精神分裂癥患者絲氨酸消旋酶和D構(gòu)象氨基酸氧化酶的生物信息學(xué)與功能分析

平軍嬌，高永雙，吳 勇，杜寶國(guó)，蔣廷云，錢 剛中山市第三人民醫(yī)院，廣東 中山 58400；遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000

精神分裂癥患者絲氨酸消旋酶和D構(gòu)象氨基酸氧化酶的生物信息學(xué)與功能分析

平軍嬌1，高永雙1，吳 勇1，杜寶國(guó)1，蔣廷云1，錢 剛2
1中山市第三人民醫(yī)院，廣東 中山 528400；2遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000

目的D-ser作為一種重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞遞質(zhì)，其合成與代謝依賴于絲氨酸消旋酶（SR）和D構(gòu)象氨基酸氧化酶（DAO），SR及DAO基因與精神分裂癥密切相關(guān)，本研究目的為闡明精神分裂癥患者SR及DAO結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。方法從精神分裂癥血液中克隆到SR及DAO基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果序列分析結(jié)果表明，SR及DAO基因分別編碼340個(gè)和347個(gè)氨基酸的多肽，與健康人、猿、猴的同源性在96%以上；預(yù)測(cè)SR及DAO蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量分別為36.57 KDa和39.47 KDa，理論等電點(diǎn)分別為6.11和6.36。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SR蛋白主要定位于細(xì)胞的線粒體中，DAO蛋白主要定位于線粒體和過氧化物酶體中，提示此兩種蛋白在細(xì)胞中主要發(fā)揮合成與代謝作用。結(jié)構(gòu)與功能分析發(fā)現(xiàn)，SR蛋白有1個(gè)結(jié)構(gòu)域，DAO蛋白含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)鏈接區(qū)。結(jié)論推測(cè)SR及DAO在真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成與代謝等過程中發(fā)揮重要功能。

精神分裂癥；絲氨酸消旋酶；D構(gòu)象氨基酸氧化酶；結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；序列分析

遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥發(fā)病機(jī)制是體內(nèi)多個(gè)致病基因蓄積的結(jié)果[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究證實(shí)精神分裂癥患者存在基因方面的異常，包括多巴胺D2及D3受體基因、reelin基因、GluR6基因、MTHFR基因、NRG1基因和bdnf基因等。

在哺乳動(dòng)物中存在D型絲氨酸（D-ser）[2]，后來研究發(fā)現(xiàn)包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在區(qū)域性的高濃度D-ser[3-5]。研究表明D-ser具有比甘氨酸更強(qiáng)的的激活效能[6]。絲氨酸消旋酶（SR）能夠?qū)Ｒ恍源呋疞-ser轉(zhuǎn)化為D-ser；DAO存在于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織中，發(fā)揮著促進(jìn)中性D-ser氧化去氨基的作用，這種酶在D-ser的代謝過程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。與正常人相比精神分裂癥、重度抑郁和雙相精神障礙患者額葉皮質(zhì)和海馬區(qū)域的SR分別減少39%和21%，在額葉皮質(zhì)DAO并無變化，而在海馬DAO蛋白明顯增加[9]。精神分裂癥患者腦脊液D-ser水平是降低的。

