尋常型銀屑病中醫(yī)三證型形成與皮膚組織中JAK1/STAT3信號通路關(guān)系的研究

張潤田 陳 曦 李玲玲 杭海燕 段行武

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100107； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院東區(qū)，北京，101100)

尋常型銀屑病中醫(yī)三證型形成與皮膚組織中JAK1/STAT3信號通路關(guān)系的研究

張潤田1陳 曦2李玲玲1杭海燕1段行武1

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100107； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院東區(qū)，北京，101100)

目的：探討尋常型銀屑病血熱、血瘀、血燥證形成與皮膚組織中JAK1/STAT3信號通路的關(guān)系。方法：選取2013年10月至2014年10月東直門醫(yī)院皮膚科門診和病房收治的尋常型銀屑病患者18例(嚴格中醫(yī)辨證分為血熱證、血瘀證、血燥證三型)，正常人受試者6例，記錄患者一般情況，用RT-PCR法檢測各組受試者皮膚組織中IL-22R1、JAK1、STAT3、C-myc、VEGF的mRNA表達差異。結(jié)果：檢測24例受試者皮膚組織，IL-22R1、JAK1、STAT3、C-myc的mRNA表達相互間均呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；血熱證患者皮損中，IL-22R1、JAK1、STAT3、C-myc的mRNA表達均明顯高于正常人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，血燥證IL-22R1、JAK1、STAT3的mRNA表達高于正常人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：JAK1/STAT3信號通路的異?；钴S，可能是銀屑病血熱證臨床表現(xiàn)形成的重要因素；且JAK/STAT信號通路活化差異可能與血熱證向血瘀、血燥證轉(zhuǎn)變的過程相關(guān)。

銀屑??；中醫(yī)證型；JAK1/STAT3信號通路

銀屑病是臨床常見的慢性炎性反應(yīng)性皮膚病，固有免疫系統(tǒng)中各種炎性反應(yīng)因子和粘附分子刺激導(dǎo)致T細胞發(fā)生活化和分化，進而介導(dǎo)角質(zhì)形成細胞(Keratocyte，KC)異常增殖凋亡是本病重要的病理學(xué)改變[1]。在這一病理過程中Janus激酶(Janus Kinase，JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Transducer and Activator of Transcription，STAT)通路發(fā)揮重要作用[2]。JAK1/STAT3信號通路是KC內(nèi)信息傳遞的一條通道[3]，IL-22通過與KC表面的特異性受體IL-22R1結(jié)合，活化KC內(nèi)的JAK1/STAT3信號傳導(dǎo)通路，進而誘導(dǎo)其下游的細胞周期調(diào)控因子原癌基因(C-myc)表達，從而改變KC增殖、凋亡周期，形成銀屑病表皮增殖凋亡異常的病理改變[4]。本研究擬采用RT-PCR技術(shù)檢測尋常型銀屑病患者皮損中通路特異性受體IL-22R1，通路關(guān)鍵因子JAK1、STAT3，以及通路下游細胞周期調(diào)控基因C-myc的mRNA表達，以探究JAK1/STAT3信號通路介導(dǎo)的KC異常增殖，在尋常型銀屑病血熱、血瘀、血燥3大基本中醫(yī)證型形成中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。尋常型銀屑病患者皮損組織包括：血熱證、血瘀證、血燥證各6例，均為2013年10月至2014年10月東直門醫(yī)院皮膚科門診和病房收治患者。正常對照組健康人皮膚組織6例取自東直門醫(yī)院手術(shù)室捐獻者健康皮膚。所有受試者近2周內(nèi)未接受外用藥治療，且無心、腦血管，肝、腎及造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病。所有皮膚組織樣本收集后立即放入液氮，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 Trizol購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒(批號：CW0581)，反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒(批號：CW0744)，PCR擴增試劑盒(批號：CW0716A)均購自北京康為世紀公司。

1.3 方法

1.3.1 引物合成 內(nèi)參基因β-actin以及IL-22R1、JAK1、STAT3、C-myc的引物由上海生工公司合成，引物序列如下：β-actin上游引物5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′；IL-22R1上游引物5′-TTTCAGCTTTGCTCTGGTCA-3′，下游引物5′-GGTGGCTTGAGGGTAGTGTG-3′；JAK1上游引物5′-AGTGCCCTGAGCTACTTGGA-3′，下游引物5′-AGGTCAGCCAGCTCCTTACA-3′；STAT3上游引物5′-GGAGGAGGCATTCGGAAG-3′，下游引物5′-ATCTGTGTGACACCAACGA-3′；C-myc上游引物5′-CGTCCTCGGATTCTCTGCTC-3′，下游引物5′-GCTGGTGCATTTTCGGTTGT-3′。

1.3.2 樣本RNA提取及濃度純度測定 加入1 mL Trizol，在液氮下研磨50 mg皮膚組織樣本，提取步驟按試劑說明書進行，提取物即總RNA稀釋50倍測定其純度為OD260/OD280的比值(1.8～2.0)，測定總RNA濃度為2×OD260。然后以2 μL loading buffer加入8 μL提取物中，進行瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測樣本是否降解。

