地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶嗜堿突變體的特征分析

黃磊，董自星，金鵬，王正祥，路福平*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，生物化工系，天津，300457)

地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶嗜堿突變體的特征分析

黃磊1，董自星2*，金鵬2，王正祥2，路福平1*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，生物化工系，天津，300457)

地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶是工業(yè)上重要的蛋白酶類，進(jìn)一步提高其在堿性條件下的活力可改善其在洗滌劑工業(yè)方面的應(yīng)用價(jià)值。該研究通過(guò)篩選獲得一種在堿性條件下酶活水平顯著提高的地衣芽胞桿菌B186來(lái)源的蛋白酶，并在枯草芽胞桿菌WB600中對(duì)其編碼基因進(jìn)行了成功克隆與表達(dá)，獲得了重組菌WB600 (pHY-E209)。然后通過(guò)離子交換色譜和凝膠層析法，從重組菌的發(fā)酵液中純化獲得了重組堿性蛋白酶AprE209。對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，重組酶AprE209的最適作用pH為11.0，最適作用溫度為50 ℃，在30～37 ℃下和pH 12.0時(shí)仍具有很高的活力。進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)的手段對(duì)其耐堿機(jī)制進(jìn)行了初步解析。該嗜堿突變體具有進(jìn)一步用于洗滌劑的潛在研究?jī)r(jià)值。

蛋白酶；嗜堿性突變體；洗滌劑行業(yè)；酶學(xué)特征

堿性蛋白酶是指在pH偏堿性范圍內(nèi)水解蛋白質(zhì)肽鍵的一大酶類，是工業(yè)酶制劑中使用量最大的酶制劑之一，它在皮革、造紙、洗滌、化妝品、動(dòng)物飼料等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用[1]。地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶是工業(yè)上重要的蛋白酶，其中最具代表性的是地衣芽胞桿菌2709生產(chǎn)菌株生產(chǎn)的堿性蛋白酶(2709堿性蛋白酶)，它是我國(guó)最重要的堿性蛋白酶來(lái)源[2]。2709堿性蛋白酶的全部編碼序列長(zhǎng)度為1140 bp，其中，信號(hào)肽、前導(dǎo)肽以及成熟肽的序列長(zhǎng)度分別為87、228和825 bp，它是典型的Subtilisin Carlsberg類蛋白酶[3]。

地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶曾經(jīng)被成功應(yīng)用于我國(guó)洗滌劑工業(yè)[2]。但其最適作用pH在9.5～10.0左右[4]，而國(guó)際上現(xiàn)階段則采用最適作用pH可以達(dá)到10.5～12.0或以上、其他細(xì)菌來(lái)源的堿性蛋白酶應(yīng)用于洗滌劑工業(yè)[5]。與此同時(shí)，在相對(duì)較低溫度保持較高的酶活力，也是洗滌劑工業(yè)應(yīng)用中需要考慮的因素[6]。TINDBAEK等[7]和SIDDIQUI等[8]通過(guò)對(duì)枯草桿菌蛋白酶(subtilisins)進(jìn)行分子改造，成功獲得了適冷的堿性蛋白酶。除了對(duì)現(xiàn)有的蛋白酶進(jìn)行分子改造，從嗜堿和適冷微生物中篩選新的蛋白酶也是目前研究的熱點(diǎn)之一[5]。

本研究通過(guò)對(duì)地衣芽胞桿菌分離菌株保藏物所產(chǎn)堿性蛋白酶的最適作用pH進(jìn)行初篩，獲得1株能夠在更高堿性條件下保持較高蛋白酶活性的菌株；并對(duì)其堿性蛋白酶進(jìn)行了分子克隆與表達(dá)、生化特征分析以及耐堿機(jī)制的初步解析。研究結(jié)果可為新型堿性蛋白酶的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基

大腸桿菌(EscherichiacoliJM109)、枯草芽胞桿菌(BacillussubtilisWB600)和表達(dá)載體pHY-WZX[9]由本實(shí)驗(yàn)室保藏。地衣芽胞桿菌分離菌株保藏物由中國(guó)高校工業(yè)微生物資源與信息中心(http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)提供?？寺≥d體T-Vector pMD19 (simple)購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。

