三七皂苷在JNK介導(dǎo)的低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓模型中的機(jī)制探討

周小雄++++++葉桃春++++++羅川晉++++++吳輝++++++褚慶民++++++趙新軍

[摘要] 目的 研究JNK信號(hào)通路在大鼠低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓（HHPH）發(fā)生發(fā)展中的動(dòng)態(tài)變化，探討三七皂苷（PNS）防治HHPH的機(jī)制。 方法 復(fù)制慢性HHPH的SD大鼠模型，分為正常組（N，n=10），低O2高CO2組（H4w，n=10）及PNS治療組（Hp4w，n=10）。RT-qPCR及Western blot檢測(cè)JNK mRNA及蛋白表達(dá)情況。原代培養(yǎng)SD大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs），取2～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為正常組（N）、低O2高CO2組（H）及PNS治療組（R10、R50、R100），PNS治療組分別用不同濃度（10、50、100 mg/L）的三七皂苷單體R1進(jìn)行處理，24 h后收集細(xì)胞，RT-qPCR及WesternBlot檢測(cè)JNK mRNA及蛋白表達(dá)情況。然后用R1及JNK抑制劑SP600125分別及聯(lián)合處理PASMCs 5 d，CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。 結(jié)果 ①與N組相比，H4w組和Hp4w組mPAP均明顯增高（P < 0.05），同時(shí)Hp4w組mPAP明顯低于H4w組（P < 0.05）。②肺組織JNK mRNA在H4w組中表達(dá)最高，N組最低，Hp4w組介于兩組之間（均P < 0.05）；p-JNK蛋白在H4w組較N組高表達(dá)（P < 0.05），Hp4w組較H4w組下降（P < 0.05）。③PASMCs H組JNK mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于N組（P < 0.05），與H組相比，R1（10、50、100 mg/L）不同程度抑制了JNK mRNA及蛋白表達(dá)（P < 0.05）。④PNS及SP600125處理組PASMCs均出現(xiàn)了明顯的增殖受抑（P < 0.05）。 結(jié)論 JNK信號(hào)通路參與了大鼠HHPH的形成。PNS可減輕這一過(guò)程，其機(jī)制可能與PNS抑制JNK的表達(dá)與激活有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 三七皂苷；低氧高二氧化碳；肺動(dòng)脈高壓

[中圖分類(lèi)號(hào)] R543.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（c）-0007-05

[Abstract] Objective To investigate the dynamic change of JNK signaling pathway in the occurrence and development of hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension in rats， discuss the mechanism of panax notoginoside （PNS） in the protection of hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension. Methods Rats pathological models of hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension were established： SD rats were randomly divided into three groups （n=10）： normal group （N group）， hypoxic hypercapnia for 4 week group （H4w group）， and PNS-injected group （Hp4w group）. RT-qPCR and Western blot were used to detect the expression of JNK. Primary cultured PASMCs， isolated from SD rats， were incubated in logarithmic growth phase from the 2nd to 5th generation. PASMCs were divided into five groups： normal group （N group）， hypoxic hypercapnia group （H group）， and R1 treated group with different concentrations （10， 50 and 100 mg/L） of notoginsenoside monomer R1 under the condition of 6% CO2 plus 1% O2 for 24 h （R10， R50 and R100 groups）. The expressions of JNK mRNA and protein levels were detected by RT-qPCR and Western blot. PASMCs were treated with R1 and JNK inhibitor SP600125 for 5 days， CCK8 was used to detect the proliferation of PASMCs. Results ①The mPAP in H4w and Hp4w group was higher than that of N group （P < 0.05）， but mPAP in Hp4w group was obviously lower than that of H4w group （P < 0.05）. ②The mRNA and protein levels of JNK were significantly increased in H4w and Hp4w groups， compared with N group （P < 0.05）， and Hp4w group was lower than H4w group （P < 0.05）. ③The protein and mRNA expression levels of JNK in PASMCs were significantly higher in H group than those in N group （P < 0.05）； compared with H group， in R1 treatment （10， 50 and 100 mg/L） groups， the expression levels of JNK were markedly decreased （P < 0.05）. ④The proliferation of PASMCs were significantly inhibited in groups treated with R1 and JNK inhibitor SP600125 （P < 0.05）. Conclusion JNK may play an important role in the development of hypoxia induced pulmonary hypertension. The effect of PNS on reducing pulmonary hypertension and improving pulmonary vascular wall remodeling may be partly related to its inhibition of JNK pathway.

