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    8周跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt通路的影響

    2017-08-01 00:43:34沈江振唐東輝
    關(guān)鍵詞:胰島素小鼠水平

    李 娟,沈江振,陳 巍,唐東輝

    (1.燕山大學(xué)體育學(xué)院,河北 秦皇島 066004;2.河北科技師范學(xué)院體育系,河北 秦皇島 066004;3.北京師范大學(xué)體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院,北京 100875)

    8周跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt通路的影響

    李 娟1,沈江振2,陳 巍2,唐東輝3

    (1.燕山大學(xué)體育學(xué)院,河北 秦皇島 066004;2.河北科技師范學(xué)院體育系,河北 秦皇島 066004;3.北京師范大學(xué)體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院,北京 100875)

    目的:探討運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PIK3/Akt信號(hào)通路的影響,揭示運(yùn)動(dòng)鍛煉降低肥胖者心血管病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)生物學(xué)機(jī)制。方法:將雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(CG, n=12)與高脂膳食組(HG, n=33),肥胖模型建立后,HG隨機(jī)分為肥胖組(OG, n=11)與肥胖運(yùn)動(dòng)組(OEG, n=13),OEG小鼠接受8周跑臺(tái)訓(xùn)練(12 m/min,60 min/ time,1 time/ d,6 d/w),記錄小鼠體重及能量攝入,免疫組織化學(xué)及western blot檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮IRS1、p-IRS1(Ser307)、Akt及 p-Akt(Thr308)水平的變化。結(jié)果:1)OEG小鼠體重較OG下降(P<0.01);2)OEG小鼠胰島素水平及HOMA-IR較OG顯著下降(P<0.05,P<0.05);3)OEG小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮p-IRS1(Ser307)表達(dá)較OG降低(P<0.05),p-Akt(Thr308)表達(dá)較OG顯著上升(P<0.05)。結(jié)論:8周跑臺(tái)訓(xùn)練可降低肥胖小鼠體重增長(zhǎng),改善胰島素抵抗,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。

    運(yùn)動(dòng);肥胖小鼠;胰島素抵抗;血管內(nèi)皮細(xì)胞; PI3K/Akt通路

    由于人類生活方式發(fā)生了變化,導(dǎo)致肥胖(obesity)在全球范圍內(nèi)普遍流行,極大促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病、冠心病、高血壓等心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]。血管內(nèi)皮功能障礙(endothelial dysfunction)是血管病變的啟動(dòng)環(huán)節(jié),幾乎與所有的心血管疾病存在密切聯(lián)系[2-3]。大量研究證實(shí),肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗(insulin resistance)在血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生過程中具有關(guān)鍵性作用[3]。生理?xiàng)l件下,胰島素可通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上胰島素受體激活經(jīng)磷酸肌醇3激酶(PIK3)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路,增加一氧化氮(NO)釋放,促進(jìn)血管舒張[4]。但在肥胖狀態(tài)下,多種因素導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的能力下降,血管舒張功能減弱,進(jìn)而增加上述心血管疾病罹患風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。越來(lái)越多的研究提示,提高身體活動(dòng)水平或規(guī)律的運(yùn)動(dòng)鍛煉可以顯著降低肥胖者心血管疾病的發(fā)病率與死亡率[6-9],但其中的生物學(xué)機(jī)制并未完全闡明。在前期研究的基礎(chǔ)上,本研究主要探討8周跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)及其磷酸化水平的影響,揭示運(yùn)動(dòng)鍛煉改善肥胖相關(guān)血管內(nèi)皮功能障礙、降低心血管病風(fēng)險(xiǎn)的生物學(xué)機(jī)制。

    1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組 雄性C57BL/6小鼠(6 weeks,15.62±1.45g,n=45),由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,小鼠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食飲水,明暗交替周期為12h,動(dòng)物房溫度為25℃±2℃,相對(duì)濕度為45%±10%。小鼠在動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后隨機(jī)分為2組:對(duì)照組(CG,n=12)、高脂膳食組(HG,n=33),12周后將肥胖建模成功的小鼠(n=24)再隨機(jī)分為肥胖組(OG,n=11)、肥胖運(yùn)動(dòng)組(OEG,n=13)。

