Autotaxin蛋白修飾性位點的生物信息學(xué)預(yù)測*

曹 睿 趙 邑 潘薇薇 曹鵬程 梁雅麗 謝海軍

（山西省生物研究所 山西太原 030000）

0 引言

Autotaxin（ATX）蛋白1992年首次在人的黑色素瘤細胞系A(chǔ)2058中發(fā)現(xiàn)［1］，是一種自分泌活性因子，是分子量為126-kDa的糖蛋白。能夠以溶血磷脂酰膽堿（1ysophosphatidyIcholine，LPC）為底物催化生成溶血磷脂酸（1ysophosphatidic acid，LPA），表現(xiàn)出磷酸二酯酶活性，被歸為磷酸二酯酶家族（ENPP2 家族）［2］。除了磷酸二酯酶活性外，Autotaxin蛋白還同時具有焦磷酸酶和 ATP酶活性［3］。Autotaxin在腫瘤細胞中對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，特別是腫瘤的遷移起著重要作用，其抑制劑的開發(fā)并被認為可能為治療腫瘤提供方法［4］。在Autotaxin蛋白的催化結(jié)構(gòu)域中一些氨基酸的糖基化至關(guān)重要，已有研究表明Asn524的糖基化對于Autotaxin蛋白發(fā)揮活性是必需的。例如：在脂肪細胞中，Asn53和Asn410的N端糖基化對于Autotaxin的分泌和活性很重要［4-5］。因此研究Autotaxin蛋白的磷酸化、糖基化等催化位點非常重要，可以采取生物信息學(xué)手段完成預(yù)測工作，為進一步挖掘其生物學(xué)意義提供理論基礎(chǔ)和研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人Autotaxin蛋白fasta格式數(shù)據(jù)來自NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫，全長 915 aa，GenBank號為：AAA64785.1。

1.2 方法 Autotaxin蛋白的磷酸化位點分析分別利用軟件 DISPHOS 1.3［6］、PhosphoSitePlus［7］、KinasePhos［8］、Scansite［9］、NetPhosk［10］、Musite［11］進 行預(yù)測，這些軟件是現(xiàn)今比較常用的磷酸化位點預(yù)測軟件。

Autotaxin（ATX）蛋白的糖基化位點（N-型、O-型）分別用 NetNGlyc1.0［12］、Uniprot數(shù)據(jù)庫、NetOGlyc4.0［13］、YinOYang［14］1.2 軟件進行預(yù)測。 各數(shù)據(jù)庫軟件參數(shù)如無特別說明均取默認值（表1）。

表1 預(yù)測工具軟件簡介

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸化位點分析結(jié)果 6款軟件預(yù)測的所有磷酸化位點中，有4款軟件同時預(yù)測到的位點有 2個，分別是：S-330，T-328；有 3款軟件同時預(yù)測到的位點有3個，分別是：S-860，S-861，T-333；有2款軟件同時預(yù)測到的位點有12個，分別是：S-58，S-302，S-308，S-326，S-327，S-729，S-741，S-865，T-210，T-288，T-83，T-368（表 2）。

6款預(yù)測軟件中，DISPHOS 1.3預(yù)測的全部結(jié)果均與其他軟件預(yù)測結(jié)果重合，其次，預(yù)測重復(fù)率較 高 的 軟 件 有 ：Scansite、Musite、PhosphoSitePlus。預(yù)測結(jié)果最多的為NetPhosk，KinasePhos預(yù)測結(jié)果中重復(fù)預(yù)測率較低。NetPhosk是這6款軟件中預(yù)測位點最多的，共有Ser修飾位點26個，Thr修飾位點13個，Tyr修飾位點10個。Musite軟件預(yù)測的位點最少，Ser修飾位點 3個，Thr修飾位點 1個，Tyr修飾位點1個。