微生物的常規(guī)培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，加入2%瓊脂為固體培養(yǎng)基。必要時(shí)，添加100 μg/mL的氨芐青霉素或20 μg/mL卡那霉素。篩選培養(yǎng)基：以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，使用前添加5%的無(wú)菌脫脂牛奶和終質(zhì)量濃度為20 μg/mL的卡那霉素。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：乳糖 40，玉米漿 30，豆餅粉 30，硫酸銨 5，pH 7.0。

1.2 主要試劑

LATaqDNA Polymerase和T4DNA ligase等為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒等購(gòu)于OMEGA Bio-Tek公司。蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、限制性內(nèi)切酶等由Thermo Fisher Scientific公司提供。2709堿性蛋白酶(20萬(wàn) U/g)購(gòu)于天津諾奧科技有限公司。牛血清白蛋白V部分、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素和引物等由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 嗜堿性蛋白酶的篩選

將工業(yè)微生物菌種資源庫(kù)中的地衣芽胞桿菌保藏物(共350株)在LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行三區(qū)劃線，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。第2天，從平板上挑取單菌落并接種至含有20 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、230 r/min培養(yǎng)12 h。然后按2%(v/v)的接種量接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于37 ℃和230 r/min下培養(yǎng)72 h。發(fā)酵結(jié)束后，離心(8 000 r/min，10 min)收集上清。按照1.4小節(jié)的酶活測(cè)定方法，在不同pH下進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.4 堿性蛋白酶酶活力的測(cè)定

蛋白酶酶活力測(cè)定使用福林法[10]。其基本步驟為：取1 mL酶液至1 mL 1%(w/v)酪蛋白溶液中，在40 ℃和pH 10.5條件下作用10 min后，加入等體積的0.4 mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)，在反應(yīng)溫度下顯色20 min，并于680 nm處測(cè)OD值。1個(gè)蛋白酶的酶活力單位定義為：在40 ℃和pH 10.5條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量，以U/mL表示。

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照Bradford法[11]，以牛血清白蛋白V部分為標(biāo)準(zhǔn)參照品。

1.5 嗜堿性蛋白酶的克隆與表達(dá)

1.5.1 嗜堿性蛋白酶基因的克隆

PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒的純化、酶切、連接、轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子的篩選等均按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[12]，使用試劑盒時(shí)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以篩選得到的地衣芽胞桿菌基因組DNA為模板，采用引物aprE-BL1(5’-AGCTCTAGAGCTCAGCCGGCGAAAAATG-3’)和aprE-BL2(5’-GGGTTATTGAGCGGCAGCTTCGACAT-3’)PCR擴(kuò)增(下劃線部分為人工設(shè)計(jì)XbaI位點(diǎn))。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 45 s，68 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物連接到載體T-Vector pMD19 (simple)上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中。通過(guò)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證后，采用雙脫氧核苷鏈終止法進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定[13]。

1.5.2 重組菌的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增獲得的堿性蛋白酶基因用XbaI進(jìn)行酶切，并與經(jīng)XbaI和SmaI酶切的載體pHY-WZX連接。然后采用更改的Spizizen方法[14]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到枯草桿菌WB600中，利用篩選培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性重組菌。進(jìn)一步通過(guò)限制性酶酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性。

1.5.3 嗜堿蛋白酶突變體的發(fā)酵制備

將重組菌接種于含20 μg/mL卡那霉素的50 mL LB液體培養(yǎng)基中。于37 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后，取10 OD600nm菌體接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 d，每隔24 h取樣進(jìn)行酶活測(cè)定。發(fā)酵結(jié)束后，離心(4 ℃，8 000 r/min)取上清，經(jīng)真空冷凍干燥后，于-20 ℃保藏備用。

