釀酒酵母孢子表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建及應用*

喬潁鑫，李子杰，中西秀樹，高曉冬

(江南大學 生物工程學院，糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

釀酒酵母孢子表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建及應用*

喬潁鑫，李子杰，中西秀樹，高曉冬*

(江南大學 生物工程學院，糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

旨在建立1種釀酒酵母孢子表面展示系統(tǒng)，并將其應用于稀有糖合成。表面展示系統(tǒng)是運用微生物自身功能把外源蛋白或多肽展示在細胞表面，文中用磷酸甘油氧化酶(GPO)來驗證釀酒酵母孢子表面展示系統(tǒng)的可行性。將編碼肺炎鏈球菌來源的GPO的基因glpo與信號肽序列(ss)融合后連接到載體pRS424-TEFpr上，將重組質(zhì)粒pRS424-TEFpr-ss-glpo轉(zhuǎn)化至釀酒酵母野生型及缺陷型菌株中并進行產(chǎn)孢，通過熒光觀察、western blot分析以及酶活測定，表明釀酒酵母缺陷型孢子可以實現(xiàn)蛋白的表面展示。通過對GPO孢子表征，表明GPO孢子在pH為7.0、溫度為30℃時活性最高，該孢子作為催化劑可以重復使用，當使用第3次時，活性可達最大活性的40%。最后將GPO孢子應用于“一鍋四酶法”進行稀有糖L-果糖的合成，轉(zhuǎn)化率為12%。

孢子表面展示；磷酸甘油氧化酶；釀酒酵母；稀有糖

表面展示系統(tǒng)是運用微生物自身功能把外源蛋白或多肽展示在細胞表面，從最早的噬菌體表面展示到細菌、桿狀病毒，再到目前應用廣泛且安全性高的酵母表面展示，表面展示系統(tǒng)取得了較大進展[1-2]。而關(guān)于利用釀酒酵母孢子來進行表面展示的方法還未見報道。

釀酒酵母在以醋酸鹽為唯一或主要碳源，并輔以缺乏氮源等特定條件下，就會以孢子生殖的方式進行繁殖，在胞內(nèi)形成孢子[3]。孢子壁具有4層結(jié)構(gòu)，由里到外依次為甘露糖蛋白層、葡聚糖層、殼聚糖層以及二酪氨酸層[4-5]。較釀酒酵母營養(yǎng)細胞壁來說，孢子壁外層多殼聚糖層和二酪氨酸層，由于殼聚糖層的蛋白交聯(lián)作用及致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)二酪氨酸層的攔截作用，在酵母孢子中表達分泌蛋白或帶有分泌型信號肽的非分泌蛋白時，蛋白會被固定到孢子表面[6](如圖1)。孢子壁的合成是有順序的，比如最外層二酪氨酸層只有在次外層殼聚糖層形成后才開始合成[7-8]。利用孢子壁合成的這一特點，實驗室前期構(gòu)建了一系列研究孢子壁的缺陷型菌株，本實驗中利用dit1缺陷型菌株來構(gòu)建孢子表面展示系統(tǒng)，基因DIT1參與二酪氨酸層合成途徑中的第1步反應，當敲除該基因就會導致孢子二酪氨酸層的消失[9]，將殼聚糖層暴露在孢子表面，形成“孢子殼聚糖球”[6]。

圖1 釀酒酵母孢子壁的固定原理圖Fig.1 The immobilization theory of S. cerevisiae spore wall

磷酸甘油氧化酶(glycerophosphate oxidase, GPO, E.C 1.1.3.21)能夠?qū)Ｒ坏卮呋疞-3-磷酸甘油的氧化，生成磷酸二羥丙酮(dihydroxyacetone phosphate, DHAP)。GPO普遍存在于鏈球菌、乳酸菌、大腸桿菌及昆蟲飛行肌等[10]。國內(nèi)對GPO的研究甚少，國外主要研究了來自于糞鏈球菌、腸球菌等的GPO的特性、結(jié)構(gòu)、固定化等[11-15]。