表2 Autotaxin蛋白磷酸化位點預(yù)測

通過對預(yù)測結(jié)果分析可知，絲氨酸（Ser）修飾位點較多，被重復(fù)預(yù)測到的有11個位點；其次是蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr），被重復(fù)預(yù)測到的位點均為3個。此外，Scansite還預(yù)測到脯氨酸（Pro354、Pro735）及亮氨酸（Leu498）修飾位點。

2.2 糖基化位點分析結(jié)果 N型糖基化位點的預(yù)測通過Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢及NetNGlyc1.0軟件預(yù)測，重復(fù)被預(yù)測到的位點為N-54。

O型糖基化位點的預(yù)測通過NetOGlyc4.0、YinOYang1.2軟件進行，重復(fù)被預(yù)測到的位點為O-695、O-696、O-712。

3 討論

蛋白質(zhì)翻譯后修飾對細胞的調(diào)控機制起重要作用，它能影響蛋白的多種屬性，包括蛋白質(zhì)折疊、活性及最終功能［15］。蛋白質(zhì)的磷酸化和糖基化的過程為：蛋白質(zhì)在蛋白激酶催化下將磷酸集團由ATP轉(zhuǎn)移到目標蛋白質(zhì)上，將低聚糖轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)骨架上，主要的生物學(xué)功能有：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性調(diào)節(jié)、新陳代謝、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與溶解度，抗原性、蛋白質(zhì)靶標、細胞-細胞相互作用等［16］。真核生物磷酸化位點一般有絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。其中，絲氨酸和蘇氨酸是最常見的磷酸化位點［17］，因為其結(jié)構(gòu)末端含有羥基，羥基很活潑，可以與磷酸基團結(jié)合。所以說，蛋白質(zhì)中如果某個絲氨酸很保守的話，很大程度上就是磷酸化位點。

本研究利用生物信息學(xué)軟件對Autotaxin蛋白進行磷酸化和糖基化位點預(yù)測。大部分生物信息學(xué)軟件的設(shè)計思路是基于已有數(shù)據(jù)的匯集，結(jié)合數(shù)學(xué)模型的設(shè)計和計算機技術(shù)的集成開發(fā)而成。已有實驗或文獻數(shù)據(jù)的提供可使預(yù)測結(jié)果具有可靠性高、可重復(fù)性強、可驗證性高的優(yōu)勢，缺點是較少提供新的數(shù)據(jù)集，科學(xué)合理的數(shù)學(xué)模型和訓(xùn)練集可彌補此缺陷。

本研究磷酸化位點預(yù)測中使用到的軟件，大部分利用的是隱馬爾科夫模型（DISPHOS 1.3、KinasePhos）［18-19］，NetPhosk 則采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法［20］，Musite采用機器學(xué)習(xí)方法。從軟件本身預(yù)測結(jié)果及被其他軟件重復(fù)預(yù)測到的比例看，預(yù)測準確 率 排 序 為 ：DISPHOS 1.3、Scansite、Musite、Net-Phosk、PhosphoSitePlus、KinasePhos。 從重復(fù)被預(yù)測到的結(jié)果看，12個位點中有 5個位點（Y-83、T-210、T-288、S-302、S-308）是文獻中有明確報道為磷酸化位點的。不同的數(shù)學(xué)模型、算法對于預(yù)測結(jié)果的影響是較為顯著的。因此，在初步篩選數(shù)據(jù)集階段，應(yīng)該嘗試多軟件、換參數(shù)等方式，達到數(shù)據(jù)集盡可能精確、可驗證的目的。為實驗驗證提供重要的依據(jù)和基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

識別蛋白質(zhì)修飾的傳統(tǒng)方法中質(zhì)譜、磷酸鹽標記等實驗手段能檢測的修飾活性位點十分有限，費時費財，產(chǎn)出較慢。本項目采用高效、可靠的生物信息學(xué)手段，對Autotaxin蛋白質(zhì)修飾活性位點預(yù)測，為其抑制劑的開發(fā)提供潛在靶點。