1.6 重組堿性蛋白酶的分離純化與SDS-PAGE分析

將2709堿性蛋白酶(AprE2709)的分離純化方法[15]進(jìn)行適當(dāng)修飾后用于重組酶AprE209的純化，即采用鹽析(30%～60%硫酸銨)、透析、Mono Q 5/50 GL陰離子交換色譜和Sephadex G-75凝膠層析法對(duì)AprE209進(jìn)行純化。通過(guò)酶活測(cè)定和SDS-PAGE分析蛋白的純化情況。SDS-PAGE參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行，采用5%的濃縮膠，12%的分離膠。

1.7 酶學(xué)性質(zhì)的分析與比較

1.7.1 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定

最適反應(yīng)pH的測(cè)定：分別配制0.5 mol/L的乳酸-乳酸鈉緩沖液(pH 4.0、5.0和6.0)、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 7.0和8.0)和硼酸緩沖液(pH值分別為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5和12.0)。分別用不同pH的緩沖液將酶粉進(jìn)行適當(dāng)稀釋，并用該緩沖液配制1%(w/v)的酪蛋白溶液。在50 ℃條件下，測(cè)定酶樣在不同pH值下的酶活，酶活數(shù)值最大者計(jì)為100%。

pH穩(wěn)定性的確定：在上述不同pH值的緩沖液里和50 ℃恒溫水浴下保溫60 min，取出酶樣，調(diào)整pH至10.5，按照上述酶法測(cè)定方法在pH 10.5和50 ℃下進(jìn)行酶活測(cè)定，以未經(jīng)過(guò)上述不同pH下孵育的酶樣本酶活為100%進(jìn)行計(jì)算。

1.7.2 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定

最適反應(yīng)溫度的確定：在最適pH條件下，分別測(cè)定酶樣在30、35、37、40、45、50、55和60 ℃下的酶活力，以酶活最高者計(jì)為100%。

熱穩(wěn)定性的測(cè)定：首先將酶樣置于不同溫度下保溫不同時(shí)間，每隔30 min取樣，按照1.4的方法測(cè)定其酶活，以未經(jīng)水浴處理的酶活為100%。

1.7.3 金屬離子和螯合劑對(duì)酶活的影響

在酶活測(cè)定反應(yīng)體系中，分別加入終濃度為5 mmol/L或10 mmol/L的K+、Ca2+、Mg2+、Zn2 +、Mn2+、Co2+、Cu2 +、Fe3+和EDTA，然后按照1.4的方法進(jìn)行酶活測(cè)定。以不加金屬離子和螯合劑的反應(yīng)體系的酶活力為100%。

1.8 生物信息學(xué)分析

利用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行核苷酸序列相似性比對(duì)，并采用Clustal X2和BioEdit 7.0.9對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)與分析。然后通過(guò)在線軟件Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org/)對(duì)嗜堿性蛋白酶和2709蛋白酶的3-D結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，并利用軟件Discovery Studio 2.5對(duì)其進(jìn)行分析和比較。疏水相互作用、二硫鍵及離子鍵由PIC在線服務(wù)器(http://pic.mbu.iisc.ernet.in/index.html)進(jìn)行分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 嗜堿性蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選

對(duì)菌種庫(kù)中的350株地衣芽胞桿菌分離菌株的產(chǎn)蛋白酶的嗜堿性能進(jìn)行篩選，在pH 11.0和pH 9.0酶活的比值(pH 11.0/pH 9.0)最高的10株菌的酶活測(cè)定結(jié)果匯總于表1。其中菌株B0209所產(chǎn)蛋白酶在pH 11.0下顯示較明顯的蛋白酶酶活，而且它在pH 11.0時(shí)的酶活是pH 9.0時(shí)酶活的1.25倍，高于其它菌株所產(chǎn)的蛋白酶。為此，選擇此菌株所產(chǎn)蛋白酶進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步研究。

表1 產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的篩選

2.2 AprE209的分泌表達(dá)與分離純化

以上述篩選獲得的地衣芽胞桿菌B186的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得蛋白酶編碼基因aprE209。進(jìn)一步將aprE209克隆入表達(dá)質(zhì)粒pHY-WZX，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pHY-E209，將此重組表達(dá)質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化入蛋白酶基因缺失的枯草桿菌WB600中，獲得重組菌WB600 (pHY-E209)。然后將重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵上清液中重組酶AprE209的酶活達(dá)到400 U/mL。再將發(fā)酵液中的AprE209凍干后，再經(jīng)鹽析、透析、陰離子交換色譜和凝膠層析進(jìn)行純化，并用SDS-PAGE分析純化效果，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，AprE209的分子量大小約為30 kDa，在SDS-PAGE中呈現(xiàn)為單一條帶，達(dá)到了電泳純。

