AMP依賴的蛋白激酶/叉頭轉(zhuǎn)錄因子O3a信號(hào)通路及氧化應(yīng)激介導(dǎo)紫鉚因誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞凋亡作用的研究

陳少陽(yáng)++++++岳宏林++++++劉旭

[摘要] 目的 探討紫鉚因（Butein）誘導(dǎo)人食管癌EC109細(xì)胞凋亡的作用及AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）/叉頭轉(zhuǎn)錄因子O3a（FOXO3a）信號(hào)通路、氧化應(yīng)激在該過(guò)程中發(fā)揮的作用。 方法 常規(guī)培養(yǎng)EC109細(xì)胞，分別給予Butein處理，首先檢測(cè)EC109細(xì)胞的活力、遷移能力、氧化應(yīng)激水平及凋亡指標(biāo)Caspase 3的活性。采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)AMPK、FOXO3a的磷酸化水平及凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bim、Bcl2相關(guān)X蛋白（Bax）的表達(dá)水平。用Compound C阻斷AMPK后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。建立裸鼠皮下腫瘤模型，給予Butein和Compound C處理，檢測(cè)裸鼠體重和腫瘤體積。 結(jié)果 Butein處理后，細(xì)胞活力下降（P < 0.05）；細(xì)胞間距增加（P < 0.05）；Caspase 3活性、NADPH氧化酶活性、ROS含量升高（P < 0.05）；總GSH下降，提示凋亡增加、氧化應(yīng)激增強(qiáng)；p-AMPK磷酸化水平、p-FOXO3a磷酸化水平升高（P < 0.05）；Bim、Bax表達(dá)升高（P < 0.05）；Compound C處理逆轉(zhuǎn)了這一過(guò)程。裸鼠皮下腫瘤檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Butein抑制在體腫瘤增殖，阻斷AMPK可以逆轉(zhuǎn)該抑制作用。 結(jié)論 Butein能顯著促進(jìn)食管癌EC109細(xì)胞凋亡。該作用可能是通過(guò)激活A(yù)MPK/FOXO3a信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 紫鉚因；食管癌；AMP依賴的蛋白激酶；叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子O3a；氧化應(yīng)激；凋亡

[中圖分類號(hào)] R735.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（c）-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of Butein on esophagus cancer EC109 cells and the role of AMP-activated protein kinase （AMPK）/forkhead class box O3a （FOXO3a） and oxidative stress in this process. Methods EC109 cell was routine cultured and given Butein， the cell vitality， migration ability， cellular oxidative stress level of EC109 cell and Caspase 3 activity were detected. The AMPK， FOXO3 aphosphorylation level and the expressions of Bim and Bax were detected by Western blot. After Compound C inhibit AMPK， related indicators were detected. The nude mice tumor bearing model was made， Butein and Compound C were given， the weight and tumor volume of nude mice were detected. Results After Butein treatment， cell vitality reduced， the distance between cell boundaries increased， ROS concentration and NADPH oxidase activity increased， total GSH level and Caspase 3 activity reduced （P < 0.05）； AMPKand FOXO3 aphosphorylation and cell apoptosis increased （P < 0.05）； Compound C treatment reversed this process. The nude mice tumor study showed that Butein inhibited the tumor growth and Compound C reversed this effect. Conclusion Butein can induce EC109 cell apoptosis， and this process may be mediated by activation of AMPK/FOXO3a and cellular oxidative stress.

[Key words] Butein； Esophagus cancer； AMP-activated protein kinase； Forkhead class box O3a； oxidative stress； Apoptosis

