晚期糖基化終產(chǎn)物與輸卵管因素不孕癥患者卵子發(fā)育不良的關(guān)系

李雪梅，劉 紅，林碎玲，張華坤，譚斯勻，成艷君

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 518048

晚期糖基化終產(chǎn)物與輸卵管因素不孕癥患者卵子發(fā)育不良的關(guān)系

李雪梅，劉 紅，林碎玲，張華坤，譚斯勻，成艷君

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 518048

目的探討晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）對(duì)卵子質(zhì)量及顆粒細(xì)胞功能的影響。方法選擇2015年2～6月，因輸卵管因素行體外受精助孕的患者，年齡＜35歲，獲卵數(shù)≥8個(gè)，以長(zhǎng)效長(zhǎng)方案促排卵，取卵時(shí)收集所有卵泡液和顆粒細(xì)胞凍存。共有19例入選，將優(yōu)質(zhì)胚胎率＞35%的分為A組（n=10），優(yōu)質(zhì)胚胎率＜35%的分為B組（n=9）。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)抗體夾心法檢測(cè)取卵日卵泡液AGEs和活性氧水平，采用Real-time PCR檢測(cè)顆粒細(xì)胞RAGE mRNA表達(dá)，分析兩組之間有無(wú)差異。結(jié)果兩組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組的平均優(yōu)胚數(shù)（5.2±2.34vs1.50±1.08，P=0.001）和優(yōu)胚率（60.27%±12.48%vs21.48%±14.02%，P=0.000）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組患者卵泡液活性氧水平（0.82±0.28 ng/mLvs1.11±0.27 ng/mL，P=0.000）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，卵泡液AGEs水平（0.33±0.13 μg/mLvs0.35±0.13 μg/mL,P=0.462）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顆粒細(xì)胞RAGE水平（1.55±0.62 pg/mLvs3.75±1.75 pg/mL，P=0.005）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論氧化應(yīng)激狀態(tài)可能是輸卵管因素的年輕不孕癥患者卵子質(zhì)量低下的原因，但AGES-RAGE可能并不是其作用途徑。

晚期糖基化終產(chǎn)物；顆粒細(xì)胞；卵泡液；氧化應(yīng)激

體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術(shù)自1978年應(yīng)用于臨床以來(lái)，隨著臨床和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)技術(shù)逐步提高，臨床妊娠率由最初的5%左右提高到現(xiàn)在的50%以上。一般認(rèn)為，年齡是影響卵子質(zhì)量及妊娠率的重要因素[1]，但是對(duì)于年輕（＜35歲）、卵巢功能正常的患者，在合適的促排卵方案和穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室條件下，不同的患者卵子質(zhì)量不同，胚胎質(zhì)量差別甚大，年輕的患者甚至出現(xiàn)無(wú)可用胚胎而取消胚胎移植的情況，即使移植也妊娠率甚低。

氧化應(yīng)激是引起卵子及后續(xù)胚胎發(fā)育不良的重要原因[2]，晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）通過(guò)其受體（RAGE）誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生，可能參與卵子發(fā)育不良的形成。對(duì)于AGEs與卵子質(zhì)量的關(guān)系的研究，以往大多集中于分析高齡婦女、多囊卵巢綜合征（PCOS）患者及糖尿病患者等[3-7]，鮮見(jiàn)探討AGEs對(duì)年輕的輸卵管因素不孕癥患者卵子質(zhì)量的影響。本課題通過(guò)檢測(cè)此研究組IVF患者卵泡液及顆粒細(xì)胞的AGEs、RAGE和ROS水平，分析其與卵子質(zhì)量、后續(xù)胚胎發(fā)育之間的關(guān)系，探討AGEs與不明原因卵子發(fā)育不良的關(guān)系，擬尋找這些患者卵子質(zhì)量低下的原因，為下一步改善其妊娠結(jié)局提供新的治療思路。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)及深圳市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)審查批準(zhǔn)，所有患者術(shù)前均簽署知情同意書。

1 資料與方法

1.1 病例資料

研究選擇2015年2～6月，在我院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF助孕的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：輸卵管因素的不孕癥患者，女方年齡＜35歲，獲卵數(shù)≥8個(gè)，所有患者以長(zhǎng)效長(zhǎng)方案促排卵，取卵時(shí)收集所有卵泡液和顆粒細(xì)胞凍存。排除標(biāo)準(zhǔn)：子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜息肉或?qū)m腔粘連、子宮畸形、子宮肌瘤、卵巢功能下降、夫婦任何一方染色體異常或有全身系統(tǒng)性疾病、既往有不良孕產(chǎn)史、男性因素不孕。分組：根據(jù)胚胎培養(yǎng)結(jié)果，共有19例患者入選，將優(yōu)質(zhì)胚胎率＞35%的分為A組（n=10），優(yōu)質(zhì)胚胎率＜35%的分為B組（n=9）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卵泡液和顆粒細(xì)胞的收集 將收集的所有卵泡液置45%的Percoll上離心，1500 r/min，15 min；將上層的卵泡液分裝于EP管，標(biāo)記后直接凍存-70 ℃待檢；顆粒細(xì)胞位于Percoll液面上呈一層白膜，吸取顆粒細(xì)胞，分裝于EP管，標(biāo)記后直接凍存-80 ℃待檢。