[Key words] Panax notoginoside； Hypoxic hypercapnia； Pulmonary arterial hypertension

低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH）以肺血管阻力增加為主要表現(xiàn)[1-2]。目前研究顯示，HHPH是由于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增殖異常，導(dǎo)致遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈腔狹窄阻塞，引起肺血管的阻力增加[3-4]。因此，對(duì)于平滑肌細(xì)胞增殖的抑制或能逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈，改善遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈重構(gòu)，是預(yù)防和治療肺動(dòng)脈高壓的關(guān)鍵措施之一。三七的主要成分三七皂苷（panax notogino side，PNS）具有調(diào)節(jié)血液循環(huán)、改善血流動(dòng)力學(xué)等多種生理功能。之前研究發(fā)現(xiàn)，PNS的主要成分三七皂苷單體R1（notoginsenoside monomer R1，R1）能通過(guò)抑制MAPK通路延緩大鼠HHPH的形成[5]。

MAPK是一組保守的絲/蘇氨酸激酶，其家族成員包括ERK1/2、p38激酶、JNK/SAPK等，廣泛參與炎癥、癌變等生理病理過(guò)程。研究報(bào)道，R1能夠顯著降低低氧高二氧化碳條件下PASMCs中p-ERK1/2[6]、p-p38[7]的水平，從而抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。而JNK在PASMCs中是否也起到了類(lèi)似作用，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型中JNK的活化水平，體外用PNS對(duì)PASMCs進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)JNK通路的變化，探討PNS治療HHPH的可能作用機(jī)制，為臨床治療肺動(dòng)脈高壓提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與藥品

SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體重250～300 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：No.44005800002610。血塞通注射液（有效成分為PNS，昆明興中制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：20100808）、5%水合氯醛、Olympus顯微照像儀、Powerlab四道記錄儀、呼吸機(jī)、Bio-Rad化學(xué)顯像儀、Thermo Fisher Scientific ViiA7 Real-Time PCR System。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），三七皂苷單體R1（廣州中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室提供），RT-qPCR試劑盒（日本TaKaRa公司），化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物公司），小鼠抗大鼠磷酸化JNK抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（美國(guó)Cell Signal Technology公司），JNK抑制劑SP600125（Selleck，S1460），CCK8（Selleck）。研究符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理準(zhǔn)則。

1.2 慢性HHPH大鼠模型的復(fù)制

隨機(jī)將SD大鼠分成N、H4w和Hp4w共3組，每組10只。將H4w和Hp4w組置于低氧高二氧化碳艙內(nèi)，保持O2濃度為9%～11%，CO2濃度為5%～6%，每天8 h，每周6 d。Hp4w組每日于腹腔注射血塞通注射液[50 mg/（kg·d）]，H4w組大鼠同時(shí)注射等量的生理鹽水，注射半小時(shí)后入艙。N組置于艙外，呼吸正?？諝?。三組均飼養(yǎng)4周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 大鼠血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定

經(jīng)處理4周后，對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉（腹腔注射5%水合氯醛），固定于手術(shù)臺(tái)上，行頸正中切口，于左側(cè)分離出左頸外靜脈，自左頸外靜脈插管至肺動(dòng)脈，Powerlab生理記錄儀測(cè)定其平均肺動(dòng)脈壓（mPAP）；右側(cè)分離出右頸總動(dòng)脈，插管測(cè)量其平均頸動(dòng)脈壓（mCAP）。以mPAP>15 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）作為模型建立成功的指標(biāo)。

1.4 PASMCs的分離和培養(yǎng)

處死大鼠，在75%酒精中浸泡后取出肺葉，在超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖顯微鏡直視下取出2～4級(jí)肺動(dòng)脈，剝離外膜，去除內(nèi)皮細(xì)胞，將其剪碎，0.2%膠原酶Ⅰ于37℃消化30 min，后終止消化，轉(zhuǎn)入離心管中1000 r/min離心5 min，棄上清，加DMEM（20%FBS）接種至100 mm培養(yǎng)皿中，常規(guī)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞貼壁情況及細(xì)胞形態(tài)，待血管平滑肌細(xì)胞達(dá)90%以上時(shí)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5 PASMCs藥物處理分組

將第3～5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PASMCs接種于6孔板中（5×105個(gè)/mL，2 mL/孔），采用高糖DMEM培養(yǎng)液+10%FBS培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合度時(shí)換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加藥物處理。實(shí)驗(yàn)分組分為：常氧組（N）：不給予任何處理因素，氣體條件為5%CO2+21%O2，37℃孵育24 h；低氧高二氧化碳組（H）：加入PBS，氣體條件為6%CO2+1%O2，37℃孵育24 h；R1干預(yù)組（R10、R50、R100）：分別加入10、50、100 mg/mL R1，氣體條件為6%CO2+1%O2，37℃孵育24 h。