食管癌是消化系統(tǒng)的常見(jiàn)腫瘤，由于環(huán)境、飲食習(xí)慣等的差異，世界范圍內(nèi)食管癌發(fā)病率差異很大[1]。我國(guó)食管癌高發(fā)，每年有近15萬(wàn)人死于食管癌[2]。多數(shù)患者因吞咽困難就醫(yī)，然而此時(shí)腫瘤多已發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)。因此食管癌的治療需要新的治療策略[3]。目前，祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中藥材提取物的抗癌作用已成為研究熱點(diǎn)[4]，紫鉚因（3，4，2'，4'-四羥基查爾酮，Butein）是漆樹(shù)等植物來(lái)源的多酚類化合物。研究證實(shí)Butein對(duì)包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌等多種腫瘤具有抑制和殺傷作用[5-7]，但Butein抗食管癌作用及機(jī)制尚不明確。AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，也是腫瘤生物學(xué)調(diào)控的核心分子，研究表明Butein對(duì)AMPK有明確的調(diào)控作用[8]。叉頭轉(zhuǎn)錄因子O3a（forkhead class box O3a，F(xiàn)OXO3a）是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在腫瘤細(xì)胞中介導(dǎo)多種促凋亡因子轉(zhuǎn)錄[9-13]。AMPK可調(diào)控FOXO3a的磷酸化水平[14-15]。本研究通過(guò)Butein作用于食管癌EC109細(xì)胞系，證實(shí)AMPK/FOXO3a信號(hào)通路是否介導(dǎo)Butein的抗食管癌作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人食管癌EC109細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。Butein、Compound C購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（美國(guó)）；抗p-FOXO3a抗體、抗FOXO3a抗體、抗Bim、抗Bax抗體購(gòu)自Abcam公司（美國(guó)）；抗p-AMPK抗體、抗AMPK抗體購(gòu)自cell signaling technology公司（美國(guó)）。裸鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SYXK（京）2013-0019。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞處理 食管癌EC109細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，并置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁24 h，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)換成無(wú)血清培養(yǎng)基處理12 h，然后給予相應(yīng)處理。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 以每孔1×105的密度接種到96孔板。將細(xì)胞分為Control組、25 μmol/L But組、50 μmol/L But組。給予相應(yīng)處理，CCK法檢測(cè)細(xì)胞活力。Butein的濃度和處理時(shí)間參考其他腫瘤中Butein相關(guān)研究及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，50 μmol/L Butein對(duì)食管癌EC109細(xì)胞具有較為顯著的殺傷作用[16]。

1.2.3 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 在6孔板背面用Marker筆劃3條橫線，在孔內(nèi)用200 μL的槍頭劃線。洗去漂浮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)，24 h后測(cè)量細(xì)胞邊緣間距并記錄。

1.2.4 檢測(cè)ROS、總GSH含量和NADPH氧化酶含量及細(xì)胞Caspase 3活性

1.2.4.1 ROS檢測(cè) 向上清加入DCFH-DA探針，37℃孵育1 h，消化離心重懸后檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.4.2 GSH檢測(cè) 取50 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入400 μL試劑一，50 μL試劑二，混勻后于室溫靜置2 min，加入200 μL試劑三，30 s時(shí)檢測(cè)412 nm波長(zhǎng)下的吸光度，為A1，靜置5 min后再次檢測(cè)，為A2，計(jì)算出總GSH含量。

1.2.4.3 NADPH氧化酶檢測(cè) 制備蛋白上清液，首先測(cè)定背景對(duì)照，進(jìn)而檢測(cè)樣品總活性，最后檢測(cè)樣品非特異性活性計(jì)算可得NADPH氧化酶活性。

1.2.4.4 Caspase 3活性檢測(cè) 制備蛋白上清，取50 μL細(xì)胞裂解上清，加入50 μL 2×反應(yīng)液，加入0.5 μL的DTT，加入5 μL Ac-DEVD-pNA，37℃孵育4 h后，于405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。

1.3 Western blot

檢測(cè)p-AMPK、AMPK、p-FOXO3a、FOXO3a、Bim、Bax等蛋白的表達(dá)情況，所用抗體及濃度：p-AMPK、AMPK、p-FOXO3a、FOXO3a、Bim、Bax（1∶1500）、β-actin（1∶2000）。

1.4 裸鼠皮下腫瘤的建立及藥物處理

取對(duì)數(shù)期的EC109細(xì)胞，在每只裸鼠肩部皮下注射0.2 mL細(xì)胞液（1×107個(gè)腫瘤細(xì)胞），每天腹腔注射PBS、5 mg/kg Butein、5 mg/kg Butein+1 mg/kg Compound C。每3天稱重，測(cè)量腫瘤體積。第27天處死小鼠并收集腫瘤。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Butein對(duì)食管癌細(xì)胞EC109細(xì)胞系的影響

CCK8染色結(jié)果顯示Butein處理后細(xì)胞活力顯著下降，與Control組相比，活力值分別下降到（70.3±4.6）%、（38.5±4.8）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 Butein對(duì)食管癌EC109細(xì)胞遷移能力的影響

Butein處理，24 h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間隙顯著增大，Butein處理組細(xì)胞間距增加到Control組的（144.0±8.4）%、（208.0±10.6）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 Butein對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3活性和氧化應(yīng)激指標(biāo)NADPH氧化酶活性、活性氧自由基含量、總GSH含量的影響