1.2.2 檢測(cè)方法 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）抗體夾心法檢測(cè)取卵日卵泡液AGEs和ROS水平。用Percoll分離法收集顆粒細(xì)胞。Trizol法提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，接著進(jìn)行RAGE基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR（Realtime-PCR），采用AACt法計(jì)算RAGEmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布者組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。設(shè)置雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

A、B兩組患者的基本資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表1），在年齡、不孕年限、啟動(dòng)日性激素水平、HCG日性激素水平、獲卵數(shù)、2PN數(shù)等方面比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組平均優(yōu)胚數(shù)（5.2±2.34vs1.50±1.08，P=0.001）和平均優(yōu)胚率[（60.27±12.48）%vs（21.48±14.02）%，P=0.000]差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 兩組卵泡液ROS、AGES和顆粒細(xì)胞RAGE比較

A組卵泡液ROS水平和RAGE水平均低于B組（P＜0.05），AGES差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表1 兩組患者的基本資料比較（）

表1 兩組患者的基本資料比較（）

*P＜0.05.

項(xiàng)目 A組（n=10） B組（n=9）P女方年齡（歲）31.3±3.3729.4±2.550.172不孕年限（年）4.6±3.133.2±2.440.28 Gn天數(shù)（d）11±2.3610.7±1.640.745 Gn總量（U）2047.5±602.131691.25±635.770.215啟動(dòng)日FSH（mU/mL）2.67±0.972.86±1.550.749 LH（mU/mL）1.26±0.941.52±1.00.551 E2（pg/mL）17.2±11.9317.8±9.440.902P（pmol/mL）0.38±0.210.56±0.320.166 HCG日LH（mU/mL）1.74±1.301.72±0.980.957 E2（pg/mL）3272.9±983.063468.6±1029.480.669P（pmol/mL）1.04±0.241.11±0.460.702獲卵數(shù)13.3±2.4514.5±4.740.486平均E2值/卵（pg/mL）245.40±54.96252.68±94.850.836 MII卵率（%）82.67±16.9184.0±12.720.810 2PN率（%）64.7±22.9072.65±13.190.356平均優(yōu)胚數(shù)5.2±2.341.50±1.080.001*優(yōu)胚率（%）60.27±12.4821.48±14.020.000*

表2 兩組ROS、AGES和RAGE水平比較

3 討論

AGEs是人體衰老的生物學(xué)指標(biāo)之一，存在于正常人體許多組織和細(xì)胞，通過(guò)直接或與受體RAGE結(jié)合，誘導(dǎo)多種組織氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，通過(guò)間接途徑損傷機(jī)體。研究[3-9]發(fā)現(xiàn)整體及卵巢局部中高水平AGEs、RAGE高表達(dá)與女性不孕及不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)，并且卵泡液AGEs濃度與IVF周期卵巢反應(yīng)和卵子質(zhì)量相關(guān)。推測(cè)AGEs可能通過(guò)參與卵泡內(nèi)氧化應(yīng)激，造成卵子質(zhì)量低下。

AGEs通過(guò)結(jié)合其受體RAGE誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，與細(xì)胞凋亡及組織損害有關(guān)[5]。而AGERAGE相互作用參與機(jī)體多器官多系統(tǒng)疾病發(fā)病，如神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)相關(guān)疾病[10]。長(zhǎng)時(shí)間暴露于AGEs可能引起原始卵泡和卵巢間質(zhì)血管氧化損傷，促進(jìn)卵泡生成過(guò)程中卵巢微環(huán)境中ROS升高。進(jìn)而會(huì)危害顆粒細(xì)胞代謝、抗氧化防御體系和卵泡周圍血管化的形成，危及卵子成熟、染色體組成和卵母細(xì)胞發(fā)育能力。伴隨線粒體功能障礙的抗氧化及抗糖基化防御體系下降可能是一個(gè)正反饋環(huán)的驅(qū)動(dòng)力量，該正反饋環(huán)包含氧化應(yīng)激、羥基應(yīng)激和逐漸積聚的AGEs。

卵母細(xì)胞胞漿成熟和減數(shù)分裂能力的恢復(fù)和完成是在卵泡發(fā)育過(guò)程中獲得的，卵泡環(huán)境決定卵子發(fā)育潛能，不適宜的卵泡生長(zhǎng)微環(huán)境是卵母細(xì)胞質(zhì)量改變的重要影響因素。有研究顯示[11-12]，卵泡液ROS水平過(guò)高，可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激，對(duì)卵母細(xì)胞成熟和后續(xù)胚胎發(fā)育造成不良影響，并可能是年齡相關(guān)的卵母細(xì)胞改變的原因之一。生殖細(xì)胞富含不飽和脂肪酸，特別容易受到氧化應(yīng)激損傷。ROS可通過(guò)直接影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子儲(chǔ)存結(jié)構(gòu)，干擾鈣離子動(dòng)態(tài)平衡，引起卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯和降解，繼而發(fā)生調(diào)亡。