1.6 JNK mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

取組織或細(xì)胞，加1 mL Trizol，反復(fù)吹打后再加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s后靜置，4℃ 12 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，靜置5 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入1 mL 75%乙醇，4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，晾干后加入適量DEPC水溶解。逆轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA。qPCR檢測(cè)JNK mRNA表達(dá)豐度。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，60℃ 延伸60 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算ΔΔCT值，進(jìn)行分析。GAPDH（Rat）上游序列：5′-ACT？鄄CCCATTCTTCCACCTTTG-3′，下游序列：5′-CCCTGTT？鄄GCTGTAGCCATATT-3′；JNK（Rat）上游序列：5′-AAGATCCCTGACAAGCAGTTAG-3′，下游序列：5′-TCTTAGTTCGCTCCTCCAAATC-3′。

1.7 Western blot檢測(cè)磷酸化JNK 蛋白含量

各組取組織或細(xì)胞，加入適量裂解液，裂解30 min，超聲粉碎儀充分裂解細(xì)胞后，4℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清，于-80℃保存。BCA法測(cè)定蛋白濃度。電泳采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，恒壓80 V 30 min，改120 V至溴酚藍(lán)跑到凝膠底部。PVDF膜轉(zhuǎn)膜，100 V恒流電轉(zhuǎn)90 min，后3%BSA封閉1 h，洗膜后加p-JNK抗體（CST，1∶1000），4℃孵育過(guò)夜，次日加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（Santa Cruz，1∶5000），室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光底物ECL顯色，BioRad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。

1.8 PASMCs細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

將肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（1×103個(gè)/孔）接種于96孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞長(zhǎng)至60%的融合度，棄原細(xì)胞培養(yǎng)液，饑餓處理24 h。分別及聯(lián)合加入R1（50 mg/ml）和JNK抑制劑SP600125（40 nmol/L），藥物處理5 d后，每孔加入10 μL CCK8，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖情況。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠平均頸動(dòng)脈壓及平均肺動(dòng)脈壓比較

2.1.1 各組大鼠平均頸動(dòng)脈壓比較 N組、H4w組和Hp4w組大鼠組間mCAP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），見(jiàn)表1。提示低氧高二氧化碳對(duì)大鼠的體循環(huán)壓沒(méi)有影響。

2.1.2 各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓比較 H4w組和Hp4w組mPAP均高于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），說(shuō)明低氧高二氧化碳處理4周后大鼠會(huì)出現(xiàn)明顯的肺動(dòng)脈高壓。同時(shí)，H4w組mPAP明顯高于Hp4w組（P < 0.05），提示PNS可能有利于減緩低氧高二氧化碳引起的肺動(dòng)脈高壓。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠肺組織中JNK mRNA及蛋白水平比較

2.2.1 各組大鼠肺組織中JNK mRNA水平比較 qPCR結(jié)果顯示，各組大鼠肺組織中JNK mRNA出現(xiàn)明顯變化，在N組中JNK mRNA水平不高，給予低氧高二氧化碳處理4周后，JNK mRNA表達(dá)顯著增加（P < 0.05），而加入PNS處理后的Hp4w組JNK mRNA明顯低于H4w組，但仍高于N組水平（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2.2 各組大鼠肺組織勻漿JNK蛋白水平比較 各組肺組織勻漿p-JNK出現(xiàn)明顯變化，在N組中p-JNK蛋白未見(jiàn)表達(dá)，給予低氧高二氧化碳處理4周后，p-JNK蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)（P < 0.05），而加入PNS處理后的Hp4w組p-JNK蛋白明顯低于H4w組（P < 0.05），但仍高于N組水平。見(jiàn)圖2。

2.3 各組PASMCs中JNK mRNA及蛋白水平比較

2.3.1 各組PASMCs中JNK mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 H組和R1各濃度組JNK mRNA表達(dá)水平較N組均明顯增加（P < 0.05）；R1各濃度組間JNK mRNA表達(dá)呈劑量依賴(lài)性，隨R1濃度增高，JNK mRNA表達(dá)水平次第下降，且R100組和R10組之間的JNK mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖3。

2.3.2 各組PASMCs中JNK蛋白表達(dá)量比較 N組p-JNK蛋白表達(dá)較弱，H組和R1各濃度組JNK mRNA表達(dá)水平較N組均明顯增加（P < 0.05）；R1各濃度組與H組相比，p-JNK蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著下調(diào)（P < 0.05）。R1各濃度組之間p-JNK表達(dá)呈劑量依賴(lài)性，隨R1濃度增高，p-JNK表達(dá)水平次第下降，R100組和R10組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），二者與R50組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖4。