Miranda等[4]首次在正常人血液中分離到了SR基因，研究發(fā)現(xiàn)SR基因變異與精神分裂癥具有相關(guān)性[10]，隨后也發(fā)現(xiàn)SR基因與精神分裂癥密切相關(guān)[11-14]。西安地區(qū)DAO基因的多態(tài)性與精神分裂癥具有相關(guān)性[15]。在日本人群對(duì)340名正常人和340名精神分裂癥患者采用病例對(duì)照研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAO單體型與精神分裂癥存在關(guān)聯(lián)性[16]。在愛爾蘭人群中的研究也發(fā)現(xiàn)DAO基因與精神分裂癥密切相關(guān)[17]。有關(guān)D-ser的合成與代謝、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布及存儲(chǔ)釋放機(jī)制國(guó)內(nèi)外已有較多報(bào)道，而基因是決定性狀的內(nèi)在因素，目前對(duì)于SR和DAO的研究停留在基因序列水平上，由基因上升至蛋白三維結(jié)構(gòu)的性質(zhì)在國(guó)內(nèi)鮮見報(bào)道。三維結(jié)構(gòu)詳細(xì)信息的缺失，會(huì)阻礙對(duì)該蛋白的功能、催化機(jī)理等的進(jìn)一步研究。使用同源建模和分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法能很好地應(yīng)用于生物大分子的理論模擬，并指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象[18]。因此，本研究克隆出SR及DAO基因，通過利用生物信息學(xué)對(duì)SR及DAO蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)進(jìn)行分析，深入了解SR及DAO在精神分裂癥中所發(fā)揮的功能，為抗精神病藥物的研發(fā)提供分子水平的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集中山市第三人民醫(yī)院門診就診或住院部住院，祖籍中山地區(qū)的精神分裂癥患者入組，入組標(biāo)準(zhǔn)：18～59周歲；性別不限；小學(xué)以上文化程度；有足夠的視聽水平完成研究所需的檢查；符合美國(guó)精神病診斷標(biāo)準(zhǔn)第4版(DSM-Ⅳ)精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；病程小于5年；PANSS量表陽性和陰性癥狀總分評(píng)分≥60分；通過一般體格檢查、神經(jīng)系統(tǒng)檢查和精神檢查；排除標(biāo)準(zhǔn)：現(xiàn)患有嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者、服用精神活性物質(zhì)者、大量吸煙或飲酒者以及孕婦和哺乳期婦女，排除器質(zhì)性精神障礙、癲癇所致精神障礙、抑郁癥、雙相障礙、特應(yīng)性皮炎、腦卒中、阿爾茨海默病及腫瘤患者；自愿參加本項(xiàng)研究并簽署知情同意書。所有入組對(duì)象由我院2名主治級(jí)別以上醫(yī)師共同診斷，對(duì)診斷不確定者不予納入。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集 采集精神分裂癥患者早晨空腹外周靜脈血5 mL以0.5 mol/L的EDTA (pH 8.0) 100 μL抗凝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取基因組DNA 解凍血樣，用全基因組DNA提取試劑盒（OMEGA D3392-01）提取基因組DNA，并用紫外分光光度儀及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及特定基因片段擴(kuò)增 在NCBI網(wǎng)上人類基因庫中對(duì)SR及DAO基因進(jìn)行檢測(cè)找到基因序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物?？偡磻?yīng)體系為20 μL，其中包括Taq DNA聚合酶0.2 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，25 mmol/L的dNTP 0.2 μL，Primer（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)處理5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)在ABI9700 PCR儀上進(jìn)行。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序 用試劑盒（OMEGA D2500-01）回收PCR擴(kuò)增目的條帶，定量后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序反應(yīng)體系為：2 μL Mix（Bigdye3.1、5×sequencing buffer、H2O），2 μL純化后的PCR產(chǎn)物，1 μL引物（5 mmol/L）。測(cè)序反應(yīng)在ABI9700 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。循環(huán)條件為：96 ℃ 2 min后進(jìn)行30個(gè)（95 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃4 min）循環(huán)反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)結(jié)束后將得到的PCR產(chǎn)物用試劑盒（OMEGA 1320-01）進(jìn)行純化，在遺傳分析儀ABI3730xl進(jìn)行測(cè)序，得到的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，確定所擴(kuò)增序列為目的序列。

1.2.5 序列的生物信息學(xué)分析 采用NCBI （www.ncbi.nih.gov）在線分析工具BLAST對(duì)GenBank的非冗余核酸數(shù)據(jù)庫和非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對(duì)分析；采用NCBI（http://www.ncbi.nim.nih.gov/）在線分析工具ORF finder預(yù)測(cè)開放閱讀框；利用Expasy的ProtParam程序統(tǒng)計(jì)SR及DAO蛋白中氨基酸含量、理論相對(duì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)；應(yīng)用ProtScale程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)的疏水性進(jìn)行分析；通過在線工具GOR4對(duì)SR和DAO進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線工具；蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)采用哈佛大學(xué)網(wǎng)上在線工具進(jìn)行預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域用SMART服務(wù)器和InterProScan軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用Profun在線工具預(yù)測(cè)精神分裂癥患者SR及DAO蛋白的功能分類；采用同源模型服務(wù)軟件SWISS-MODEL[9,10]預(yù)測(cè)SR及DAO的三維結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 SR及DAO氨基酸序列分析

通過克隆基因測(cè)序獲得精神分裂癥患者SR及DAO基因的全長(zhǎng)DNA序列，去除載體、內(nèi)含子及冗余序列后通過ORF finder對(duì)目的序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明SR及DAO基因序列全長(zhǎng)分別為1023 bp和1044 bp，分別包含一個(gè)完整的讀碼框，SR編碼含340個(gè)氨基酸殘基的多肽，DAO編碼含347個(gè)氨基酸殘基的多肽，通過NCBI Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩種多肽的氨基酸序列與猿類、猴類、絨類、牛、馬及貓等具有高度同源性，同源性為85%以上。

2.2 SR及DAO理化性質(zhì)分析

利用expasy中的protparam在線軟件對(duì)精神分裂癥患者SR及DAO基因所編碼的340個(gè)氨基酸和347個(gè)氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)結(jié)果為：SR及DAO蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為36.57 kDa和39.47 kDa；理論等電點(diǎn)pI分別為6.11和6.36；原子組成分別為C1630H2632N434O490S13和C1787H2743N491O503S10。