M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-純化獲得的AprE209圖1 SDS-PAGE分析重組酶AprE209的純化效果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant enzyme AprE209

2.3 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)比較分析

2.3.1 最適反應(yīng)pH

在不同pH反應(yīng)條件下分析AprE209的酶活并與2709堿性蛋白酶進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示。AprE209在pH 11.0時(shí)表現(xiàn)出最高酶活，而2709堿性蛋白酶則在pH 10時(shí)呈現(xiàn)最高酶活力，二者的最適作用pH呈現(xiàn)顯著差異。AprE209在偏堿性的條件下仍具有較高酶活。

圖2 堿性蛋白酶AprE209和AprE2709的最適反應(yīng)pHFig.2 pH optima of alkaline proteases AprE209 and AprE2709

2.3.2 pH穩(wěn)定性

在不同pH條件下處理酶液，取樣恢復(fù)pH后分析此過(guò)程對(duì)酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。在pH 5.0～11.0范圍內(nèi)，AprE209和2709堿性蛋白酶的穩(wěn)定性皆很好，酶活保持率>80%。另外，我們也觀察到，AprE209在pH 12.0的條件下仍然具有很好的pH穩(wěn)定性(殘留酶活>80%)，而2709堿性蛋白酶在此條件下的pH穩(wěn)定性顯著變差。

2.3.3 最適反應(yīng)溫度

分別在不同溫度下測(cè)定堿性蛋白酶AprE209的酶活并與2709堿性蛋白酶進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖4?？梢钥闯?，AprE209和2709堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度存在差異性，AprE209的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，而2709堿性蛋白酶為55 ℃；在溫度下降到37 ℃時(shí)，兩者仍維持60%左右的酶活；在30 ℃范圍內(nèi)仍保持有40 %左右的酶活。此外，在35～50 ℃范圍內(nèi)，AprE209的相對(duì)酶活高于AprE2709。

圖4 堿性蛋白酶AprE209和AprE2709的最適溫度Fig.4 Optimum temperatures of alkaline proteases AprE209 and AprE2709

2.3.4 熱穩(wěn)定性

將酶液在不同溫度下孵育90 min，定時(shí)取樣分析酶液的酶活，結(jié)果顯示， AprE209和2709堿性蛋白酶在耐熱性能上存在顯著差異(圖5)。AprE209在37 ℃時(shí)熱穩(wěn)定性較好，90 min內(nèi)相對(duì)酶活均保持在95%以上；45 ℃孵育30 min后，該堿性蛋白酶的相對(duì)酶活下降至50%左右，而當(dāng)水浴60 min時(shí)，其殘余酶活僅剩30%左右。50 ℃孵育30 min時(shí)，殘留酶活小于10%(圖5a)。相對(duì)應(yīng)地，2709堿性蛋白酶則具有更高的熱穩(wěn)定性(圖5b)。熱不穩(wěn)定的用途更多體現(xiàn)在酶發(fā)揮作用之后需要對(duì)殘余酶進(jìn)行滅活。由此也表明，AprE209可能具有與2709堿性蛋白酶不同的應(yīng)用溫度環(huán)境與應(yīng)用領(lǐng)域。

a-AprE209;b-AprE2709圖5 堿性蛋白酶AprE209和AprE2709的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermostability of alkaline proteases AprE209 and AprE2709

2.3.5 金屬離子對(duì)酶活的影響

在酶促反應(yīng)體系中加入終濃度為5 mmol/L或10 mmol/L不同的金屬離子和EDTA，研究其對(duì)AprE209酶活的影響并與2709堿性蛋白酶進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 金屬離子對(duì)AprE209和2709堿性蛋白酶酶活的影響