稀有糖為自然界中存在但含量很低的單糖及其衍生物[16]，在食品、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域具有廣泛的應用前景[17-18]。據(jù)推測，自然界中約存在50種稀有糖，目前發(fā)現(xiàn)的約有34種。研究的較多的有L-果糖、L-塔格糖、D-阿洛酮糖、D-山梨糖。這些稀有糖非常適用于糖尿病和肥胖癥患者[19-20]，可以用來作為功能性的甜味劑[21-23]，都可作為前體物質(zhì)用于工業(yè)合成，生產(chǎn)醫(yī)藥及化妝品等有生物活性的化合物[24-26]，另外，L-果糖還可以作為各種糖苷酶的抑制劑[27]。在前期工作中，我們基于包括GPO和DHAP依賴型醛縮酶在內(nèi)的“一鍋四酶法” 策略進行了一系列稀有糖的合成[28-30]。本研究擬以肺炎鏈球菌來源的GPO作為模型，利用酵母dit1Δ突變菌株初步構(gòu)建GPO孢子表面展示系統(tǒng)并研究其在稀有糖合成中的應用。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

實驗中所用菌株和質(zhì)粒分別見表1和表2。

表1 實驗所用的釀酒酵母菌株

表2 實驗所用的質(zhì)粒

1.2 培養(yǎng)基

(1)SD培養(yǎng)基：無氨基酸酵母氮源(YNB)6.7 g/L，色氨酸缺陷型粉末2 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂粉20 g/L(固體培養(yǎng)基)，濕熱滅菌(121℃，20 min);

(2)YPACe培養(yǎng)基：酵母膏20 g/L，蛋白胨10 g/L，腺嘌呤30 mg/L，乙酸鉀20 g/L，濕熱滅菌(121℃，20 min);

(3)乙酸鉀液體培養(yǎng)基：乙酸鉀 20 g/L。

1.3 主要儀器與試劑

超聲破碎儀南京新辰生物科技公司；SDS-PAGE 凝膠電泳儀、半電轉(zhuǎn)儀購,美國伯樂公司；ImageQuantTMLAS 400 mini,美國GE；熒光倒置顯微鏡,日本尼康公司；冷凍干燥機,日本EYELA；BSZ-100自動部份收集器、HL-2恒流泵,上海滬西分析儀器廠；冷卻水循環(huán)裝置CCA-1111、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷凍干燥機,日本東京理化公司。

限制性內(nèi)切酶、DNA T4連接酶及KOD DNA 聚合酶購于TaKaRa公司(大連)；DL-3-磷酸甘油(DL-glycerol 3-phosphate magnesium salt hydrate)、磷酸甘油脫氫酶(GDH)、酸性磷酸酶(acid phosphatase from sweet potato)、過氧化氫酶 (catalase)購于Sigma-Aldrich；ClarityTMWestern ECL Substrate 顯色劑、還原型輔酶Ⅰ二鈉鹽(NADH)購于碧云天生物技術(shù)研究所；Rabbit anti-FLAG 一抗、Goat anti-rabbit IGg，HRP 二抗購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；氧氣購于新南氣體；L-鼠李樹膠糖-1-磷酸醛縮酶(L-rhamnulose-1-phosphate aldolase, RhaD)為實驗室前期純化。