    1.2 肥胖小鼠模型的建立 適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后,CG小鼠進(jìn)食普通飼料(2.90kcal/g,13%脂肪,64%糖,23%蛋白質(zhì));OG與OEG小鼠進(jìn)食高脂飼料(4.20kcal/g,51%脂肪,33%糖,16%蛋白質(zhì))。喂養(yǎng)12周后,將小鼠體重超過CG小鼠平均體重20%作為肥胖模型成功標(biāo)準(zhǔn)。剔除體重未達(dá)標(biāo)的小鼠,然后,OG與OEG小鼠繼續(xù)采用高脂飼料喂養(yǎng),OEG開始進(jìn)行為期8周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù),CG與OG小鼠不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

    1.3 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案 運(yùn)動(dòng)干預(yù)采用電動(dòng)跑臺(tái)訓(xùn)練(成都泰盟,F(xiàn)T-200),跑臺(tái)坡度為0度,恒定跑速為12m/ min,每次訓(xùn)練時(shí)間為60min,每日訓(xùn)練1次,每周連續(xù)訓(xùn)練6天,連續(xù)進(jìn)行6周。

    1.4 能量攝入及體重的計(jì)算 實(shí)驗(yàn)期間,每日詳細(xì)記錄小鼠進(jìn)食行為與攝食量,每周計(jì)算1次24h平均能量攝入量及食物消耗量。小鼠24h能量攝入量(kcal/24h)= 食物消耗量(g/24h)×食物的能量密度(kcal/g)。每24h稱量一次小鼠體重(0.1g)。

    1.5 樣品采集及處理 最后一次運(yùn)動(dòng)結(jié)束48h后,每組取6只小鼠,用5%的水合氯醛溶液對(duì)小鼠腹腔注射(0.5 ml/10g),深度麻醉后,眼球取血,將全血放入離心管,以3500rp/min離心10min后,分離血清,分裝后置4℃環(huán)境待測(cè);打開胸腔,分離主動(dòng)脈,取結(jié)締組織,生理鹽水洗凈,取適當(dāng)長(zhǎng)度置4%多聚甲醛溶液中固定,剩余血管組織用液氮冷凍后低溫保存。

    1.6 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 小鼠血糖水平采用血糖儀(OMRON,中國(guó))檢測(cè);胰島素水平采用ELISA法測(cè)定,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒(美國(guó)R&D公司)說明書進(jìn)行。穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),HOMAIR=空腹胰島素(mIU/L)×空腹血糖(mmol/L)/ 22.5。

    1.7 免疫組織化學(xué) 將甲醛固定后的小鼠主動(dòng)脈進(jìn)行石蠟包埋,休塊后,以5μm的厚度切片,將其附貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上,37℃過夜,脫蠟,蒸餾水洗3次,5%BSA封閉30min,滴加一抗孵育,4℃過夜。PBS沖洗10min×3次,滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,37℃靜置30min。PBS沖洗2min×3次;滴加試劑SABC,37℃靜置30min,PBS沖洗5min×3次,經(jīng)DAB顯色后采用蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,中性樹膠封片,采用Image-Pro Plus6.0軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)高倍視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(average optical density, AOD)。

    1.8 Western blot檢測(cè) 小鼠血管內(nèi)皮組織蛋白表達(dá)采用Western blot法,將適量血管組織進(jìn)行剪切后放置預(yù)冷的勻漿器充分研磨后,加入適量裂解液裂解30min,以12 000r/min離心10min取上清液分裝,BCA法測(cè)定蛋白濃度。依次上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入稀釋的單克隆抗體,孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育60min,將ECL工作液加置PVDF膜,室溫下孵育5min后用保鮮膜包好PVDF膜,經(jīng)顯影、曝光、洗膜、封閉。將β-actin單克隆抗體按1∶500稀釋到一抗稀釋液中,室溫下?lián)u動(dòng)60min,按上述方法得到內(nèi)參條帶,將膠片用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各變量組間均數(shù)的比較采用方差分析(one way ANOVA),顯著性水平均為P<0.05。

    2 結(jié) 果

    2.1 小鼠體重變化 從第6周開始HG小鼠體重顯著高于CG小鼠(P<0.01)。第12周開始進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù),將HG中符合肥胖標(biāo)準(zhǔn)的小鼠隨機(jī)分為OG與OEG,與OG比較,OEG小鼠從第15周開始體重顯著下降(P<0.01)(圖1A)。