表2中金屬離子對(duì)AprE209和2709堿性蛋白酶的影響具有一定的相似性，其中Ca2+、Zn2+對(duì)2種蛋白酶的酶活均沒(méi)有明顯影響；Mg2+對(duì)AprE209有一定的抑制作用，而對(duì)2709堿性蛋白酶無(wú)明顯影響；K+、Co+、Cu2+、Fe3+、EDTA對(duì)這2種蛋白酶均具有不同程度的抑制作用，且Cu2+的抑制作用非常顯著。Mn2+對(duì)AprE209和AprE2709的酶活具有顯著的激活作用。此外，這2種蛋白酶對(duì)EDTA均較為敏感。

2.4 重組酶AprE209耐堿機(jī)制的初步解析

為了初步解析嗜堿性蛋白酶AprE209的耐堿機(jī)制，將其核苷酸及其演繹的氨基酸序列與現(xiàn)在工業(yè)上使用的堿性蛋白酶2709(AprE2709)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 AprE209和AprE2709的氨基酸序列比對(duì)Fig.6 Multiple sequence alignment of AprE209 and AprE2709

可以看出，AprE209前體與AprE2709的氨基酸序列相似度為98.29%。AprE209的氨基酸序列中有6個(gè)氨基酸殘基與蛋白酶2709存在差異，分別是Ile28、Ala124、Asn162、Pro204、Lys270和Ser287(圖6)。其中，Ile28位于蛋白酶的前肽序列中，會(huì)隨著AprE209前體的激活被切割掉[17]；而另外5個(gè)氨基酸位于成熟肽上，應(yīng)該是該突變體酶AprE209的相關(guān)酶學(xué)特征發(fā)生變化的基礎(chǔ)。

a-AprE209; b-AprE2709；催化三聯(lián)體和發(fā)生突變的氨基酸殘基分別用黑色和深灰色標(biāo)注；淺灰色標(biāo)注的是其他氨基酸；虛線表示的氫鍵，數(shù)字表示的是距離圖7 突變的氨基酸殘基以及催化三聯(lián)體周圍的氫鍵作用Fig.7 Hydrogen-bonding network formed around mutated amino acids and catalytic triads

進(jìn)一步對(duì)上述兩種堿性蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬與分析，結(jié)果表明，在5個(gè)有差異的氨基酸殘基以及催化三聯(lián)體周圍，AprE209比AprE2709多了2個(gè)氫鍵(圖7)。接著采用PIC在線服務(wù)器對(duì)AprE209和AprE2709的分子間作用力(包括離子鍵、二硫鍵及疏水相互作用等)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)二者的離子鍵和二硫鍵沒(méi)有差異，但是AprE209比AprE2709多了兩對(duì)疏水相互作用力。

3 討論

由于可以大大縮短洗滌時(shí)間，提高洗滌效率，堿性蛋白酶已經(jīng)作為添加劑廣泛應(yīng)用于洗滌劑行業(yè)。第一代商業(yè)化的洗滌劑用蛋白酶主要是來(lái)源于地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌和史密斯芽胞桿菌液的堿性蛋白酶，其最適反應(yīng)pH為9～10，如2709堿性蛋白酶、諾維信的Subtilisin Carlsberg以及Alcalase等[4]。由于這些堿性蛋白酶在洗滌衣物的環(huán)境中(pH 11.0)的酶活顯著下降，來(lái)源于嗜堿微生物的高堿性蛋白酶(最適反應(yīng)pH大于10.5)成為第2代洗滌劑用蛋白酶[4]。而目前國(guó)內(nèi)洗滌劑生產(chǎn)廠家采用的嗜堿性蛋白酶主要被國(guó)外企業(yè)壟斷。因此，獲得1株適用于工業(yè)化生產(chǎn)的嗜堿性蛋白酶的高產(chǎn)菌株，建立起具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的嗜堿性蛋白酶生產(chǎn)技術(shù)體系顯得非常必要和重要。