1.4dit1Δ菌株的構(gòu)建

DIT1基因的敲除過程如下：以pFAa-HIS3MX6為模板，AATTTGTTAATATCCTAATTCGGTAAA￣G￣C￣T￣T￣T￣G￣T￣C￣G￣AGACATTAACAAAACGGATCC￣C￣C￣G￣G￣G￣T￣T￣A￣A￣T￣T￣AA和TGTTTAAGTAAAAGAACAAAAAGGT￣A￣G￣A￣C￣C￣AATGTAGCGCTCTTACTTTAGAATTCGA￣G￣C￣T￣C￣G￣T￣T￣T￣A￣AAC為引物進行PCR，將得到的PCR片段整合到單倍體AN117-4B和AN117-16D中，涂布在選擇性平板SD-HIS上，選擇菌落提基因組進行驗證。敲除成功后，將獲得的缺陷型單倍體菌株融合為二倍體。驗證引物為CATAAATTGTGCTCCTCCGC和CA￣T￣T￣G￣C￣A￣G￣TGT￣C￣T￣C￣G￣A￣A￣A￣CC。

1.5 酵母產(chǎn)孢及孢子破碎

將含有相應重組質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子，接種到5 mL 相應的SD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃下?lián)u床過夜培養(yǎng)，然后取3 mL過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到30 mL YPAce培養(yǎng)基中，在30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)20 h，然后離心收集所有菌體，用無菌去離子水洗滌2次，轉(zhuǎn)接到20 mL 2% 乙酸鉀培養(yǎng)基中，30 ℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)1 d左右得到成熟的孢子。

為了得到單個的孢子，需要將上述培養(yǎng)好的子囊孢子進行酶處理和超聲破碎。具體過程如下：5 000 r/min 離心1 min收集子囊孢子，將所有細胞重懸于2 mL 原生質(zhì)體緩沖液(50 mmol/L pH 7.5 的PBS，1.4 mol/L山梨醇和40 mmol/L β-巰基乙醇)中，充分混勻后，加入20 μL β-葡聚糖酶溶液(5 mg β-葡聚糖酶溶在500 μL 50% 甘油)，30 ℃搖床振蕩2 h。8 000 r/min 離心1 min 收集處理過的細胞，棄掉上層清液，得到的細胞沉淀用原生質(zhì)體緩沖液洗滌2次，重懸于原生質(zhì)體溶液中充分混勻，最后用超聲破碎儀破碎獲得單個孢子。將超聲破碎得到的單個孢子進行離心，用無菌水洗滌2遍，最后溶于適量無菌水，進行冷凍干燥得到干燥的孢子粉末。

1.6 孢子熒光觀察

取500 μL成熟孢子的培養(yǎng)液置于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心30 s，棄掉上清，用1×PBS洗滌2次，最后用1 mL 1×PBS重懸，取5 μL 酵母孢子重懸液滴于純凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，倒置于尼康熒光倒置顯微鏡下，使用100×油鏡觀察。圖像利用NIS-Element AR軟件分析。

1.7 Western blot 分析GPO在孢子細胞表面的表達

(1)蛋白樣品的獲得。將含有質(zhì)粒pRS424-TEFpr-ss-glpo-flag的野生型菌株接種到5 mL SD-TRP液體培養(yǎng)基中，30 ℃下?lián)u床過夜培養(yǎng)，取2 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到 20 mL SD-TRP中，培養(yǎng)20 h，測其OD值，計算總菌體數(shù)量，離心收集菌體及發(fā)酵液；同時取3 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到 30 mL YPAce培養(yǎng)基中，在30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)20 h，測其OD值，取與營養(yǎng)細胞相同菌體量離心收集，用無菌去離子水洗滌2次，轉(zhuǎn)接到20 mL 2% 乙酸鉀培養(yǎng)基中，30 ℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)1 d，離心收集孢子和產(chǎn)孢發(fā)酵液。dit1Δ菌株孢子獲得方法與野生型相同。將野生型及dit1Δ子囊孢子參考1.4的方法得到分散的孢子；

將上述破碎后得到的單個濕孢子及野生型營養(yǎng)細胞，用1×PBS(0.01 mol/L， pH 7.4)洗滌2次后重懸于500 μL 1×PBS ，加入適量玻璃珠，振蕩破碎，破碎1 min，立即放置于冰上1 min，反復進行10次左右。5 000×g離心5 min，收集上清液，將3種上清液用1×PBS調(diào)整到相同體積800 μL，并將營養(yǎng)細胞發(fā)酵液和產(chǎn)孢發(fā)酵液用超濾管濃縮至相同體積，從而獲得所需的蛋白樣品；