Jinno等[13]研究發(fā)現(xiàn)AGEs濃度與取卵日雌激素水平、優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、雙原核（2PN）受精數(shù)、可利用胚胎數(shù)呈負(fù)相關(guān)，AGE濃度大于7.24 U/mL提示低獲卵數(shù)及不好的妊娠結(jié)局，是年齡及卵巢儲(chǔ)備預(yù)測(cè)ART的結(jié)局。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PCOS患者卵泡液內(nèi)sRAGE、VEGF與卵巢儲(chǔ)備能力相關(guān)，兩者相互作用會(huì)影響卵子質(zhì)量；而PCOS患者顆粒細(xì)胞的RAGE mRNA表達(dá)量顯著高于同年齡段的非PCOS患者，且其卵泡液AGEs水平亦有升高趨勢(shì)[14-15]。提示PCOS患者卵巢局部氧化應(yīng)激增加。潘曉琴[16]的研究表明：卵泡液AGEs水平升高可能是卵巢低反應(yīng)發(fā)生的原因之一；卵泡液AGEs水平升高上調(diào)顆粒細(xì)胞RAGE mRNA表達(dá)，推測(cè)AGEs與受體RAGE結(jié)合途徑可能是AGEs對(duì)卵巢功能產(chǎn)生影響的主要途徑。

本研究結(jié)果顯示，優(yōu)胚率較低患者的卵泡液ROS水平較優(yōu)胚率高的患者高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示卵泡液ROS水平過(guò)高，誘發(fā)卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激，可能是卵子質(zhì)量低下及后續(xù)胚胎發(fā)育不良的原因；然而，兩組卵泡液AGEs水平并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而優(yōu)胚率較低的患者，其顆粒細(xì)胞RAGE mRNA水平更高，似乎ROS水平升高并不是AGEs-RAGE結(jié)合途徑造成的，其原因尚不清楚。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[14-15]的不同，可能與研究人群不同有關(guān)，對(duì)于PCOS尤其是伴有胰島素抵抗的患者，存在C反應(yīng)蛋白、sRAGE和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的代謝異常，提示PCOS患者不僅僅存在內(nèi)分泌代謝異常，而且還存在慢性炎癥狀態(tài)，胰島素抵抗可能是導(dǎo)致慢性炎癥的重要機(jī)制，兩者之間互相促進(jìn)發(fā)展形成惡性循環(huán)；而本研究的人群是輸卵管因素的年輕不孕癥患者，盆腔炎癥狀態(tài)可能是引起氧化應(yīng)激的原因，但其作用途徑并不是經(jīng)過(guò)AGEs-RAGE，尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，氧化應(yīng)激狀態(tài)可能是輸卵管因素的年輕不孕癥患者卵子質(zhì)量低下的原因，但AGES-RAGE可能并不是其作用途徑，改善其氧化應(yīng)激狀態(tài)可能有助于提高卵子質(zhì)量，獲得更好的妊娠結(jié)局。

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Relationship between AGEs and oocytes dysplasia of patients with tubal factor infertility

LI Xuemei, LIU Hong, LIN Suiling, ZHANG Huakun, TAN Siyun, CHENG Yanjun
Reproductive Medicine Center, Maternity and Child Healthcare Hospital of Shenzhen Affiliated to Southern Medical University, Shenzhen 518048, China

ObjectiveTo access the effect of advanced glycation end products（AGEs） on oocyte quality and granulosa cell function for patients with tubal factor infertility.MethodsFrom February 2015 to June 2015, 19 IVF patients with tubal factor were enrolled. All patients were ＜35 years old.They were controlled ovarian hyperstimulation (COH) with long-acting long protocol and retrieved ≥8 oocytes. Their follicular fluid and granulosa cells were collected during ovum pick-up (OPU) and cryopreserved at -80 ℃. The patients were devided into 2 groups: Group A of 10 patients with high quality embryo rate ＞35%and group B of 9 patients with high quality embryo rate ＜35%. Follicular fluid AGEs and ROS levels on OPU day were detected by sandwiched ELISA, and the RAGE mRNA expression of granulosa cells were detected by Real-time PCR.ResultsThere were no significant differences of general informations between two groups (P＞0.05). There were significant differences in average numbers of high quality embryos (5.2±2.34vs1.50±1.08,P=0.001) and the high quality embryo rate (60.27±12.48vs21.48±14.02,P=0.000). Follicular fluid ROS levels in 2 groups were significantly different (0.82±0.28vs1.11±0.27 ng/mL,P=0.000). The follicular fluid AGES level in 2 groups were not significantly different (0.33±0.13vs0.35±0.13 μg/mL,P=0.462).ConclusionThe oxidative status may be the reason of oocytes dysplasia in the young patients with tubal factor infertility. But AGES-RAGE probably was not the mechanism.

advanced glycation end products; granulosa cells; follicular fluid; embryo quality

2017-04-02

深圳市醫(yī)療衛(wèi)生類科研項(xiàng)目（201302114）

李雪梅，主任醫(yī)師，E-mail: 842326015@qq.com