    圖1 小鼠體重與能量攝入變化

    2.2 小鼠能量攝入變化 HG小鼠在整個(gè)飼養(yǎng)過程中每日能量攝入顯著高于CG(P<0.01);運(yùn)動(dòng)干預(yù)開始后,OEG小鼠每日能量攝入在第13周、第14周均顯著高于OG(P<0.01),從第15周至第20周每日能量攝入,兩組未見顯著差異(圖1B)。

    2.3 小鼠血糖、胰島素及HOMA-IR的比較 與CG比較,OG小鼠血糖水平未見顯著變化,但胰島素水平及HOMA-IR卻顯著升高(P<0.01,P<0.05);與OG比較,OEG小鼠胰島素水平及HOMA-IR均顯著下降(P<0.05,P<0.05)(圖2)。

    圖2 小鼠血糖、胰島素及HOMA-IR的比較

    2.4 小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的IRS1與Akt表達(dá)及磷酸化水平比較 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,位于血管內(nèi)皮細(xì)胞層的目標(biāo)蛋白的免疫陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色染色(圖3)。與CG比較,OG小鼠血管內(nèi)皮IRS1及Akt的蛋白表達(dá)未發(fā)生顯著變化,但p-IRS1的表達(dá)水平非常顯著升高(P<0.01),而p-Akt的表達(dá)非常顯著降低(P<0.01);與OG比較,OEG小鼠血管內(nèi)皮p-IRS1顯著降低(P<0.05),p-Akt表達(dá)顯著增高(P<0.05)(圖4)。

    圖3 小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞p-IRS-1及p-Akt的定位表達(dá)

    圖4 小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞IRS1、Akt的蛋白表達(dá)及磷酸化水平比較

    3 討 論

    伴隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的快速發(fā)展,肥胖在發(fā)達(dá)與發(fā)展中國(guó)家已成為影響人類健康的社會(huì)問題,也成為決定疾病模式變化的重要因素[1]。其中,胰島素抵抗是指胰島素靶組織對(duì)正常劑量的胰島素敏感性下降,即生理劑量的胰島素不能夠維持其正常的生理功能,胰島素抵抗是聯(lián)系肥胖與多種代謝異常的重要紐帶。除了經(jīng)典的靶組織,如骨骼肌、脂肪及肝臟組織外,胰島素還可以通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體,激活胰島素受體底物(IRS),通過PI3K或者絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮源性舒張因子與收縮因子的釋放,調(diào)控血管平滑肌舒張與收縮[4-5]。肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗可通過引起血管內(nèi)皮功能障礙,增加心血管病風(fēng)險(xiǎn)[5]。充分的證據(jù)表明,規(guī)律的運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)降低肥胖者代謝性疾病風(fēng)險(xiǎn)具有重要的意義[6-8]。但相關(guān)生物學(xué)機(jī)制并未完全闡明。

    本研究發(fā)現(xiàn),肥胖小鼠的胰島素抵抗指數(shù)較正常小鼠明顯增加,血管內(nèi)皮p-IRS1(Ser307)水平明顯增加,而p-Akt(Thr308)水平卻顯著下降,這提示肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt信號(hào)途徑存在障礙。研究表明,胰島素作用于內(nèi)皮細(xì)胞受體后,可通過IR/IRS/ PI3K/Akt信號(hào)通路增加一氧化氮合酶(eNOS)的活性,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成NO[9-11]。另一方面,胰島素還可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的MAPK通路促進(jìn)內(nèi)皮素(ET-1)的釋放,NO與ET-1是體內(nèi)最重要的舒血管物質(zhì)和縮血管物質(zhì),這兩種物質(zhì)保持平衡是維持血管張力正常的重要基礎(chǔ)[11]。對(duì)于IRS1而言,胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生障礙后,其酪氨酸磷酸化水平會(huì)下降,而絲氨酸磷酸化水平會(huì)增加,進(jìn)而導(dǎo)致PI3K依賴的胰島素信號(hào)通路抑制,NO合成降低,但是血管內(nèi)皮細(xì)胞MAPK信號(hào)依然正常,這就造成血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1的分泌量相對(duì)增加,最終導(dǎo)致血管趨向于收縮[5,12]。血管持續(xù)收縮會(huì)產(chǎn)生許多不良結(jié)果,一方面會(huì)使動(dòng)脈血壓增加;另一方面會(huì)導(dǎo)致胰島素的靶組織血流灌注量降低,增加胰島素抵抗的程度[3,13]。肥胖者血管內(nèi)皮功能障礙主要的原因就是血管內(nèi)皮細(xì)胞NO合成減少所致[3,6]。這可能是胰島素抵抗增加肥胖人群心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的重要原因之一。本研究還發(fā)現(xiàn),經(jīng)過8周跑臺(tái)訓(xùn)練后,肥胖小鼠體重增長(zhǎng)速度與胰島素抵抗指數(shù)均顯著降低。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),8周跑臺(tái)訓(xùn)練顯著降低了肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞p-IRS1(Ser307)水平,而p-Akt(Thr308)水平卻顯著升高。這提示運(yùn)動(dòng)干預(yù)可促進(jìn)肥胖小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),改善胰島素抵抗。