1.3.3 cDNA合成 將無RNA酶水11 μL、模板2 μL，oligo dT 2 μL加入反應(yīng)管中，掌上離心機離心后在65 ℃下孵育5 min，在4 ℃下10 min。在向上述反應(yīng)管中加入5×RT mix 4 μL、Enzyme Mix 1 μL，掌上離心機離心后在37 ℃下孵育40 min，70 ℃保溫10 min。然后在-20 ℃中長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PCR反應(yīng) 在反應(yīng)管中加入10 μL 2×PCR Mixture、10 μM上下游引物各1 μL、cDNA模板2 μL、無RNA酶水6 μL，配成20 μL反應(yīng)體系。上機后設(shè)置PCR擴增條件為預(yù)變性95 ℃ 10 min，(95 ℃15 s，59 ℃ 60 s)×30個循環(huán)。取擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果并拍照。

1.3.5 圖像分析和數(shù)據(jù)處理 用GelPro3.2圖像分析系統(tǒng)對β-actin、IL-22R1、JAK1、STAT3、C-myc的擴增產(chǎn)物進行灰度值分析，計算IL-22R1/β-actin、JAK1/β-actin、STAT3/β-actin、C-myc/β-actin的比值，以此代表IL-22R1、JAK1、STAT3、C-myc的mRNA相對水平。

圖1 各組指標RT-PCR結(jié)果

注：M.DNA分子量標準；1.正常人組；2.血熱證組；3.血瘀證組；4.血燥證組。

2 結(jié)果

2.1 受試者一般情況 入組銀屑病患者中男13例(占72.2%)，女5例(占27.8%)，正常人組男3例(占50%)，女3例(占50%)，性別分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。入組銀屑病患者最大年齡65歲，最小30歲；正常人年齡最大49歲，最小33歲。其中，血熱證組平均年齡(48.50±8.55)歲，血瘀證組平均年齡(48.67±10.73)歲，血燥證組平均年齡(52.00±12.36)歲，正常人組平均年齡(44.50±8.87)歲，各組年齡分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。入組銀屑病患者病程，血熱證組平均值為(12.67±8.02)年，血瘀證組平均值為(10.67±7.74)年，血燥證組平均值為(16.33±11.57)年，各組間病程長短差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。入組銀屑病患者PASI評分，血熱證組平均值為(12.30±8.96)，血瘀證組平均值為(11.26±5.09)，血燥證組平均值為(13.23±9.79)，各組間PASI評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。受試者一般情況均差異無統(tǒng)計學(xué)意義，組間存在可比性。

2.2 PCR產(chǎn)物鑒定 對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，以DNA標記Marker作為參照，IL-22R1的mRNA擴增片斷大小為194bp，JAK1為371bp，STAT3為174bp，C-myc為380bp，β-actin為205bp，與設(shè)計相符。見圖1。

2.3 IL-22R1、JAK1、STAT3、C-myc的mRNA表達相關(guān)性分析 全體受試者IL-22R1與通路因子JAK1(r=0.42，P<0.05)、STAT3(r=0.59，P<0.01)呈正相關(guān)，與通路下游因子C-myc(r=0.60，P<0.01)呈正相關(guān)。JAK1與通路因子STAT3(r=0.48，P<0.05)呈正相關(guān)。STAT3與通路下游因子C-myc(r=0.56，P<0.01)呈正相關(guān)。

2.4 RT-PCR檢測結(jié)果 通路特異性受體IL-22R1的mRNA表達，血熱證、血燥證均明顯高于正常人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；血瘀證與正常人差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3證型之間比較，血熱證明顯高于血瘀證，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；血燥證高于血瘀證，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；通路因子JAK1的mRNA表達，血熱證明顯高于正常人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；血燥證高于正常人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；血瘀證與正常人，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3證型之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。通路因子STAT3的mRNA表達，血熱證、血燥證均明顯高于正常人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；血瘀證高于正常人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3證型之間比較，血熱證高于血瘀證，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通路下游因子C-myc的mRNA表達，血熱證明顯高于正常人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；血瘀證、血燥證與正常人差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3證型之間比較，血熱證明顯高于血瘀證，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

3 討論

JAK/STAT是由膜至核的信號通路，激活本通路關(guān)鍵因子STAT3影響細胞的生長增殖[5]。STAT3的活化是通過SATA3分子酪氨酸殘基的磷酸化而實現(xiàn)的，磷酸化的STAT3形成二聚體進入細胞核內(nèi)，通過信號識別與下游靶基因啟動子的特異性位點結(jié)合，調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達[6]。IL-22R1是IL-22特異性結(jié)合位點，在皮膚中主要表達于KC[7-8]。IL-22能通過活化銀屑病患者KC中的STAT3信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)其下游的細胞周期調(diào)控因子C-myc表達。C-myc是非常重要的細胞生長周期調(diào)控因子，能參與細胞的生長、分化過程，其表達高低對于細胞從分裂前(G1)期進入分裂(S)期極為重要。高水平的C-myc表達使細胞大量增殖，而分化受到抑制[9]。在銀屑病患者體內(nèi)，C-myc表達明顯增多[4]，使KC大量增殖、分化抑制，進而出現(xiàn)表皮角化過度伴角化不全的病理改變。在本研究中，我們通過檢測銀屑病患者皮膚組織中IL-22R1、JAK1、STAT3、C-myc的mRNA表達水平的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，各因子之間均呈正先關(guān)，證明隨著配體與通路特異性受體IL-22R1結(jié)合，JAK1/STAT3通路活化開放，下游因子C-myc的mRNA表達水平也同時上調(diào)。而C-myc表達增加主要改變KC增殖、凋于周期，使表皮增殖凋亡異常，出現(xiàn)表皮角化不全的表現(xiàn)。