SR蛋白的負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）34個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）31個(gè)；不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）為32.55，表明SR蛋白狀態(tài)穩(wěn)定；DAO蛋白的負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）38個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）34個(gè)；不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）為31.68，表明DAO蛋白狀態(tài)穩(wěn)定；

SR蛋白的疏水性分析結(jié)果表明，其疏水性最大值為4.200，說明該處的疏水性在該多肽中最強(qiáng)，疏水峰值大于0的氨基酸占35%；親水峰最大值為-3.800，整個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出高度的親水性，親水性評(píng)估為-8.99（圖1A）。

DAO蛋白的疏水性分析結(jié)果表明，其疏水性最大值為4.500，說明該處的疏水性在該多肽中最強(qiáng)，疏水峰值大于0的氨基酸占35%；親水峰最大值為-4.500，表現(xiàn)出高度的親水性，親水性評(píng)估為-17.29（圖1B）。

圖1 SR及DAO蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用GOR4方法對(duì)精神分裂癥患者的SR蛋白及DAO蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖2所示，精神分裂癥患者SR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中有32.06%為螺旋結(jié)構(gòu)（Helices），線狀結(jié)構(gòu)（Extended strand）和卷曲結(jié)構(gòu)（Random coil）分別為17.65%和50.29%，螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲是該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分。

圖2 SR蛋白與DAO蛋白的二級(jí)結(jié)果預(yù)測(cè)

DAO蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中有20.17%為螺旋結(jié)構(gòu)（Helices），線狀結(jié)構(gòu)（Extended strand）和卷曲結(jié)構(gòu)（Random coil）分別為22.19%和57.64%。由此表明，線狀結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲是該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分。

2.4 亞細(xì)胞定位及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

通過在線工具PSORT對(duì)精神分裂癥患者SR蛋白和DAO蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示SR蛋白和DAO蛋白主要定位于細(xì)胞的過氧化物酶體和線粒體中。

利用http://www.cbs.dtu.dk/service/SignalP網(wǎng)站對(duì)精神分裂癥患者SR蛋白及DAO蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示SR蛋白不含有信號(hào)肽，DAO蛋白在第16位和17位氨基酸具有最高綜合剪切位點(diǎn)，分值為0.749，由此推斷，SR無跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，DAO含有信號(hào)肽序列。

2.5 結(jié)構(gòu)域、高級(jí)結(jié)構(gòu)分析及其功能預(yù)測(cè)

采用在線軟件interpro進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域初級(jí)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示SR蛋白只含有一個(gè)細(xì)胞氨基酸代謝過程的結(jié)構(gòu)域，DAO蛋白含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)連接區(qū)，分別為D氨基酸代謝過程、氧化還原過程和一個(gè)FAD連接區(qū)。

精神分裂癥患者SR和DAO蛋白功能通過CBS在線Profun軟件進(jìn)行序列分析，其功能分類如表1和表2所示，SR蛋白具有氨基酸生物合成、脂肪酸代謝、轉(zhuǎn)化、輔酶因子的生物合成、能量代謝、中間產(chǎn)物代謝的概率分別為10.174、5.397、3.438、3.203、2.866、1.520，酶蛋白和膜蛋白預(yù)測(cè)值為2.248和0.499，表明該蛋白為酶蛋白，在酶類分級(jí)中，異構(gòu)酶和裂解酶的可能性最大，為1.711和1.549。

表1 SR蛋白功能預(yù)測(cè)結(jié)果

表2 DAO蛋白功能預(yù)測(cè)結(jié)果

DAO蛋白具有氨基酸生物合成、細(xì)胞膜、中間產(chǎn)物代謝、脂肪酸代謝、輔酶因子的生物合成、能量代謝的概率分別為8.432、5.466、5.407、3.789和3.525，酶蛋白和膜蛋白預(yù)測(cè)值為2.787和0.283，表明該蛋白為酶蛋白，在酶類分級(jí)中，裂解酶和氧化還原酶的可能性最大，為1.640和0.964。

采用同源模型服務(wù)軟件SWISS-MODEL預(yù)測(cè)精神分裂癥患者的SR及DAO蛋白三維結(jié)構(gòu)，如圖3所示，SR蛋白包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域，DAO蛋白包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域及一個(gè)連接區(qū)。無規(guī)則卷曲是構(gòu)成SR蛋白和DAO蛋白的主要結(jié)構(gòu)，圖3也能看出無規(guī)則卷曲占據(jù)了較大面積。