(2)取10 μL蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE電泳，電泳條件：90 V，30 min；120 V，1 h；

(3)將剪好的尺寸合適的PVDF 膜在甲醇溶液中浸泡5 s進行活化，然后將剪好的濾紙、活化后的PVDF膜及電泳完的凝膠浸在轉(zhuǎn)膜緩沖液中；

(4)按照由下到上濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙的順序疊放于電轉(zhuǎn)儀(1.0 A，25 V，30 min)；

(5)電轉(zhuǎn)完成后，將PVDF膜用5%的脫脂奶粉TBST溶液封閉3 h；

(6)用TBST清洗2次，將其放置于含有一抗(Rabbit anti-FLAG，1∶3000稀釋)的封閉液中，4℃過夜；

(7)TBST清洗3次，將其放置于含有二抗(Goat anti-rabbit IgG HRP，1∶5000稀釋)的封閉液中，37℃處理2 h；

(8)TBST清洗3次后用ECL顯色試劑盒進行顯色。

1.8 GPO孢子的活性測定

GPO孢子的活性以50 mmol/LDL-3-磷酸甘油為底物，在氧氣過量條件下測定。向1 mL 50 mmol/LDL-3-磷酸甘油水溶液中加入30 mg孢子，30℃反應1 h后終止反應。由于GPO能夠催化L-3-磷酸甘油生成DHAP，GPO的氧化活性通過DHAP生成量來測定。DHAP在甘油磷酸脫氫酶(GDH)的作用下生成3-磷酸甘油，此過程會消耗NADH，因此可以通過NADH的消耗量得出DHAP的生成量。檢測DHAP的反應體系如下：GPO孢子反應液10 μL, NADH(20 mmol/L) 3 μL, Tris-HCl( pH 7.5 ) 284 μL, 用酶標儀測340 nm下的吸光度值，然后加入3 μL GDH (50 U/mL)，25℃反應10 min，再次測其340 nm下的吸光度值，以2次吸光度的差值及NADH標準曲線計算DHAP的量。由于DHAP在高溫下不穩(wěn)定，所以采用低溫隔絕氧氣法終止反應。

為了測定pH對GPO孢子酶活的影響，使用4種緩沖液在30 ℃下，采用不同pH值測定酶活。4種緩沖液分別為醋酸緩沖液(100 mmol/L, pH 4.0, 5.0, 5.4, 5.8)、磷酸緩沖液(100 mmol/L, pH 5.8, 6.0, 7.0, 8.0)、Tris-HCl 緩沖液(100 mmol/L, pH 7.0, 8.0, 9.0)和甘氨酸緩沖液(100 mmol/L, pH 9.0, 10.0, 10.6)。為了測定溫度對GPO孢子酶活的影響，反應以100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)作為緩沖液在不同溫度下(10～60 ℃)測定GPO孢子酶活。酶活的相對活性定義為最大酶活的百分比。

dit1Δ缺陷型GPO孢子的重復使用情況，以50 mmol/L DL-3-磷酸甘油為底物，以30 mgdit1Δ 缺陷型GPO孢子進行反應，100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)作為緩沖液，1 mL反應體系30 ℃反應1 h后，將孢子收集，用超純水洗兩遍，再以相同的條件進行反應，重復多次。

