国产精品久久精品| 无人区码免费观看不卡| 99久久99久久久精品蜜桃| 日韩欧美精品v在线| 男女视频在线观看网站免费| www.精华液| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影| tocl精华| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产野战对白在线观看| 黄频高清免费视频| 女人被狂操c到高潮| av福利片在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 亚洲精品456在线播放app | 悠悠久久av| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 老司机午夜十八禁免费视频| 国内精品一区二区在线观看| 99久久精品热视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 99久久精品一区二区三区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲七黄色美女视频| 黄色丝袜av网址大全| 又紧又爽又黄一区二区| 国产一区二区激情短视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲av成人av| 欧美色欧美亚洲另类二区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产三级中文精品| 国产精品av久久久久免费| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲18禁久久av| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产黄片美女视频| 宅男免费午夜| 久久久国产成人免费| 国产伦一二天堂av在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 一本久久中文字幕| 亚洲av片天天在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产综合懂色| 好男人电影高清在线观看| 99国产综合亚洲精品| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲成人久久性| 色综合站精品国产| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 九九在线视频观看精品| 麻豆国产97在线/欧美| 国产免费av片在线观看野外av| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 在线免费观看的www视频| 91麻豆av在线| 色哟哟哟哟哟哟| 91在线精品国自产拍蜜月 | 亚洲男人的天堂狠狠| 熟女电影av网| 亚洲无线在线观看| 欧美中文综合在线视频| 一区二区三区高清视频在线| 久久中文字幕人妻熟女| 久久久久精品国产欧美久久久| 悠悠久久av| 亚洲七黄色美女视频| 成人18禁在线播放| av天堂在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 在线观看舔阴道视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品爽爽va在线观看网站| 校园春色视频在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜福利18| 99精品久久久久人妻精品| 日本熟妇午夜| 床上黄色一级片| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产精品久久久久久精品电影| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久国产精品影院| 成在线人永久免费视频| 在线播放国产精品三级| 亚洲真实伦在线观看| 十八禁人妻一区二区| 黑人操中国人逼视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 青草久久国产| 老司机深夜福利视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美三级亚洲精品| 欧美在线一区亚洲| 麻豆一二三区av精品| 国产精品久久久久久精品电影| 在线观看免费午夜福利视频| 婷婷精品国产亚洲av| 久久久久久大精品| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产野战对白在线观看| 午夜精品在线福利| www日本在线高清视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| svipshipincom国产片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品一区二区三区四区久久| 男女之事视频高清在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产激情久久老熟女| 成人国产一区最新在线观看| 国产精品久久视频播放| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲18禁久久av| 亚洲avbb在线观看| 久久精品人妻少妇| 桃红色精品国产亚洲av| 日韩国内少妇激情av| 露出奶头的视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 91av网一区二区| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 中文字幕精品亚洲无线码一区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 嫩草影院精品99| 亚洲在线观看片| 99久久精品热视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 丝袜人妻中文字幕| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲无线在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲片人在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久久久国内视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 天堂√8在线中文| 欧美大码av| 亚洲片人在线观看| 中出人妻视频一区二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 美女 人体艺术 gogo| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 人人妻人人看人人澡| 亚洲熟妇熟女久久| 黄色丝袜av网址大全| 精品国产三级普通话版| 国产97色在线日韩免费| www.自偷自拍.com| 亚洲欧美日韩高清专用| av天堂中文字幕网| 亚洲黑人精品在线| 99国产精品一区二区三区| 99国产综合亚洲精品| 看片在线看免费视频| 波多野结衣高清作品| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 夜夜夜夜夜久久久久| 波多野结衣高清无吗| tocl精华| 成人特级黄色片久久久久久久| www.www免费av| 国产精品一区二区精品视频观看| а√天堂www在线а√下载| 国产亚洲精品av在线| 亚洲av电影在线进入| 看黄色毛片网站| 麻豆国产97在线/欧美| 日本一本二区三区精品| 久久99热这里只有精品18| 人妻久久中文字幕网| 少妇人妻一区二区三区视频| 美女高潮的动态| 此物有八面人人有两片| 熟女人妻精品中文字幕| 999精品在线视频| 禁无遮挡网站| 麻豆成人av在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| h日本视频在线播放| 日韩欧美免费精品| 91九色精品人成在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品影院久久| 国产美女午夜福利| 日韩欧美 国产精品| 免费观看的影片在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 男女视频在线观看网站免费| 国内精品一区二区在线观看| 我要搜黄色片| 一个人看视频在线观看www免费 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久中文字幕一级| 欧美乱码精品一区二区三区| or卡值多少钱| 国产熟女xx| 亚洲性夜色夜夜综合| 中文资源天堂在线| 一个人免费在线观看电影 | 淫秽高清视频在线观看| 成人欧美大片| 国产精品九九99| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 丁香六月欧美| 欧美性猛交黑人性爽| 色综合婷婷激情| 九九热线精品视视频播放| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 哪里可以看免费的av片| 精品国内亚洲2022精品成人| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 男女床上黄色一级片免费看| 久久久精品大字幕| 国产高清视频在线观看网站| 脱女人内裤的视频| 成人特级av手机在线观看| 麻豆一二三区av精品| 88av欧美| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产成人福利小说| 一级毛片精品| 午夜福利免费观看在线| 黑人操中国人逼视频| 黄频高清免费视频| 国内精品一区二区在线观看| cao死你这个sao货| av福利片在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 又紧又爽又黄一区二区| 黄片大片在线免费观看| 老汉色∧v一级毛片| 欧美日韩福利视频一区二区| 午夜免费成人在线视频| x7x7x7水蜜桃| 国产av在哪里看| 中出人妻视频一区二区| 最新中文字幕久久久久 | 亚洲色图av天堂| 性色avwww在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 欧美日韩福利视频一区二区| av中文乱码字幕在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品国产美女av久久久久小说| 国产人伦9x9x在线观看| 久久久久久久久久黄片| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品,欧美在线| 怎么达到女性高潮| 色综合站精品国产| 日韩国内少妇激情av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美三级亚洲精品| av女优亚洲男人天堂 | 在线免费观看不下载黄p国产 | 美女免费视频网站| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 色吧在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久久久免费精品人妻一区二区| 岛国在线免费视频观看| 女同久久另类99精品国产91| 久9热在线精品视频| 日韩精品青青久久久久久| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品av视频在线免费观看| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产精品99久久久久久久久|