圖3 SR和DAO蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型

3 討論

精神分裂癥是一種多基因遺傳疾病，其發(fā)生發(fā)展可能有多基因和多因素共同起作用，在不同的家系中可能有不同的易感性位點(diǎn)[19]。大量研究表明D型絲氨酸具有比甘氨酸更強(qiáng)的激活效能，由于NMDA受體機(jī)能障礙被認(rèn)為是精神分裂癥發(fā)生的病理生理因素，所以最近有大量研究轉(zhuǎn)移到D型絲氨酸方面，研究發(fā)現(xiàn)D型絲氨酸的水平異常或者參與D型絲氨酸合成代謝的酶基因異常均與精神分裂癥有關(guān)[7]。D型絲氨酸的合成與代謝依賴于SR和DAO，本研究通過克隆有精神分裂癥家族史的精神分裂癥患者發(fā)現(xiàn)，患者的SR和DAO基因與健康人的SR和DAO基因同源性為100%，表明這兩個(gè)基因是否異常不是引起精神分裂癥的直接因素。在2014年精神基因組學(xué)聯(lián)盟精神分裂癥工作小組通過對(duì)15萬名志愿者的基因組進(jìn)行分析，通過目前成熟的先進(jìn)技術(shù)發(fā)現(xiàn)在人類基因組中，有108遺傳區(qū)域與精神分裂癥有關(guān)[20]，而這108個(gè)遺傳區(qū)域里不含有SR和DAO基因，這與本研究結(jié)果一致。

亞細(xì)胞定位的分析結(jié)果表明，精神分裂癥患者的SR和DAO蛋白主要定位于細(xì)胞的線粒體和過氧化物酶體中，線粒體是能量轉(zhuǎn)化、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的場(chǎng)所，這也正符合SR和DAO發(fā)揮消旋酶和氧化酶作用的特征。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SR蛋白包含1個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，DAO蛋白包含2個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域及一個(gè)連接區(qū)，氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在SR和DAO蛋白為兩個(gè)高度保守的序列，這在不同物種之間的同源性較高，推測(cè)不同物種之間SR和DAO發(fā)揮的功能是一致的。

在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，SR和DAO蛋白的結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占的比例較大，分別為50.29%和57.64%，無規(guī)則卷曲受側(cè)鏈相互作用影響較大，經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位和其他蛋白質(zhì)特異功能部位的中央環(huán)，發(fā)揮重要作用，推測(cè)此部位是SR和DAO蛋白發(fā)揮絲氨酸消旋酶和氧化酶的重要部位。

精神分裂癥是一種嚴(yán)重的精神疾病，對(duì)其個(gè)人、家庭及社會(huì)的危害性極大?；蚴怯绊懠膊“l(fā)生的內(nèi)在因素，目前對(duì)精神分裂癥易感基因的研究較多，但對(duì)于精神分裂癥SR及DAO氨基酸突變位點(diǎn)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的研究少見報(bào)道，因此由基因上升到結(jié)構(gòu)蛋白的性質(zhì)研究為明確精神分裂癥SR及DAO的性質(zhì)與突變位點(diǎn)顯的尤為重要。

本課題通過生物信息學(xué)軟件對(duì)SR及DAO進(jìn)行分析并構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)，深入了解SR及DAO在精神分裂癥中所發(fā)揮的功能，為抗精神病藥物的研發(fā)提供分子水平的理論依據(jù)。

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Bioinformatics and function of SR and DAO in schizophrenia

PING Junjiao1, GAO Yongshuang1, WU Yong1, DU Baoguo1, JIANG Tingyun1, QIAN Gang21Zhongshan Third People’s hospital, Zhongshan 528400, China;2Department of Cell Biology and Genetics, Zunyi Medical College, Zunyi 563099, China

ObjectiveTo explore the relationship between structure and function of SR and DAO in schizophrenia.MethodsSR and DAO gene were cloned from blood of patients with schizophrenia with bioinformatics analysis.ResultsThe SR and DAO genes encoded 340 and 347 amino acids, respectively. It had more than 96% homology with healthy humans, apes and monkeys. The relative molecular mass of SR and DAO proteins were predicted to be 36.57 KDa and 39.47 KDa, respectively.The isoelectric point were 6.11 and 6.36. SR distribution was involved in chondriosome. DAO distribution was involved in chondriosome and peroxysome. It indicated that SR and DAO played a mayor role in synthesis and metabolism of cells.Threedimensional measurement revealed that SR protein was composed of a structural domains and DAO protein was composed of two structural domains and one link region.ConclutionSR and DAO can promote protein synthesis and metabolism in eukaryotic cells.

schizophrenia; SR; DAO; structure prediction; sequence analysis

2017-05-12

廣東省中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A1FC070）

平軍嬌，碩士研究生，主管檢驗(yàn)師，E-mail：pingjunjiao@126.com