1.9 “一鍋四酶法”反應體系合成L-果糖

反應體系(10 mL)：DL-3-磷酸甘油 (548.78 mg，2.4 mmol)，L-甘油醛(0.187 mol/L, 5.34 mL, 1.0 mmol)，dit1Δ缺陷型GPO孢子(400 mg)，過氧化氫酶 (1 000 U，1.18 μL)，醛縮酶RhaD(終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL)，補加無菌水使反應總體積為10 mL，上述所有物質(zhì)都加入到250 mL圓底燒瓶中，通入氧氣，30 ℃，150 r/min 反應22 h。反應過程中每隔一段時間取樣1 μL進行TLC(薄層層析)檢測，使用V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=2∶1∶1 作為展開劑，并使用茴香醛染液進行染色。當L-甘油醛消耗完全或者酮糖-1-磷酸不再增加時，用6 mol/L的HCl將pH調(diào)為4.6，向其中加入酸性磷酸酶(10 μL)，37 ℃，150 r/min 反應1 d，反應液分別取1 μL進行TLC檢測，使用V(乙酸乙酯)∶V(異丙醇)∶V(水)=9∶3∶1作為展開劑。

1.10L-果糖的分離純化

1.10.1 硅膠純化

(1)樣品的預處理。向反應液中加入一定量的甲醇將蛋白沉淀完全，然后10 000 × g 離心20 min，將得到的上清液轉(zhuǎn)入100 mL 圓底燒瓶中，將圓底燒瓶連接到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在40 ℃下減壓蒸發(fā)濃縮樣品。待樣品濃縮至較少體積(約5 mL)時，向其中加入適量的硅膠搖晃均勻，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，當硅膠粉全部呈粉末狀后，可結(jié)束旋蒸。

(2)裝柱及上樣純化。將閃式層析柱底部填入少量棉花，防止硅膠漏，然后固定于鐵架臺上。取適量硅膠粉，用乙酸乙酯混勻，倒入層析柱中，使最終的硅膠大約達到柱子的1/3高度，然后使用雙聯(lián)球加壓，反復2次，硅膠面不再改變時，準備上樣。將旋蒸后的硅膠粉用漏斗加到層析柱中，雙聯(lián)球加壓。先以乙酸乙酯為流動相，除掉一些非極性小分子，然后用V(乙酸乙酯)∶V(異丙醇)∶V(水)=9∶3∶1為流動相進行純化，將洗脫液按順序收集到試管中。

(3)目的產(chǎn)物洗脫液的鑒定及濃縮。用毛細管蘸取試管中的洗脫液，將其滴到硅膠層析板上進行TLC檢測，用低溫吹風機吹干，顯色，通過硅膠板上是否有目的產(chǎn)物顯色初步判斷哪些試管洗脫液中含有目的產(chǎn)物。然后將含有目的產(chǎn)物的試管用對應的稀有糖為標準品，以V(乙酸乙酯)∶V(異丙醇)∶V(水)=9∶3∶1為展開劑再次做TLC檢測，使洗脫液中的物質(zhì)在層析板上分離開，進一步確定哪些試管含有目的產(chǎn)物。將那些含有目的產(chǎn)物的試管合并，倒入250 mL圓底燒瓶中，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至1～2 mL用于P-2凝膠排阻層析待用。

1.10.2 P-2凝膠排阻層析

(1)P-2 填料的預處理與裝柱。P-2填料的預處理參照P-2凝膠的說明進行操作。然后將P-2玻璃柱子(1.5 cm ×90 cm)垂直固定于鐵架臺上，倒入適量去離子水并關(guān)閉出水口。將P-2填料混勻，將適量填料倒入柱子，待其沉積一定的高度后，可打開出水口，不斷加入填料，待填料沉積后，再加入，直至膠面高度合適(離柱子上邊緣約10 cm)，使用蠕動泵將脫氣后的去離子水泵入入水口來平衡柱子，設(shè)置合適的流速，平衡過夜。

