柑橘素預(yù)處理對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

孟利敏++++++吳紹華++++++席樹強(qiáng)++++++楊紅亮++++++張翼

[摘要] 目的 探討柑橘素預(yù)處理對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。 方法 56只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為正常對照組（CON）、柑橘素1、2.5、5、10、20、40 μmol/L組（NARI）。各組大鼠心臟平衡灌流30 min后，對照組給予30 min全心缺血和60 min再灌注處理（或120 min用于測定心肌梗死面積），NARI組大鼠缺血前分別給予1、2.5、5、10、20、40 μmol/L Nari灌流10 min預(yù)處理，再行30 min全心缺血和60 min再灌注處理（或120 min用于測定心肌梗死面積）。觀測各組大鼠左心室舒縮功能，測定心肌乳酸脫氫酶含量、心肌超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量，并計(jì)算心肌梗死面積百分比。 結(jié)果 與CON組相比，2.5 μmol/L及以上濃度NARI預(yù)處理組大鼠缺血/再灌注后心功能恢復(fù)提高、乳酸脫氫酶含量降低和心肌梗死面積減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。與對照組相比，2.5 μmol/L及以上濃度NARI組大鼠心肌SOD活力明顯增加，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 柑橘素對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)心肌對缺氧的適應(yīng)能力相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 柑橘素；心臟保護(hù)；缺血/再灌注；抗氧化

[中圖分類號] R541 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（c）-0020-05

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of naringenin on myocardial ischemia/reperfusion injury in isolated rat hearts. Methods 56 SD rats were randomly divided into： normal control （CON） group， naringenin （NARI） of 1， 2.5， 5， 10， 20， 40 μmol/L groups. After balance perfusion for 30 min in each group， CON group was treated with 30 min global ischemia followed by 60 min reperfusion （or 120 min for determination of the infarct size）. The NARI rats hearts were pretreated with 1， 2.5， 5， 10， 20， 40 μmol/L Nari perfusion for 10 min before ischemia， and then 30 min global ischemia and 60 min reperfusion （or 120 min for determine the infarct size）. The left ventricular function was obseved； levels of myocardial lactate dehydrogenase， myocardial superoxide dismutase （SOD） activity and malondialdehyde （MDA） were measured； and the percentage of myocardial infarct size was calculated in each group. Results Compared with the CON group， the recovery of heart function was increased， the content of lactate dehydrogenase and the area of myocardial infarction were decreased after ischemia/reperfusion in 2.5 μmol/L and above NARI pretreatment group （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with the control group， the SOD activity of myocardium significantly increased and the content of MDA significantly decreased in 2.5 μmol/L and above NARI pretreatment group（P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Naringenin has protective effect for isolated rats hearts with ischemia/reperfusion injury， its mechanism may be associated with enhanced myocardial antioxidant capacity.

[Key words] Naringenin； Cardiac protection； Ischemia/reperfusion； Antioxidation

缺血性心臟病是臨床常見的心血管疾病，其中最嚴(yán)重的是急性心肌梗死，其發(fā)病率和病死率逐年上升。臨床上常用的治療方法是血運(yùn)重建術(shù)，可以迅速恢復(fù)缺血區(qū)心肌供血，挽救瀕死心肌[1]。再灌注治療是一把“雙刃劍”，在恢復(fù)心肌供血帶來有益效果的同時(shí)，會加重心肌缺血所造成的損傷，并且為不可逆性，稱之為缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion），表現(xiàn)為心臟血流動力學(xué)改變、心肌酶釋放、心肌組織結(jié)構(gòu)改變等[2]。

柑橘素（Naringenin，Nari），又稱柚皮素，是一種天然存在的黃酮類物質(zhì)，廣泛分布于葡萄柚、檸檬、番茄等植物中。研究發(fā)現(xiàn)，柑橘素具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)特性，比如抗氧化、抗炎、抗血栓形成、抗癌、止血、抗?jié)冃纬傻萚3-9]。有報(bào)道，柑橘素對糖尿病、大鼠腦神經(jīng)缺血損傷具有保護(hù)作用[9]。Subburaman等[10]研究發(fā)現(xiàn)，利用阿霉素的毒性所致的心肌損傷大鼠模型中，柑橘素有心臟保護(hù)作用。但是，柑橘素對心肌缺血/再灌注損傷是否具有保護(hù)作用尚不清除。本研究應(yīng)用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，建立大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型，通過柑橘素預(yù)處理，探討柑橘素對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷是否具有保護(hù)作用以及可能的機(jī)制，為研究新的缺血/再灌注損傷藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

成年雄性Sprague–Dawley大鼠56只，體重260～310 g[河北醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，合格證號SCXK（冀）2013-1-003]。按照隨機(jī)數(shù)字表法分成7組：對照組（CON）、柑橘素組（NARI）1、2.5、5、10、20、40 μmol/L，每組各8只。