“辨血為主，從血論治”是銀屑病的基本辨證思路[10]，歷代醫(yī)家通過大量臨床實踐，總結(jié)出血熱證、血燥證、血瘀證3大銀屑病基本證型[11]。其中，血熱證可以說是銀屑病發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，也是向血瘀、血燥證轉(zhuǎn)變的樞機[12]。銀屑病初起或復(fù)發(fā)加重時皮疹特點為皮疹鮮紅、新疹出現(xiàn)或原疹擴大，這些都屬于血熱證的典型表現(xiàn)。血熱證的形成是由于外感淫邪或內(nèi)傷情志或飲食不節(jié)導(dǎo)致的血熱毒盛，熱毒壅于皮膚而發(fā)紅斑、鱗屑；然熱毒內(nèi)盛，煎灼陰液，血行失暢，瘀阻脈絡(luò)，肌膚失養(yǎng)，皮損肥厚、頑固難消，而成血瘀證；熱毒蘊結(jié)日久，耗傷陰血，生風(fēng)化燥，肌膚失養(yǎng)，皮損干燥皸裂、反復(fù)不愈，而呈血燥證[13]。本研究中，我們比較了血熱證、血瘀證、血燥證銀屑病患者皮損中IL-22R1、JAK1、STAT3、C-myc的mRNA表達，結(jié)果顯示JAK1/STAT3信號通路相關(guān)因子的表達呈現(xiàn)血熱證>血燥證>血瘀證的特點，血瘀證表達與正常人差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而我們前期研究[14]發(fā)現(xiàn)JAK1/STAT3通路的啟動因子IL-22在銀屑患者外周血中的水平也呈現(xiàn)血熱證>血燥證>血瘀證的趨勢，這與我們皮損中通路相關(guān)因子的表達趨勢一致。由此可見，在KC異常增殖的病理過程中，血熱證銀屑病患者的JAK1/STAT3信號通路異?；钴S。而正是這種活躍的表達促使C-myc表達增加，使KC增殖凋亡異常，形成了血熱證銀屑病大量脫屑的臨床表現(xiàn)。同時，JAK1/STAT3通路活化程度的差異，也可能與血熱證向血瘀、血燥證轉(zhuǎn)變的過程相關(guān)。

表1 銀屑病3大基本證型與正常人通路相關(guān)因子的mRNA表達水平±s，n=6)

注：與正常人比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與血熱證比較，△△表示P<0.01；與血瘀證比較，▲表示P<0.05，▲▲表示P<0.01。

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(2016-12-08收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Relationship Between Three TCM Syndromes of Psoriasis and JAK/STAT Signaling Pathway

Zhang Runtian1, Chen Xi2, Li Lingling1, Hang Haiyan1, Duan Xingwu1

(DongzhimenHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100007,China)

Objective:To observe the differences between blood heat syndrome, blood dryness syndrome and blood stasis syndrome of psoriasis in JAK/STAT signaling pathways. Methods:A total of 18 psoriasis cases in our hospital were divided into 3 groups based on TCM syndrome differentiation. The three groups were blood heat syndrome group, blood dryness syndrome group and blood stasis syndrome group. And 6 healthy participants also participated in the trail. Their general information was recorded. RT-PCR was employed to test the difference of IL-22R1, JAK1, STAT3 and c-myc in participants′ skin tissue samples. Results:The gene transcription correlation test among 24 psoriasis patients show that IL-22R1, JAK1, STAT3 and c-myc were all positively correlated to each other (P<0.05 orP<0.01). The gene transcriptions of IL-22R1, JAK1, STAT3 and c-myc in blood heat group were significantly higher than healthy case group (P<0.01). In blood dryness group, gene transcription of IL-22R1, JAK1 and STAT3 were higher than healthy group (P<0.05). Conclusion:The active status of JAK/STAT signaling pathway could be an important factor in the formation of psoriasis blood heat syndrome. While the JAK/STAT signaling pathway may result in blood heat syndrome turning into blood dryness syndrome and blood stasis syndrome.

Psoriasis, Chinese medicine syndromes, JAK/STAT signaling pathway

國家自然科學(xué)基金面上項目(81273755)；國家自然科學(xué)基金青年基金(81403403、81403404)

段行武(1965.07—)，男，博士研究生，主任醫(yī)師，皮膚科主任，研究方向：中醫(yī)藥治療銀屑病，E-mail：xwduan@sina.com

R285.6；R758.63

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.07.055