(2)上樣與分離。將平衡好的柱子的入水口關(guān)閉，打開出水口，讓水液面自然下降，當液面剛剛下降至膠面處時將出水口關(guān)閉。此時把硅膠純化后得到的目的產(chǎn)物的濃縮液(1～2 mL)均勻地加入到膠面上，打開出水口，當濃縮液完全進入到膠面時，向其中加入適量去離子水，接通入水口，設(shè)置合適的流速，開始分離，同時用自動收集器進行收集。目的產(chǎn)物的鑒定同上。最后將那些含有目的產(chǎn)物的試管合并，用冷凍干燥機凍干，稱重計算產(chǎn)率，并對所得到的L-果糖進行1H NMR鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 釀酒酵母孢子表面展示系統(tǒng)的驗證

我們擬采用生物法利用酵母dit1Δ缺陷型菌株在產(chǎn)孢過程中將GPO酶展示到“孢子殼聚糖球”的表面。為了驗證GPO是否展示到孢子表面，構(gòu)建GPO和綠色熒光蛋白的融合蛋白。通過熒光可以看到，如圖2所示。

圖2 質(zhì)粒pRS424-TEFpr-ss-glpo-GFP在不同菌株中表達后孢子熒光圖Fig.2 GFP fluorescence of different spores harbouring pRS424-TEFpr-ss-glpo-GFP(注：BF-Bright Field，亮視野； GFP-綠色熒光蛋白)

野生型孢子和dit1Δ均可以顯示出熒光在孢子壁上的清晰輪廓。由于野生型孢子具有完整的二酪氨酸層，能夠?qū)⒌鞍拙o密地包裹在孢子壁上，故熒光較強些。而dit1Δ缺陷型菌株不含有二酪氨酸層，沒有二酪氨酸層的攔截作用，有部分蛋白分泌到胞外，所以熒光較弱些，但其優(yōu)勢便是可以將蛋白更大程度地展示在孢子表面，便于和不同底物進行接觸反應。

為了進一步驗證孢子酶固定化，構(gòu)建了帶有flag標簽的重組質(zhì)粒，將其在酵母和營養(yǎng)細胞中表達，通過Western blot檢測，由圖3可以得出，固定化效果顯著，營養(yǎng)細胞培養(yǎng)過程中，大部分的GPO蛋白都分泌到發(fā)酵液中，留在細胞上的很少，而野生型孢子固定的蛋白量很大，產(chǎn)孢發(fā)酵液中只含有少量蛋白，dit1Δ孢子固定的蛋白量較野生型略少，但與營養(yǎng)細胞中的殘留蛋白相比顯著增多。另外由于GPO本身存在N糖基化位點，因此Western blot可以檢測出2條帶。

1-營養(yǎng)細胞發(fā)酵液上清；2-營養(yǎng)-細胞；3-野生型孢子；4-產(chǎn)孢發(fā)酵液上清；5-dit1Δ孢子圖3 質(zhì)粒pRS424-TEFpr-ss-glpo-flag在孢子和營養(yǎng)細胞中表達后的Western blot檢測Fig.3 Western blot analysis of pRS424-TEFpr-ss-glpo-flag expressed in spore and vegetative cell

通過熒光觀察和Western blot檢測，說明釀酒酵母孢子可以將蛋白固定在孢子壁上，為了驗證dit1Δ孢子的表面展示效果，選擇以磷酸甘油氧化酶(GPO)的活性作為驗證指標，因為甘油磷酸氧化酶的底物L-3-磷酸甘油微溶，且另一個底物為氧氣，其活性的高低可以作為蛋白是否展示到孢子表面的有力指標。分別取30 mg野生型孢子、dit1Δ孢子以及只含有空載(pRS424TEF)的野生型孢子(作為對照)，在30 ℃下反應1 h測定其活性，結(jié)果如圖4所示，dit1Δ孢子的活性較野生型孢子高出1.5倍，說明該dit1Δ孢子表面展示系統(tǒng)構(gòu)建成功。