1.2 藥物與試劑

柑橘素購自美國Sigma公司。柑橘素溶液：柑橘素溶于二甲基亞砜（DMSO）中，配成母液，4℃保存，實(shí)驗(yàn)前用灌流液稀釋至所需濃度。

乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、TTC試劑、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒購于自南京建成生物工程研究所。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

K-H灌流液：NaCl 118.3 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，NaHCO3 25 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L。

1.3 離體心臟灌流技術(shù)和心臟血流動力學(xué)檢測

依據(jù)傳統(tǒng)大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型的實(shí)驗(yàn)方法[11]，大鼠行腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，背位固定，開胸，迅速取出心臟，分離主動脈，將充滿K-H液的主動脈套管插入主動脈，結(jié)扎固定，連接于Langendorff灌流裝置，以氧飽和的K-H液恒壓恒溫逆向灌流。灌流壓力90 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。離體心臟經(jīng)過30 min平衡灌流后給予30 min停灌即全心缺血，缺血期離體心臟浸泡在37℃恒溫灌流液中，之后恢復(fù)60 min或120 min再灌注（用于測定心肌梗死面積）。

左心室內(nèi)壓力通過壓力換能器輸入記錄系統(tǒng)，通過運(yùn)行Chart程序完成信號自動采集。通過計(jì)算機(jī)測定的心臟血流動力學(xué)指標(biāo)，包括：左室發(fā)展壓（LVDP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室壓力最大上升和下降速率（±LVdp/dtmax）和冠脈流量（CF）。

NARI組大鼠心臟在平衡灌流30 min后分別給予1、2.5、5、10、20、40 μmol/L的Nari灌流10 min預(yù)處理；后再行停灌30 min，復(fù)灌60 min或120 min。

1.4 冠脈流出液中乳酸脫氫酶（LDH）含量測定

收集心臟再灌注后10、20、30、60 min的冠脈流出液，凍存于-80℃待測，采用比色法利用分光光度計(jì)按照乳酸脫氫酶試劑盒說明書方法測定LDH含量。

1.5 測定心肌組織勻漿中的超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量

灌流結(jié)束后，取出心臟，剪下約0.1 g心肌組織，速凍后置-80℃冰箱中保存。測定前取出心肌標(biāo)本，制成10%勻漿，勻漿低溫離心后取上清液行生化檢測，按照試劑盒說明書操作，采用酶標(biāo)儀測定。

1.6 心肌梗死面積測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取心臟，將心室切成厚薄均勻的5片。放入37℃ 10%TTC溶液中避光15 min，用蒸餾水中止反應(yīng)，甲醛固定2 h。未受損心肌組織染色為紅色，梗死區(qū)域呈蒼白色。相機(jī)拍照，采用圖像分析軟件分析。心肌梗死面積用梗死區(qū)面積占心室面積百分比表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柑橘素對大鼠離體心臟血流動力學(xué)指標(biāo)的影響

平衡灌流條件下，各組大鼠心臟的血流動力學(xué)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。缺血/再灌注處理后，LVDP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax、CF均明顯下降，LVEDP升高。相比CON組，Nari組（10 μmol/L）大鼠心臟血流動力學(xué)參數(shù)變化較小，缺血再灌注時(shí)Nari組大鼠心功能恢復(fù)增加（P < 0.05或P < 0.01）。見圖1。

心臟缺血再灌注后，2.5、5、10、20、40 μmol/L Nari預(yù)處理組大鼠心臟LVDP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax、CF恢復(fù)明顯高于CON大鼠，而LVEDP明顯低于CON大鼠心臟（P < 0.05或P < 0.01）。不同濃度Nari組對心功能影響呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，高濃度效果最好。說明Nari預(yù)處理對缺血再灌注后心功能損傷有保護(hù)作用。見圖2。

2.2 柑橘素對冠脈流出液中LDH的影響

再灌注60 min時(shí)，2.5、5、10、20、40 μmol/L Nari預(yù)處理組冠脈流出液中LDH含量均明顯低于CON組（P < 0.05或P < 0.01），并呈一定量效關(guān)系，說明柑橘素可能通過穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜，減少心肌酶釋放，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。見圖3。

2.3 柑橘素對心肌梗死面積的影響

心臟缺血/再灌注后120 min，2.5、5、10、20、40 μmol/L Nari預(yù)處理組心肌梗死面積均低于CON組（P < 0.05或P < 0.01），見圖4A（封三）。通過TTC染色，不同濃度Nari預(yù)處理組心肌梗死白色區(qū)域面積（灰白色）均有所減小，尤其以40 μmol/L Nari組梗死面積最小，與CON組間差異顯著，見圖4B（封三）。