25 μmol/L的Butein、50 μmol/L的Butein處理24 h后，與Control組相比，Caspase 3活性、NADPH氧化酶活性、ROS含量均升高；總GSH下降。提示凋亡增加、氧化應(yīng)激增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 Western blot檢測(cè)Butein處理后細(xì)胞內(nèi)AMPK、FOXO3a磷酸化水平變化

25 μmol/L的Butein、50 μmol/L的Butein處理后，p-AMPK磷酸化水平升高；p-FOXO3a磷酸化水平升高；Bim、Bax表達(dá)升高；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖4。提示Butein處理后AMPK和FOXO3a激活，凋亡增強(qiáng)。

2.5 Compound C抑制AMPK對(duì)Butein誘導(dǎo)的FOXO3a激活和細(xì)胞凋亡的影響

Compound C是AMPK分子的特異性阻斷劑，將細(xì)胞分為Control組、50 μmol/L的Butein處理組、50 μmol/L的Butein+5 μmol/L Compound C處理組。發(fā)現(xiàn)FOXO3a磷酸化水平分別為Control組的（248.0±16.4）%、（176.0±16.4）%；Bim分別為Control組的（182.5±14.3）%、（142.8±10.2）%；Bax分別為Control組的（251.2±19.1）%、（198.2±12.5）%；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖5。提示Compound C處理一定程度上逆轉(zhuǎn)了Butein的抗EC109作用。

2.6 Butein及Compound C聯(lián)合處理對(duì)裸鼠在體腫瘤的影響

三組裸鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。腫瘤體積分別為（915±39）、（440±34）、（581±38）mm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖6?？梢?jiàn)Butein腹腔注射顯著降低了裸鼠皮下腫瘤色生長(zhǎng)速度，而AMPK活性抑制劑Compound C處理后一定程度上逆轉(zhuǎn)了Butein的抗腫瘤作用。

3 討論

本研究體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Butein處理顯著抑制了EC109細(xì)胞增殖和遷移能力。氧化應(yīng)激指標(biāo)和凋亡指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Butein處理顯著激活了EC109細(xì)胞氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為GSH含量下降、ROS含量增加以及NADPH活性增強(qiáng)。凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Butein處理上調(diào)了Caspase 3的活性、上調(diào)了凋亡相關(guān)蛋白Bim、Bax的表達(dá)。

AMPK在腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中扮演重要角色[17-18]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，AMPK下調(diào)與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，亦有研究發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)MPK可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡[19-20]。上述證據(jù)提示AMPK可能是腫瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵分子，調(diào)控其表達(dá)、活性可能是腫瘤治療的手段之一。本研究重點(diǎn)關(guān)注了Butein處理后AMPK的磷酸化水平。本研究給予EC109細(xì)胞梯度濃度的Butein處理后，發(fā)現(xiàn)AMPK的磷酸化水平劑量依賴地上調(diào)。FOXO3a是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，能介導(dǎo)多種促凋亡因子的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)FOXO3a又是AMPK的磷酸化底物，本研究檢測(cè)了FOXO3a的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)Butein激活A(yù)MPK的同時(shí)，上調(diào)了FOXO3a的磷酸化水平。為了進(jìn)一步明確AMPK在該過(guò)程中對(duì)FOXO3a的調(diào)控作用，本研究給予AMPK阻斷劑Compound C處理，發(fā)現(xiàn)抑制AMPK活性后，F(xiàn)OXO3a的磷酸化水平降低，Butein對(duì)細(xì)胞活性的抑制能力減弱。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Butein的抗食管癌作用及AMPK/FOXO3a在其中發(fā)揮的作用，本研究建立了裸鼠皮下腫瘤模型，給予Butein和Compound C處理，發(fā)現(xiàn)Butein處理顯著降低了皮下腫瘤體積，而B(niǎo)utein聯(lián)合Compound C處理后腫瘤體積增大，提示抑制AMPK拮抗了Butein的抗腫瘤作用。

以上證據(jù)從離體、在體水平，以及正反兩個(gè)角度證實(shí)，Butein能顯著抑制食管癌EC109細(xì)胞的增殖、遷移能力，激活氧化應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。該作用可能是通過(guò)激活A(yù)MPK/FOXO3a信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究進(jìn)一步明確了Butein的抗食管癌作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基于Butein的抗食管癌藥物及治療策略提供了理論參考。

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