本研究通過(guò)菌株篩選以及基因的克隆與表達(dá)，獲得一個(gè)能在高堿性條件下保持較高活力的堿性蛋白酶嗜堿突變體AprE209。氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果表明，該酶與2709堿性蛋白酶的氨基酸序列差異性僅為1.71%(圖6)，但二者的酶學(xué)特征卻有較大的差異。酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，AprE209的最適反應(yīng)pH為11.0，高于2709堿性蛋白酶的最適反應(yīng)pH(圖2)；并且，AprE209在pH 5.0～12.0的范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，在pH 12.0的堿性條件下仍能保留80%以上的酶活，pH穩(wěn)定性也優(yōu)于2709堿性蛋白酶(圖3)。

分子間的相互作用力，如疏水相互作用、靜電相互作用以及氫鍵在穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及改變催化殘基的pKa值等方面發(fā)揮著重要的作用[18]。本文進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，重組酶AprE209比AprE2709多了2對(duì)疏水相互作用力，這可能是其在堿性條件下仍具有良好的活性和穩(wěn)定性的原因。嗜堿突變體AprE209中活性位點(diǎn)His139周圍比AprE2709多了1個(gè)氫鍵(圖7，His139與Asp135之間形成的氫鍵)，這可能也是其具有耐堿性的重要原因之一，因?yàn)榻z氨酸蛋白酶對(duì)pH的依賴性與活性中心里組氨酸的pKa值有關(guān)[19]。此外，AprE209中Lys270比AprE2709的Glu270周圍多了2個(gè)氫鍵(圖7)，這也可能與其耐堿性有關(guān)。后續(xù)將通過(guò)定點(diǎn)突變，進(jìn)一步確認(rèn)這些氨基酸殘基在AprE209的耐堿性中發(fā)揮的作用。

此外，本研究獲得的AprE209在較低的溫度下(30～37 ℃)仍能保持相對(duì)較高的酶活，將它加入洗滌劑中清洗衣物時(shí)，不需要用40～60 ℃的熱水浸泡便能發(fā)揮其洗衣效力。這樣既避免了能源的浪費(fèi)，也符合亞洲特別是發(fā)展中國(guó)家用自來(lái)水洗衣服的習(xí)慣，還將促進(jìn)全球洗衣行業(yè)向著低溫、節(jié)水型發(fā)展。

綜上所述，本研究通過(guò)菌株篩選和分子克隆技術(shù)獲得了堿性蛋白酶嗜堿突變體AprE209，它在高堿性和低溫條件下能保持相對(duì)較高的活性，在洗滌劑、食品、化妝品以及水產(chǎn)飼料等行業(yè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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Biochemical characterization of alkalophilic mutant ofBacilluslicheniformisprotease

HUANG Lei1，DONG Zi-xing2*，JIN Peng2，WANG Zheng-xiang2，LU Fu-ping1*

1(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457,China)2(Department of Biochemical Engineering，College of Chemical Engineering and Materials Science，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457,China)

Alkaline protease fromBacilluslicheniformisis an important protease in the industry. Improving its activity and stability under alkaline pH conditions can broaden the range of applications in detergent industry. In this study, a high-alkaline protease fromB.licheniformisB186 was screened, and its encoding gene was successfully cloned and expressed inB.subtilisWB600 to generate the recombinant bacterium WB600 (pHY-E209). Recombinant alkaline protease AprE209 was then purified to apparent homogeneity from the supernatant of the recombinant bacterium using ion exchange chromatography and filtration chromatography. The optimum pH and temperature of recombinant enzyme AprE209 were 11.0 and 50 ℃, respectively. This recombinant enzyme also retained high activities at temperatures of 30-37 ℃ or pH 12.0. Furthermore, the mechanism of alkali-tolerance of AprE209 was analyzed by bioinformatics tools. The alkalophilic mutant ofB.licheniformisprotease obtained in this study had potential applications in detergent industry.

protease；alkalophilic mutant；detergent industry；enzymatic properties

碩士研究生(董自星博士、路福平教授為共同通訊作者，E-mail: dzx@tust.edu.cn; lfp@tust.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31370076)；福建省自然科學(xué)基金(2016J01157)

2016-12-15,改回日期：2017-01-04

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706006