    目前,運(yùn)動(dòng)鍛煉改善肥胖相關(guān)胰島素抵抗的機(jī)制已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。本研究結(jié)果提示,運(yùn)動(dòng)干預(yù)可顯著改善肥胖小鼠胰島素抵抗,提高血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),這二者之間可能存在密切聯(lián)系。由于胰島素抵抗被認(rèn)為是孕育多種代謝性疾病的“共同土壤”,因此,肥胖者應(yīng)重視通過規(guī)律的運(yùn)動(dòng)鍛煉改善胰島素抵抗與血管內(nèi)皮功能,這可能會(huì)成為肥胖者降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的重要策略。

    4 結(jié) 論

    8周跑臺(tái)訓(xùn)練可以明顯降低肥胖小鼠體重增長(zhǎng),改善胰島素抵抗,同時(shí)還可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素PI3K/ Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這可能是規(guī)律運(yùn)動(dòng)鍛煉降低肥胖者心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的重要生物學(xué)機(jī)制之一。

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    Effects of 8-week Treadmill Training on PI3K/Akt Pathway in Vascular Endothelial Cells of Obese Mice

    LI Juan1, SHEN Jiang-zhen2, CHEN Wei2, TANG Dong-hui3
    (1. College of Physical Education,Yanshan University,Qinhuangdao 066004,Hebei China;2. Department of Physical Education, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066004, Hebei China;3. P.E. and Sport College, Beijing Normal University, Beijing 100875, China)

    The objective of this study is to investigate the effect of treadmill exercise on PI3K/Akt pathway of vascular endothelial cells in obese mice. Methods: male C57BL/6 mice were randomly divided into control group (CG, n=12) and high fat group (HG, n=33). HG were randomly divided into obesity group (OG, n=11) and obesity group (OEG, n=13) after obese model induced by high fat diet, OEG mice were taken treadmill exercise for 8 weeks (12 m/min, 60 min/ time, 1 time/d, 6 d/w); the body weight and energy intake were recorded, the IRS1, p-IRS1(Ser307), Akt and p-Akt (Thr308) in aortic endothelium were detected by immunohistochemistry and western blot. Results: 1) the body weight of OEG mice was lower than CG (P < 0.01). 2) The insulin level and HOMA-IR signif i cantly increased in OG (P < 0.01, P < 0.01); and insulin levels and HOMA-IR signif i cantly decreased in OEG compared with OG (P < 0.05, P < 0.01). 3) The expression of TH in VTA-NAc system was lower in OG than CG (P < 0.01); and was morein OEG than OG (P < 0.05). The expression p-IRS1(Ser307) in OEG was lower than OG (P < 0.05), and the p-Akt (Thr308) expression was more in OEG than OG (P < 0.05). Conclusion: 8-week treadmill training can decrease weight gain, improve insulin resistance, and promote insulin PI3K/Akt signaling pathway in vascular endothelial cells in obese mice.

    exercise; obese mice; insulin resistance; endothelial cell; PI3K/Akt signaling

    G804.2

    A

    1004 - 7662(2017)04- 0084- 05

    2017-03-03

    國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào):81472992);燕山大學(xué)青年教師自主研究計(jì)劃課題資助(項(xiàng)目編號(hào):14LGB030)。

    李娟,講師,碩士,研究方向:運(yùn)動(dòng)防治肥胖生物學(xué)機(jī)制。

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