圖4 酵母孢子GPO活性測定Fig.4 GPO activity assay of different spores

2.2 pH及溫度對GPO孢子活性的影響

pH對GPO孢子活性的影響如圖5所示，總體來說，GPO孢子能夠耐受較廣的pH值。當使用pH為7.0的Tris-HCl緩沖液時，酶活最高，此外，當使用磷酸緩沖液時，pH為8.0時的酶活最高，可能是由于磷酸根對GPO酶活的影響。在pH 7.0(Tris-HCl緩沖液)條件下測定了溫度對GPO孢子活性的影響，由圖6可知，GPO孢子的最適溫度約為30 ℃，但不耐高溫，在60 ℃時活性幾乎喪失。

圖5 pH對GPO孢子活性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity of GPO spores

圖6 溫度對GPO孢子活性的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity of GPO spores

2.3 GPO孢子的重復利用性

孢子表面展示系統(tǒng)的一個優(yōu)點即可以作為催化劑重復利用，GPO孢子的重復使用后相對酶活如圖7所示，將第1次使用的酶活定義為100%，第2次使用時活性可達到60%，第3次約為40%。因此，當使用次數(shù)控制在3次以內(nèi)時，活性還是相當可觀的。

圖7 孢子重復使用性測定Fig.7 Repeated enzymatic assays of spores

2.4 利用GPO孢子合成L-果糖

利用“一鍋四酶法”體系進行稀有糖L-果糖的合成，經(jīng)純化后得到L-果糖22.1 mg，產(chǎn)率約為12.3%(由于L-3-磷酸甘油過量，產(chǎn)率根據(jù)L-甘油醛的量計算)，純化后的L-果糖進行了1HNMR鑒定如圖8示。

圖8 化后產(chǎn)物L-果糖的1H NMR鑒定Fig.8 Characterization of the product L-fructose after purification by 1H NMR

3 結(jié)語

本文通過磷酸甘油氧化酶的釀酒酵母孢子表面展示并將其成功用于稀有糖的合成，得出孢子表面展示系統(tǒng)作為一種新的基因操作技術(shù)，通過分子生物學的方法使目標酶蛋白展示到孢子殼聚糖層的表面，保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，并且無需蛋白純化和固定化操作以及能夠重復使用等，在醫(yī)藥、保健及食品等方面具有廣泛的應用價值。本研究中，由于驗證該表面展示系統(tǒng)的可行性，所以選擇磷酸甘油氧化酶作為外源蛋白，在實際應用中，該展示系統(tǒng)適用于各式各樣的分泌蛋白以及連接有分泌型信號肽的非分泌型蛋白，應用廣泛，具有廣闊的發(fā)展前景。

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Construction and application of a novel surface display system on yeast spore

QIAO Ying-xin, LI Zi-jie, NAKANISHI Hideki, GAO Xiao-dong

(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122 China)

In this paper, a novel surface display system on yeast spore and its application for rare sugar synthesis were studied. Surface display system was used by microorganisms to display the exogenous proteins or peptides on their cell surface. Glycerophosphate oxidase (GPO) was used to verify the feasibility of the novel surface display system. The gene glpo GPO fromStreptococcuspneumoniaewas fused with signal sequence and inserted into pRS424-TEFpr vector. The recombinant plasmid pRS424-TEFpr-ss-glpowas transformed into wild type and auxotroph ofS.cerevisiaeto sporulate. The results from fluorescence analysis, western blot detection and activity assays showed thatS.cerevisiaespore surface display system was successfully constructed. The GPO spores were characterized and their optimum pH and temperature were 7.0 and 30℃, respectively. Moreover, the spores could be reused with activity of about 40% of the maximum activity at the third time. Finally, GPO spores were employed in the one-pot four-enzyme system for synthesis of rare sugarL-fructose with yield of about 12%.

spore surface display; glycerophosphate oxidase;Saccharomycescerevisiae; rare sugar

碩士研究生(高曉冬教授為通訊作者,E-mail：xdgao@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(21302069)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項基金資助(JUSRP1003)；教育部科學技術(shù)研究重大項目(313027)

2014-12-04，改回日期：2015-02-06

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706002