2.4 JNK對(duì)PASMCs增殖的影響

利用CCK8測(cè)定PNS及JNK抑制劑SP600125對(duì)PASMCs增殖的影響，結(jié)果顯示，與未處理組相比，處理組均出現(xiàn)了明顯的增殖受抑（P < 0.05），而相比單藥處理組，PNS及SP600125聯(lián)合處理組出現(xiàn)了一個(gè)輕微的累加效應(yīng)（P < 0.05）。見(jiàn)圖5。

3 討論

肺動(dòng)脈高壓是慢性、嚴(yán)重的致命性疾病，可繼發(fā)于心、肺、全身性疾患或原因不明，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難，最終導(dǎo)致右心衰竭而死。肺動(dòng)脈高壓與肺動(dòng)脈內(nèi)細(xì)胞的活化增殖相關(guān)。平滑肌細(xì)胞增殖和伴隨的遷移使血管介質(zhì)變厚，侵入內(nèi)膜并參與叢狀體的形成[8]。目前認(rèn)為，低氧高二氧化碳引起HHPH主要有兩大機(jī)制[9]：①介質(zhì)學(xué)說(shuō)認(rèn)為，低氧可以激活NO、ET等因子引起血管的收縮與舒張；②直接學(xué)說(shuō)認(rèn)為，低氧可直接刺激PASMCs，引起PASMCs的收縮、增殖、遷移等改變，導(dǎo)致肺血管阻力增加。低氧是引起PASMCs增殖的重要因素，此外，鈣內(nèi)流引起的細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂也是其中原因之一[10-11]。

三七總皂苷是五加科人參屬植物三七的主要成分，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、擴(kuò)張血管、抗血小板凝集等生物學(xué)功能。有文獻(xiàn)報(bào)道，PNS能抑制慢性缺氧大鼠內(nèi)皮細(xì)胞NO的合成與釋放，進(jìn)而延緩慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)程[12]。目前認(rèn)為，三七皂苷是一種鈣拮抗劑，能夠通過(guò)抑制MAPK 通路來(lái)減輕肺動(dòng)脈高壓的程度，而其主要成分單體R1具有相似的作用[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HHPH模型鼠加用PNS藥物治療后，其mPAP出現(xiàn)顯著降低，而mCAP未發(fā)生明顯改變，提示PNS可能延緩HHPH的進(jìn)程，而不造成體循環(huán)的改變，即PNS對(duì)HHPH具有選擇性抑制作用。同時(shí)，H4w組大鼠肺組織中JNK mRNA水平出現(xiàn)明顯改變，JNK表達(dá)顯著增加；而加入PNS后的Hp4w組相較于H4w組，JNK mRNA表達(dá)水平顯著下降，其磷酸化活性也出現(xiàn)明顯降低，提示JNK可能參與了肺動(dòng)脈高壓的形成，而PNS則通過(guò)部分阻斷JNK通路的活化，而達(dá)到降低肺動(dòng)脈高壓的目的。體外研究表明，在低氧高二氧化碳條件下，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在加用低、中、高劑量R1處理后，其p-JNK蛋白表達(dá)均明顯低于未加藥組。PNS處理組PASMCs增殖速率明顯下降，而PNS與JNK抑制劑聯(lián)合處理組出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，提示除JNK通路外，PNS可能還參與了其他信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

目前研究顯示，在HHPH大鼠模型中肺小血管的重塑與JNK/MAPK通路的激活密切相關(guān)[13-15]。MAPK通路的激活介導(dǎo)了肺動(dòng)脈高壓過(guò)程中PASMCs的增殖[16-18]，然而究竟是什么引起了MAPK通路的激活、p38及JNK的磷酸化，繼而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖失控，尚不清楚。有研究推測(cè)，缺氧內(nèi)環(huán)境及持續(xù)的鈣內(nèi)流鈣超載可能是引起MAPK通路激活的原因[19-20]。PNS作為一種鈣拮抗劑，可能由此參與了MAPK通路的調(diào)節(jié)，而PNS在MAPK激活過(guò)程中是怎樣參與其中，JNK、p38等分子又是怎樣調(diào)節(jié)PASMCs增殖的，目前尚不明確。此外，PNS是否還有其他的作用機(jī)制，能否通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路來(lái)達(dá)到延緩肺動(dòng)脈高壓的目的，尚需進(jìn)一步研究。

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