2.4 柑橘素對心肌SOD活性和MDA含量的影響

心臟缺血/再灌注后，與CON組比較，2.5 μmol/L及以上Nari預(yù)處理組大鼠心肌SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，并呈一定量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），見圖5。表明Nari可以提高心肌對缺氧的適應(yīng)能力。

3 討論

缺血心肌恢復(fù)血液灌流后常導(dǎo)致心肌缺血加重，出現(xiàn)再灌注損傷。由于缺血缺氧，部分心肌出現(xiàn)壞死，缺血區(qū)心肌能量代謝紊亂，心肌收縮不協(xié)調(diào)，順應(yīng)性下降，造成心肌收縮和舒張功能下降，代表左室收縮和舒張功能的血流動力學(xué)指標(biāo)：LVDP和±dp/dtmax降低，心率下降，而LVEDP升高。本研究發(fā)現(xiàn)，NARI組大鼠缺血/再灌注后較CON組相比，LVDP、±LVdp/dtmax降低，LVEDP升高（P < 0.05或P < 0.01）。說明柑橘素可以改善缺血/再灌注心臟收縮及舒張功能。冠脈循環(huán)血流量代表心臟本身血液供應(yīng)，與血管本身阻力及心肌舒縮有關(guān)，是心功能的另一種體現(xiàn)[12]。本研究顯示再灌注后，Nari預(yù)處理組較CON組冠脈流量升高，也說明柑橘素可以改善心臟缺血/再灌注后心肌損傷。研究結(jié)果同時(shí)提示高劑量組柑橘素的心臟保護(hù)作用更明顯，說明此保護(hù)作用具有濃度依賴性。

心肌缺血/再灌注損傷發(fā)生時(shí)，氧自由基聚集、Ca2+超載、線粒體損傷可通過不同途徑導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死和凋亡，壞死心肌細(xì)胞釋放胞內(nèi)酶入血，使血清內(nèi)心肌標(biāo)志物CK-MB、AST、LDH等升高，導(dǎo)致心肌梗死發(fā)生[13]。通常認(rèn)為心肌梗死面積是影響和決定心功能的關(guān)鍵因素，影響預(yù)后[14]。本研究顯示，與對照組相比，Nari預(yù)處理組缺血/再灌注后心肌中LDH含量降低，心肌梗死面積明顯降低，尤其以高劑量組明顯，表明Nari預(yù)處理可能通過改善微循環(huán)和交感神經(jīng)活性，抑制細(xì)胞凋亡等途徑，對抗缺血/再灌注損傷，減少心梗死面積，具有保護(hù)心肌作用。

氧自由基是造成心肌細(xì)胞損傷的主要機(jī)制之一。SOD是生物體內(nèi)清除氧自由基的抗氧化酶，其活性反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，具有生物毒性，其含量可以間接反映自由基損傷程度[15]。當(dāng)心肌缺血發(fā)生時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)氧化呼吸鏈?zhǔn)艿狡茐模杂苫宄到y(tǒng)被破壞，導(dǎo)致SOD、GSH-Px等自由基的活性降低，大量自由基的堆積使心肌細(xì)胞膜的流動性及通透性改變，影響細(xì)胞的完整性和功能[16]，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，最終分解生成MDA，進(jìn)一步損害細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起DNA斷裂，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死[17-18]。一般通過測定SOD活力和MDA含量的變化以了解心肌的抗氧化能力[19]。因此，測定心肌組織中的MDA、SOD水平反映了心肌對缺氧的適應(yīng)能力[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比CON組，缺血再灌注后NARI組大鼠心肌SOD活力提高，MDA含量降低（P < 0.05或P < 0.01）。表明柑橘素可以通過增加抗氧化酶活性，減少自由基損傷來增強(qiáng)心肌的抗氧化能力以及對缺血/再灌注損傷的耐受程度。有報(bào)道，柑橘素通過上調(diào)SOD基因表達(dá)，增加SOD活性來調(diào)節(jié)抗氧化能力，發(fā)揮保護(hù)作用[21]。心肌抗氧化能力的增強(qiáng)可能為Nari抗心肌缺血/再灌注損傷的重要機(jī)制之一。

綜上所述，柑橘素對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用，可以濃度依賴性改善心臟缺血再灌注損傷，其保護(hù)作用可能與清除氧自由基、增強(qiáng)抗氧化酶活性、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。研究提出了柑橘素可以作為抗心臟缺血/再灌注損傷的預(yù)防用藥，為柑橘素的臨床研究提供理論支持，今后應(yīng)從分子、細(xì)胞及整體層面進(jìn)一步探討其作用及機(jī)制。

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